商品酶Cellulase A “Amano”3處理提升葵花籽蛋白色澤和功能性質

胡夢姣，呂冠薇，唐辛悅，楊瑞金,3，華霄,3，趙偉,3，張文斌,3*

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫,214122) 2(長春醫學高等?？茖W校，吉林 長春,130031) 3(江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫,214122)

商品酶CellulaseA“Amano”3處理提升葵花籽蛋白色澤和功能性質

胡夢姣1，呂冠薇2，唐辛悅1，楊瑞金1,3，華霄1,3，趙偉1,3，張文斌1,3*

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫,214122) 2(長春醫學高等專科學校，吉林 長春,130031) 3(江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫,214122)

為消除綠原酸對葵花籽蛋白在食品應用中的限制作用，以脫殼葵仁為原料，微酸浸提預先脫除葵仁中部分綠原酸，水媒法提取葵花籽油和蛋白質的同時，添加含綠原酸水解酶活力(3.31 U/g)的商品酶水解殘余綠原酸，冷凍干燥得完全脫除綠原酸的葵花籽蛋白質。結果顯示，微酸浸提可脫除約76%的綠原酸，酶處理后總脫除率達99.6%。經脫酚和酶處理的葵花籽蛋白色澤明顯改善，亮度值L*和紅值a*由47.1、-7.4提高至70.3、3.3，持水持油性、乳化穩定性顯著提高，溶解性由59.0%提升至87.0%。電泳分析，葵花籽蛋白分子質量集中于10～50 kDa，酶處理后分子質量為34.1 kDa的蛋白條帶有一定降解。含綠原酸水解酶活力的商品酶可以完全水解葵仁中殘留綠原酸，結合水媒法提油技術制備得到的葵花籽蛋白質具良好的色澤和功能特性，為提取優質葵花籽蛋白質提供了新方法。

葵花籽仁；綠原酸；綠原酸水解酶；水媒法

葵花籽是我國主要的油料作物之一，目前全球產量達4 200萬t[1]。葵花籽中含有40%～60%的油脂和20%～31%的蛋白質[2-3]?？ㄗ训鞍资且环N高營養價值的優質蛋白，氨基酸結構均衡。綠原酸是葵花籽中最主要的多酚類物質，一般含量為1.0%～4.5%[4]，具有良好抗氧化活性。但在葵花籽蛋白的提取過程中，綠原酸極易氧化成醌，與蛋白質的極性基團、氨基和亞甲基等基團共價結合，使其成為非反芻動物和家禽無法消化的非營養性物質[5-7]。同時，這一變化也使葵花蛋白質變成消費者難以接受的深綠色。因此，當前富含葵花籽蛋白的葵粕原料只能作為飼料，造成了優質植物蛋白資源的浪費。目前，較常使用的葵花籽蛋白質提取工藝有堿提酸沉、鹽溶酸沉和水提醇沉等，其中附依的綠原酸脫除方法主要為熱水浸提、有機試劑浸提、超聲波輔助提取、膜分離和微波回流輔助法等[3,8]。但綠原酸難以脫除完全，據文獻報道，在優化條件下，綠原酸脫除率最高達75%～95%[9]。殘余綠原酸仍對葵花籽蛋白有所影響。

水媒法提油技術從20世紀50年代開始蓬勃發展，如今已全面發展出水代法、水酶法和乙醇水提法等多種制油技術。水媒法提油技術提取介質安全無污染，提取條件溫和，食用油產品更加營養安全健康[10]。本實驗室已完成大量關于水媒法提取葵花籽油、玉米胚芽油、花生油和油茶籽油的工藝研究[11-14]，花生油水酶法和油茶籽油乙醇水提法已實現產業化。由于葵花籽蛋白與綠原酸之間的特殊限制作用，對水媒法提葵花籽油過程中的水相葵花籽蛋白的提取研究還未取得明顯進展，實驗室前期已探索出微酸熱浸提脫除葵仁中大部分綠原酸的工藝方法，但仍未達到預期效果。

綠原酸水解酶是一種作用于咖啡酸與奎寧酸之間酯鍵的特異性水解酶，可催化水解綠原酸。采用綠原酸水解酶處理水解綠原酸，將得到基本脫除綠原酸的葵花籽蛋白質，實現水媒法同步提取葵花籽油和優質水相蛋白。綠原酸水解酶現有產生菌多為黑曲霉[15-16]，但綠原酸水解酶尚未商業化，故本研究擬以黑曲霉為生產菌株制得的具綠原酸水解酶雜酶活力的商品酶Cellulase A “Amano”3為研究對象，開展酶法脫除綠原酸制備葵花籽蛋白質的研究，為開發水媒法提取水相葵花籽蛋白工藝提供一條有效途徑。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

實驗材料：市售脫殼葵花籽仁，產于內蒙古五原縣(其中脂肪含量60.32%，蛋白質16.52%，碳水化合物13.31%)；大豆分離蛋白(蛋白質含量85%)，商品酶Cellulase A “Amano”3(綠原酸水解酶活力3.31 U/g)，日本天野酶制劑株式會社；綠原酸及咖啡酸標準品(純度≥ 95%，Sigma)，大豆油(金龍魚有限公司)，試驗所用化學試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

實驗儀器：高效液相色譜儀(Alliance 2695型，配2998型PDA紫外檢測器)，美國Waters公司；中藥粉碎機(200A)，溫嶺市林大機械股份公司；超級恒溫循環槽(MP-501A)，上海一恒科技有限公司；自動定氮儀(KDF-103F)，上海纖檢儀器有限公司；pH計(FE20型)，梅特勒-托利多儀器有限公司，臺式離心機(CXW-1)，上海天美生化有限公司；高速分散器(T50)，德國IKA公司；色度儀(TES-135A)，泰仕電子工業股份有限公司；垂直電泳槽(MIN-Protein3)，美國伯樂公司。

1.2實驗方法

1.2.1 葵花籽蛋白質制備工藝

按圖1所示流程圖制備不同葵花籽蛋白質。為考察綠原酸等酚類對葵花籽蛋白粉的影響，工藝中脫酚和商品酶處理2個工序被選擇性棄除，以獲得不同的蛋白粉。

圖1 葵花籽蛋白制備工藝(虛線標注的為可選工序)Fig.1 The process for preparation of sunflower seed protein (units in dashed line box are optional)

各工序的具體參數如下。

脫酚：取1 kg葵花籽仁與0.001 mol/L HCl溶液以料水比1∶5(g∶mL)，90 ℃攪拌浸提1 h。50目分樣篩過濾浸提液，相同條件重復浸提2次。

烘干與粉碎：將得到的脫酚葵花籽仁于60 ℃烘箱中烘干4 h，粉碎備用。

商品酶處理：取粉碎后葵仁200 g，以1∶5(g∶mL)料水比加入1 000 mL去離子水，升溫至50 ℃后用1 mol/L HCl 調節體系pH 6.5。以綠原酸水解酶活力/原料：0.3 U/g的比例加入商品酶，反應5 h。

水代法提油：酶解結束后升溫至70 ℃，用5 mol/L NaOH調節體系pH至9.0，反應1 h，5 000 r/min離心15 min即得上層油相、中層水相和下層渣相。蛋白多分布于中層水相中。

水相葵花籽蛋白酸沉：用1 mol/L HCl調節水相至等電點pH 4.5，4 ℃靜置酸沉1 h，5 000 r/min離心15 min，倒去上清液，沉淀為葵花籽蛋白。

復溶凍干：加入適量去離子水將沉淀復溶，用2.5 mol/L NaOH調節蛋白溶液pH至7.0。冷凍干燥即得不同葵花籽蛋白粉，其中既未做脫酚處理又未做商品酶處理的樣品記為SSP(sunflower seed protein)，僅做脫酚處理的樣品記為DSSP(dephenolized sunflower seed protein)，同時經微酸脫酚和商品酶處理的樣品記為EDSSP(enzyme-treated dephenolized sunflower seed protein)。

1.2.2 葵花籽蛋白樣品中綠原酸殘余量的測定

準確稱取0.2 g葵花籽蛋白樣品于濾紙筒，采用索氏提取器用無水甲醇70 ℃下抽提回流10 h。小心倒出甲醇浸提液，定容至100 mL。取1 mL浸提液，10 000 r/min離心15 min后，經0.22 μm微孔濾膜過濾進樣至HPLC。綠原酸標準曲線繪制，以峰面積為縱坐標，綠原酸質量濃度為橫坐標，標準曲線方程為y=(1.292x+0.297)×104(R2=0.997 0)。測定并計算葵花籽蛋白樣品中綠原酸殘余量

高效液相色譜條件：Waters Xbrige C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)色譜柱；流動相為乙腈∶2%冰醋酸溶液= 15∶85(體積比)；流速0.5 mL/min；檢測波長327 nm(PDA檢測波長210～400 nm)；進樣量10 μL[17]。

1.2.3 商品酶中綠原酸水解酶活力測定

稱取1 g商品酶粉末，用磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 6.5)稀釋定容至100 mL制成酶液。參考NIETER等[16]的方法測定商品酶中綠原酸水解酶活力，酶反應體系：650 μL底物溶液(1 mg/mL綠原酸水溶液)+250 μL酶液+100 μL磷酸鹽緩沖液。50 ℃反應15 min加入1 mL甲醇終止反應，10 000 r/min離心15 min，經0.22 μm微孔濾膜后進樣至HPLC測定，色譜條件同上。商品酶中綠原酸水解酶酶活力單位定義為：在特定條件下每分鐘水解釋放1 μmol咖啡酸所需的酶量。

1.2.4 蛋白樣品色澤測定

采用色度儀測定，每個樣品重復測定8次。

1.2.5 蛋白樣品相關性質測定

(1)蛋白含量測定:參考凱氏定氮法GB/T 5009.5—2010，蛋白質換算系數為5.30[18]。

(2)溶解性的測定:參考STEPHANIE等的方法并稍作修改[19]。準確稱取0.2 g蛋白樣品溶于20 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L pH7.0)，攪拌溶解30 min，4 000 r/min離心15 min。采用半微量凱氏定氮法測定樣品和上清液中蛋白含量。

(1)

(3)持水性和持油性的測定：參考MADHUSUDHAN等的方法并稍作修改[20]。準確稱取0.2 g蛋白樣品于10 mL離心管，加入8 mL去離子水/大豆油，記質量為G1，振蕩2 min，6 000 r/min離心15 min，倒出上層清液并稱重離心管記G2。持水性/持油性用100 g蛋白所能吸附水/油脂的質量表示：

(2)

(4)乳化性和乳化穩定性的測定：參考PEARCE和KINSELLA的方法，略作修改[21]。取0.1 g蛋白樣品溶于25 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/l pH 7.0)，加入10 mL大豆油，以13 500 r/min轉速快速攪打1 min。立即吸取底部乳狀液100 μL用1 g/L SDS稀釋定容至10 mL，測定稀釋樣品在500 nm處的吸光值A0。將乳化后樣品于30 ℃保溫60 min，取乳狀液100 μL按上述方法稀釋測定此時稀釋液吸光值，記A60。蛋白樣品乳化性(Emulsion Ability，EA)以乳化活力指數(EAI，m2/g)表示：

(3)

式中：T,2.303；DF，稀釋倍數；C，蛋白質質量濃度，g/mL；φ，乳狀液中油相所占的比例，為0.286。

乳化穩定性(ES，min)用乳化穩定指數(ESI，單位為1)表示：

(4)

1.2.6 蛋白樣品電泳分析

對葵花籽蛋白樣品進行SDS-PAGE分析。配置分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。80 V恒壓電泳1～2 h后，用考馬斯亮藍染液染色30 min，再于洗脫液中過夜洗脫，即可看到清晰的電泳藍色條帶。將得到的電泳通過凝膠成像分析軟件Image Lab3.0進行條帶分析。

1.3數據統計與分析

未加說明的實驗均重復3次，計算平均值M和標準偏差SD，結果以M±SD形式表示。采用SPSS19.0、Origin8.6等軟件進行數據處理和作圖，采用Duncan多重比較法進行差異顯著性分析(p<0.05)。

2 結果與討論

2.1商品酶處理對葵花籽中綠原酸的降解效果

不同葵花籽蛋白樣品的綠原酸殘留量及液相檢測圖如表1和圖2所示。經過微酸浸提脫酚處理，脫除了葵花籽仁中的大部分綠原酸，并伴有少量咖啡酸產生，DSSP中綠原酸含量僅為SSP的23.9%。經商品酶處理后，EDSSP中無綠原酸檢出，基本完全被酶解脫除，達到除去葵花籽蛋白質中綠原酸的目的。

表1 不同處理得葵花籽蛋白中綠原酸殘余量

(a)綠原酸(RT=8.468min)和咖啡酸(RT=12.400min)標準品；(b)SSP；(c)DSSP；(d)EDSSP圖2 HPLC檢測不同處理的葵花籽蛋白中綠原酸殘留Fig.2 HPLC determination of the residual cholorogenic acid in different sunflower seed proteins

2.2商品酶處理對葵花籽蛋白色澤變化的影響

不同處理所得葵花籽蛋白色澤差異較大，SFP中綠原酸含量較高呈深綠色，DSSP呈淺綠色，而EDSSP綠色消失呈淺棕色。色差分析結果顯示，EDSSPa*值大于零(表2)，其他2種蛋白a*值均為負，同時b*值顯著高于其他2種蛋白。脫酚處理提高了葵花籽蛋白的亮度，EDSSP和DSSP的L*值分別為71.87和70.25，均顯著高于SSP的47.13。

表2 不同處理所得葵花籽蛋白的色度

綠原酸在蛋白質提取過程中發生氧化作用與蛋白結合共價結合，葵花籽蛋白呈現消費者難以接受的深綠色，阻礙葵花籽蛋白進一步開發利用。表2結果表明葵花籽蛋白色澤變化與綠原酸含量呈正相關，微酸脫酚處理脫除葵仁中大部分綠原酸，有少量殘留，因此呈淺綠色。而商品酶具有的水解綠原酸雜酶活力將葵仁中綠原酸完全水解產生咖啡酸，蛋白質不再為綠色，大大提升了葵花籽蛋白質色澤。

2.3脫酚及商品酶處理對葵花籽蛋白功能性質的影響

蛋白質是食品加工中的重要配料，對食品品質的影響較大。蛋白質的許多功能特性與溶解度有關，如增稠、起泡、乳化和凝膠作用[22]。中性條件下，蛋白質的溶解性通常是其制備加工過程中首需測定的性質。而持水持油性則是蛋白質應用于肉制品、蛋糕、冰激凌和面包等食品加工過程中的重要考量指標。另外，在油水體系中，蛋白質與脂類的相互作用有利于食品體系的分散及乳濁液的穩定。因此，乳化性質也是蛋白質在食品加工過程中重要功能特征之一。

表3 不同處理所得葵花籽蛋白的溶解性

pH 7.0條件下不同處理所得蛋白質的溶解性差異顯著?？ㄗ训鞍踪|溶解性高于大豆蛋白(BR級大豆蛋白，未改性處理)。SSP比其他2種脫酚蛋白的溶解性低。EDSSP溶解性最高為87.0%。一方面，微酸脫酚過程中熱處理可能使蛋白發生了熱聚集，大分子蛋白在堿提時部分沉積于渣相，提取出更多小分子易溶解的蛋白，從而使溶解性上升。另一方面，商品酶處理基本脫除葵花籽中綠原酸，醌-蛋白質共價結合體生成量減少，從而提高蛋白質的溶解性。

由圖3可見，大豆蛋白持水能力極強為10.5 g/g，而持油能力差僅為1.91 g/g。與大豆蛋白相比，葵花籽蛋白持水持油能力較均衡，持油能力高于大豆蛋白，持水能力低于大豆蛋白。SSP持水性為3.51 g/g，持油性為3.20 g/g，脫酚處理后的2種葵花籽蛋白的持水持油能力顯著提升。DSSP持水性為5.08 g/g，稍高于EDSSP 4.68 g/g，但兩者間差異不顯著。脫酚浸提過程中，熱處理使葵花籽蛋白質三級結構展開，肽鏈間空隙變大，溶脹度提高，同時疏水性殘基更多地暴露于蛋白分子表面，從而使蛋白持水持油能力提高。

圖3 不同處理所得葵花籽蛋白的持水性和持油性Fig.3 The water and oil binding capacity of different sunflower seed proteins

不同蛋白質樣品的乳化活性及乳化穩定性如圖4所示。葵花籽蛋白的乳化活性均顯著優于大豆蛋白，其中SSP乳化活性最高為134 m2/g，DSSP和EDSSP乳化活性稍有降低，兩者差異不顯著，分別為124 m2/g 和119 m2/g。可能是由于熱處理產生了可溶性聚集體，蛋白質分子柔順性降低，影響蛋白質向油水界面間的移動及分子重排[23]，從而使乳化活性有所降低。大豆分離蛋白乳化活性為98.40 m2/g。從乳化穩定性來看，EDSSP乳化穩定性顯著提高至114.29，可能由于商品酶對葵花籽蛋白存在一定程度的水解，降低了分子體積，乳狀液液珠間的吸引作用小于排斥作用，不易聚結[24]，所以乳狀液較為穩定。

圖4 不同處理所得葵花籽蛋白的乳化性及乳化穩定性Fig.4 The emulsion ability and stability of different sunflower seed proteins

2.4不同處理得葵花籽蛋白SDS-PAGE分析

圖5為不同處理得葵花籽蛋白及大豆蛋白SDS-PAGE電泳結果。不同處理所得葵花籽蛋白電泳譜帶基本相同，利用Image Lab3.0軟件分析，主要包括52.6、49.6、34.1、28.6、20.9、19.4和10.4 kDa等多條蛋白條帶，不同相對分子量處蛋白含量分布有所差異。50～250 kDa相對分子量范圍內，SSP含量明顯高于其他2種不同程度脫酚的葵花籽蛋白?？赡苡捎跓峤徇^程中，葵花籽蛋白中的大分子量蛋白被降解，或熱變性后聚集在渣相中未提出。

1-Marker；2-SFP；3-ASFP；4-ESFP；5-SPI圖5 不同處理所得葵花籽蛋白的SDS-PAGE蛋白電泳Fig.5 SDS-PAGE analysis of different sunflower seed proteins

經商品酶處理后的葵花籽蛋白，大分子量范圍內蛋白條帶顏色變淺，10～37 kDa相對分子量范圍內更均勻分布。與SSP和DSSP相比，EDSSF泳道中52.6 kDa條帶消失，34.1 kDa條帶變淺，29.2～21.4 kDa附近新增較多條帶，15 kDa以下條帶加深。這可能是因為商品酶處理過程中不僅水解綠原酸，消除了其與蛋白的共價結合，同時商品酶對葵花籽蛋白產生了一定程度的水解作用，在電泳圖中明顯表示為小分子量蛋白條帶增多。這也合理解釋了EDSSP溶解性優于DSSP，更優于SSP。大豆蛋白中蛋白分布差異較大，大分子蛋白質含量高， 溶解性比葵花籽蛋白差。

3 結論

以脫殼葵花籽為原料，結合水媒法提油技術，經過微酸脫酚和商品酶處理制得完全脫除綠原酸的葵花籽蛋白質，色澤良好、亮度高，解決長期以來葵花籽蛋白顏色深綠這一人們難以接受的的困擾。商品酶處理后的葵花籽蛋白質溶解度明顯提高，達到87%，優于未脫酚葵花籽蛋白、微酸脫酚葵花籽蛋白和大豆蛋白。與未脫酚葵花籽蛋白相比，商品酶處理后的葵花籽蛋白持水性、持油性和乳化性能等功能特性有所提升。SDS-PAGE電泳圖譜結果顯示，葵花籽蛋白相對分子質量多集中在10～50 kDa，與未脫酚蛋白相比，商品酶處理后葵花籽蛋白質大分子蛋白有所降解，其他基本保持一致。雖然商品酶中綠原酸水解酶活力相對含量低，但對脫除葵仁中綠原酸作用顯著。該研究為后期開展酶法脫除綠原酸、水媒法提取優質葵花籽蛋白質資源提供了有效探索途徑。

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ColorchangeandfunctionalityimprovementofsunflowerseedproteinundertreatmentofacommercialcellulasepreparationCellulaseA“Amano”3

HU Meng-jiao1,LYU Guan-wei2,TANG Xin-yue1,YANG Rui-jin1,3, HUA Xiao1,3,ZHAO Wei1,3,ZHANG Wen-bin1,3*

1(School of Food Science and Technology,Jiangnan Uninversity,Wuxi 214122,China) 2(Changchun Medical College,Changchun 130031,China) 3(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Browning of sunflower seed protein caused by cholorogenic acid (CGA) oxidation limited its usage in food and beverage to great extent. Meanwhile, the solubility, water/oil absorption capacity, emulsification properties also need to be improved for better application. In this study, sunflower seed was submitted to mild acid incubation for CGA removal. The dephenolized seed was then dried, ground, and treated with a commercial cellulase preparation containing CGA hydrolase activity (3.31 U/g) before aqueous extraction of oil and protein. The protein recovered from aqueous phase was freeze-dried for functionality evaluation. It was found that mild acid soaking extracted about 76% CGA and the following enzyme treatment hydrolyzed remained CGA, achieving 99.6% CGA removal in total. The L*, a*values of sunflower seed protein (SSP) varied from 47.1, -7.4 to 70.3, 3.3 for enzyme-treated dephenolized sunflower seed protein (EDSSP). This showed great color improvement with both dephenolization and enzyme treatment. The solubility of SSP (59.0%) increased to 87.0% for EDSSP. Meanwhile, both water and oil absorption capacity showed significant increase. However, though emulsion stability of EDSSP and DSSP was superior to that of SSP, the emulsion activity was lowered significantly. SDS-PAGE analysis showed that the 37 kDa subunit has undergone certain degradation after enzyme treatment, which was consistent with its functionality change. In conclusion, the commercial cellulase containing CGA hydrolase activity could significantly lower remained CGA in sunflower seed. The obtained seed was a good source for aqueous extraction of sunflower seed oil and protein. The improvement of color and functionality would extend its application greatly.

sunflower seed; cholorogenic acid (CGA); chologenic acid hydrolase; aqueous extraction process

碩士研究生(張文斌副教授為通訊作者,E-mail:wbzhang@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學基金(31401635)；國家高技術研究發展計劃(863計劃)(2013AA102104-2)

2017-03-14，改回日期：2017-03-27

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014307