櫛孔扇貝(Chlamys farreri)閉殼肌分離蛋白的糖基化特性

姜夢云,劉俊榮,周晏琳,張晴,劉慧慧,田元勇

(大連海洋大學 食品科學與工程學院，遼寧 大連，116023)

櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)閉殼肌分離蛋白的糖基化特性

姜夢云,劉俊榮*,周晏琳,張晴,劉慧慧,田元勇

(大連海洋大學 食品科學與工程學院，遼寧 大連，116023)

為探索海洋無脊椎動物肌肉分離蛋白的功能特性，以櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)為研究對象，針對其閉殼肌分離蛋白的糖基化特性開展研究。首先，將原料肌肉蛋白進行酸溶分離得到酸溶蛋白(ACSP)，再于等電點回收得到分離蛋白(ACPP)；將酸溶蛋白和分離蛋白分別進行糖基化處理；考察了葡萄糖、乳糖和葡聚糖等3種還原糖的糖基化效果，以及溫度(40、50、60 ℃)、蛋白/糖質量比(1∶3、1∶5、1∶7)和酸溶蛋白的pH(3、5、7) 等3個反應參數，并以賴氨酸、果糖胺及吸光度為反應指標。研究結果發現，以分離蛋白(ACPP)為蛋白底物時，葡萄糖的糖基化效果最明顯，該處理組的賴氨酸減少了43.09%，果糖胺增加1.41 mmol/L；較高的溫度會促進糖基化反應，60℃處理組結果顯示，賴氨酸減少46.95%，果糖胺增加1.41 mmol/L；不同糖濃度的效果差異不大，3種糖濃度處理組的賴氨酸減少46.95%～55.38%，果糖胺增加1.14～1.42 mmol/L。直接作為底物的酸溶蛋白(ACSP)則無糖基化效果，當調節酸溶蛋白(ACSP)pH至中性時，其糖基化功能得以顯現，此時賴氨酸減少48.89%，果糖胺增加1.49 mmol/L。表明糖基化是櫛孔扇貝分離蛋白的有效改性手段。

櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)；閉殼肌；分離蛋白；糖基化

自1999年HULTIN將蛋白分離原理用于分離魚蛋白制備以來[1]，國外陸續將其用于魚類加工副產物蛋白回收以提高魚片產量，還有將分離魚蛋白用作油炸食品的涂層以達到減油效果，以及制備具有功能性的蛋白肽等[2-3]。目前為止，分離魚蛋白的研究大多局限在水產脊椎動物即經濟魚類，針對無脊椎動物如牡蠣[4]、南極磷蝦[5]和扇貝[6]等的研究較少，且以扇貝為對象的研究重點普遍圍繞分離蛋白的提取方法。

分離魚蛋白具有少脂、無色及無腥臭等諸多優點。制備過程經歷了極端pH調節，肌球蛋白結構發生改變導致分離產物功能性下降，進一步通過改性調節以提高分離魚蛋白的功能特性。糖基化是最常見的蛋白質改性手段。大部分糖基化的研究主要集中在植物蛋白和乳蛋白，如大豆、豌豆、大麥、酪蛋白及乳清蛋白等。針對經濟水產動物蛋白的糖基化研究主要圍繞肌原纖維蛋白或酶解蛋白開展，例如日本SAEKI[7-10]團隊，他們選用過鯉魚、扇貝和三文魚等肌原纖維蛋白；我國羅永康[11-12]團隊，主要以鰱魚肌原纖維為研究對象；DECOURCELLE等[13]以蝦酶解物為原料；LIU等[14]利用鰹魚酶解物來進行研究；王軍[15]等利用金帶細鲹酶解物為原料；另有WAHYUNI[16]選用黑皮旗魚的水溶蛋白作為研究對象。而對分離魚蛋白糖基化特性的研究未見系統報道。

本文以經濟貝類——櫛孔扇貝為研究對象，研究了其分離蛋白的糖基化改性機制。

1 材料與方法

1.1材料

活櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)，采購于大連長興市場，室溫下運輸，30 min內運輸到實驗室，殼長(6±0.3) cm。糖化血清蛋白(GSP)測試盒，購于南京建成生物工程研究所；透析袋MD34，購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 分離蛋白制備

取切碎的閉殼肌200 g與800 mL蒸餾水混合，10 000 g下均質90 s，用3 mol/L HCl調pH值至2，冰水浴下攪拌30 min，10 000 g下離心15 min，所得上清為酸溶蛋白(acid soluble protein ，ACSP)；將ACSP用2 mol/L NaOH調pH值至5，10 000 g下離心15 min，所得沉淀為分離蛋白(acid protein precipitation，ACPP)，準確稱量ACPP質量，與4倍體積蒸餾水混合，10 000 g下均質90 s，用2 mol/L NaOH調pH值至7。使用雙縮脲法測定ACSP和ACPP蛋白濃度。

1.2.2 糖基化

反應體系內蛋白濃度為12 mg/mL。按照表1和表2制備糖基化底物，其中每種樣品分裝成15 mL小樣若干，-40 ℃冷凍12 h，冷凍干燥3 d，然后按照表1和表2溫度進行糖基化反應。其中反應濕度為65%，反應0、2、4、6 h后，將樣品立即置于冰水浴中冷卻降溫，與15 mL蒸餾水混合，7 000 g下均質30 s，用NaOH調pH值至7，即為糖基化產物。

表1 酸溶蛋白(ACSP)糖基化處理條件

表2 分離蛋白(ASPP)糖基化處理條件

1.2.3 指標測定

(1)賴氨酸含量。將糖基化產物在4 000 g離心15 min，取上清進行分析。按照GOODNO[17]等方法進行測定。160 mg OPA用4 mL體積分數95%乙醇溶解；2 g SDS用10 mL蒸餾水溶解；38.1 g硼砂用蒸餾水溶解后，用NaOH調pH=9.5，加水定容至1 L；將2 mL OPA、5 mL SDS、50 mL硼砂及0.2 mL 巰基乙醇用水定容至100 mL，即為OPA試劑，當天使用。賴氨酸制作標準曲線。50 μL樣液與2 mL OPA試劑混合，靜置2 min，340 nm下測吸光度。

(2)果糖胺含量。將糖基化產物在4 000 g離心15 min，將上清透析24 h后進行分析。按照試劑盒方法測定。50 μL樣液與1 mL試劑混合，37 ℃水浴加熱15 min，室溫下冷卻，530 nm下測吸光度。

(3)吸光度測定。將糖基化產物在4 000 g離心15 min，取上清進行分析。0.2 mL樣液與1 mL 0.1% SDS混勻，420 nm下測吸光度。

(4)溶解性。將糖基化產物在4 000 g離心15 min，取上清進行分析。用考馬斯亮藍法[18]測蛋白濃度。

1.3統計分析

所有試驗均進行了3次重復實驗，數據以平均值表示，用Excel 2007軟件進行分析處理。

2 結果與討論

2.1閉殼肌分離蛋白(ACPP)的糖基化性能

2.1.1 溫度對分離蛋白糖基化性能的影響

圖1為ACPP在不同糖基化溫度下的反應特性。從中可以觀察到，ACPP可以發生糖基化，且溫度越高，糖基化反應越劇烈。其中，與對照組相比(N-40 ℃、N-50 ℃、N-60 ℃)，加糖組(5G-40 ℃、5G-50 ℃、5G-60 ℃)的賴氨酸均呈明顯下降趨勢，反應6 h后，各組分別下降了21.57%、31.86%和46.95%，這是因為蛋白底物當中的賴氨酸的ε-氨基最易與糖結合，發生糖基化反應后含量下降。果糖胺是蛋白質和糖聚合物的重排產物[19]，會隨著反應的進行而逐漸升高，加糖組反應6h后40、50和60 ℃分別增加了0.21、0.86和1.41 mmol/L。溶解性會隨著反應的進行而下降，這是由于熱變性引起的，3種溫度處理組的溶解性無顯著差異。此外，3種溫度處理組的吸光度也無顯著變化(0.008～0.014)。而對照組的各項指標均無顯著變化，其中40、50、60 ℃處理組賴氨酸分別減少了0、8.54%和4.56%，果糖胺分別增加了0、0.06和0 mmol/L。由此可見，升高溫度對分離蛋白糖基化有促進作用。研究表明，溫度對于肌原纖維蛋白的糖基化也有相同影響效果，例如FUJIWARA[7]利用葡聚糖對鯉魚肌原纖維蛋白進行糖基化處理，在40～60 ℃內，溫度的提升對糖基化效果有促進作用；同樣地，TANABE[20]用葡萄糖和核糖分別對鯉魚肌原纖維蛋白進行糖基化，在30～40 ℃內，溫度的提高同樣會加強糖基化效果。由此可見，無論是分離蛋白還是肌原纖維蛋白，溫度的提高對糖基化均有促進作用。

2.1.2 糖濃度對分離蛋白的糖基化性能的影響

圖2為ACPP在不同糖濃度下的反應特性。從中不難看出，與對照組(N)相比，在蛋白/糖(質量比)1∶3～1∶7內，糖濃度對糖基化效果并不顯著。3組糖濃度(3G、5G、7G)的賴氨酸分別減少了46.95%、51.83%和55.38%，果糖胺則分別增加了1.14、1.41和1.42 mmol/L。推測原因一是體系內賴氨酸含量較少，不需要過多葡萄糖來提供羰基；二是整個糖基化反應的pH值處于7，反應強度低。而其他研究表明，FUJIWARA[7]在低糖濃度下進行的糖基化反應會出現明顯差異，但當糖濃度超過蛋白/葡萄糖質量比為1∶4時，反應趨于平穩；SATO[21]在使用蛋白/褐藻膠寡糖質量比為1∶0.4、1∶1、1∶4和1∶9對鯉魚肌原纖維進行研究發現，糖濃度越高，效果越明顯。可見，糖基化體系中反應物類型，即魚分離蛋白或魚肌原纖維，會影響糖基化特性。

圖2 不同糖濃度下櫛孔扇貝閉殼肌分離蛋白(ACPP)的糖基化效果Fig.2 The characterization of glycosylation of acid protein precipitation (ACPP) from Chlamys farreri adductor muscle at different weight ratio of protein to sugar

2.1.3 還原糖對分離蛋白的糖基化性能的影響

圖3 不同還原糖下櫛孔扇貝閉殼肌分離蛋白(ACPP)的糖基化效果Fig.3 The characterization of glycosylation of acid protein precipitation (ACPP) from Chlamys farreri adductor muscle at different reducing sugars

本研究按照糖的聚合度即單糖、雙糖及多糖3種類型，分別選用了葡萄糖(G)、乳糖(L)和葡聚糖5 000(D)為糖基供體。圖3顯示了ACPP與不同還原糖的糖基化反應特性，與乳糖和葡聚糖相比，葡萄糖更利于糖基化進行。其中，葡萄糖、乳糖和葡聚糖組的賴氨酸分別下降了23.22%、25.81%和43.09%，果糖胺分別增加了0.2、0.68和1.41 mmol/L。分析原因為葡萄糖分子質量最低，利于羰基與蛋白結合。同類報道表明，YOU等[22]用木糖、葡萄糖、半乳糖、低聚異麥芽糖和葡聚糖1 000對鰱魚水溶性蛋白進行糖基化，其中分子質量低的木糖最易發生糖基化，其次為葡萄糖。DECOURCELL[13]利用了木糖和葡聚糖270 kDa對北極甜蝦(Pandalusborealis)酶解物進行糖基化，發現木糖對糖基化的作用大于葡聚糖270 kDa。此外，陳欣[23]選用葡萄糖、乳糖、殼聚糖、羧甲基纖維素鈉以及葡聚糖(65萬)為糖基供體，對羅非魚肉肌原纖蛋白進行糖基化改性，同樣得出小分子糖(葡萄糖和乳糖)與肌原纖維蛋反應的速度較快，但大分子糖(羧甲基纖維素鈉和葡聚糖)更有利于乳化性和熱穩定性的提高。顯而易見，無論在何種蛋白體系類型中，就糖基化效果而言，低分子質量糖更有利于糖基化。值得注意的是，糖基化反應程度與糖基化產物的功能性值得有針對性深入探索。

圖4 不同溫度下櫛孔扇貝閉殼肌酸溶蛋白(ACSP)的糖基化效果Fig.4 The characterization of glycosylation of acid soluble protein (ACSP) from Chlamys farreri adductor muscle at different temperatures

2.2閉殼肌酸溶蛋白(ACSP)的糖基化性能

2.2.1 酸溶蛋白的糖基化性能

分離蛋白制備主要包括蛋白質溶出和蛋白質回收兩個關鍵步驟，鑒于操作繁瑣及蛋白質損耗等問題，本研究嘗試以溶出蛋白為反應物，直接進行糖基化處理。圖4～圖6分別為溫度、糖濃度及還原糖對ACSP糖基化的影響效果，從中不難看出，以酸溶蛋白為出發物幾乎不產生糖基化反應。分析原因為羰氨反應是可逆的，酸性環境不利于糖基化產物的積累[17，24]。因此，直接以酸溶ACSP為反應物是無法進行糖基化的。

圖5 不同糖濃度下櫛孔扇貝閉殼肌酸溶蛋白(ACSP)的糖基化效果Fig.5 The characterization of glycosylation ofacid soluble protein (ACSP) from Chlamys farreri adductor muscle at different weight ratio of protein to sugar

圖6 不同還原糖下櫛孔扇貝閉殼肌酸溶蛋白(ACSP)的糖基化效果Fig.6 The characterization of glycosylation ofacid soluble protein (ACSP) from Chlamys farreri adductor muscle at different reducing sugars

2.2.2 酸溶蛋白的pH與糖基化性能

酸溶蛋白無法直接作為糖基化反應物，通過提高酸溶蛋白pH值，來探索其糖基化反應的可行性。圖7為pH值調至3、5及7后酸溶蛋白的糖基化結果，事實表明，調節pH后的溶出蛋白ACSP的糖基化是可行的，且效果與分離蛋白相媲美。pH值越高，糖基化效果越劇烈。如圖7所示，pH 3的酸溶蛋白依舊無法發生糖基化反應；而pH 7的糖基化反應效果最明顯，賴氨酸增加了48.89%，果糖胺升高了1.49 mmol/L，吸光度增大到0.071；pH 5 反應強度介于二者中間，賴氨酸增加了22.45%，果糖胺增加了0.97 mmol/L，吸光度增大到0.050。3種pH間溶解性存在差異，其中pH 3時溶解性最大，pH 7次之，pH 5最低，這是由蛋白質兩性性質造成的。此外，糖基化反應后，pH值為7的酸溶蛋白(ACSP)會產生顯著褐變，而分離蛋白(ACPP)則不會發生，分析原因可能是，酸溶出蛋白沒有經過蛋白回收的過程，其中還有游離氨基酸和肽等，這些低分子在糖基化過程極易發生美拉德褐變。孫麗平等[25]以賴氨酸-葡萄糖為模型，在pH 5～pH 9，pH值越高褐變程度越大。孫方達[26]在研究豬骨蛋白水解物時也同樣發現，在pH 5～9區間內，賴氨酸含量隨著反應pH值的上升而減幅越大。由此可見，低分子含氮物(游離氨基酸或肽)和pH是羰氨反應的關鍵要素。

圖7 不同pH值下櫛孔扇貝閉殼肌酸溶蛋白(ACSP)的糖基化效果Fig.7 The characterization of glycosylation ofacid soluble protein (ACSP) from Chlamys farreri adductor muscle at different pH

3 結論與展望

以櫛孔扇貝閉殼肌為出發材料，圍繞其分離蛋白糖基化特性開展研究。初步研究結論可以歸納為2點：(1)分離蛋白可以有效進行糖基化，溫度的提高對糖基化有促進作用，糖濃度對糖基化的影響則較小，不同還原糖的影響存在差異，葡萄糖最易促進糖基化。(2)對于溶出蛋白而言，酸溶蛋白無法直接進行糖基化反應，可通pH調節使其有效進行糖基化，并達到分離蛋白糖基化的相同效果，如此可以減少蛋白損耗且節省操作步驟。故以溶出蛋白為出發物進行糖基化處理更有實際意義。

需要指出的是，堿溶蛋白的糖基化特性值得今后系統探索對比；此外，糖基化帶來的功能性改善效果值得深入研究。

[1] HULTIN H O, KELLEHER S D.Process for isolating a protein composition from a muscle source and protein composition:US,6005073[P/OL].1999-12-21[2014-03-01].http://www.google.com.hk/patents/US6005073?dq=US,6005073&hl=zhCN&sa=X&ei=2ZhsUrT7FsWTiQe-x4DAAg&ved=0CEkQ6AEwAg

[2] HELGI N, INGRID U.The acid and alkaline solubilization process for the isolation of muscle proteins:state of the art[J].Food Bioprocess Technol,2009,2(1):1-27.

[3] PARK J W.Surimi and surimi seafood[M].Florida:CRC Press,2005:107-133.

[4] 鄭惠娜,張晶晶,周春霞,等.pH 調節法提取牡蠣蛋白及氨基酸、蛋白組成分析[J].中國食品學報,2014,14(7):230-235.

[5] 李芳,劉俊榮,梁姍姍,等.南極磷蝦蛋白質的分離特性及其組分分析[J].大連海洋大學學報,2013,28(2):191-194.

[6] 梁姍姍,劉俊榮,馬永生,等.蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)外套膜蛋白的分離提取及功能特性研究[J].食品科學,2014, 35(7):12-16.

[7] FUJIWARA K, OOSAWA T, SAEKI H.Improved thermal stability and emulsifying properties of carp myofibrillar proteins by conjugation with dextran[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1998,46(4):1 257-1 261.

[8] SAEKI H.Preparation of neoglycoprotein from carp myofibrillar protein by maillard reaction with glucose:biochemical properties and emulsifying properties[J].J Agric Food Chem,1997,45(3):680-684.

[9] KATAYAMA S, SHIMA J, SAEKI H.Solubility improvement of shellfish muscle proteins by reaction with glucose and its soluble state in low-ionic-strength medium[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2002,50(15):4 327-4 332.

[10] TAKEDA H, IIDA T, OKADA A, et al.Feasibility study on water solubilization of spawned out salmon meat by conjugation with alginate oligosaccharide[J].Fisheries Science,2007,73(4):924-930.

[11] 尤娟.鰱魚魚肉蛋白抗氧化肽的制備及其糖基化產物功能特性的研究[D].北京:中國農業大學,2014.

[12] 張愛榮.糖基化反應改善鰱魚肉肌原纖維蛋白功能特性的研究[D].北京:中國農業大學,2005.

[13] DECOURCELLE N, SABOURIN C, AUBRY T, et al.Emulsifying and antioxidant properties of a shrimp (Pandalus borealis) hydrolysate conjugated with xylose or dextran through the maillard reaction by dry-heating in mild conditions[J].Journal of Food Research,2014, 3(3):144-157.

[14] LIU J H, YU F L, ZHOU X X , et al.Protein hydrolysate using combined controlled enzymatic hydrolysis and glycation for improved solubility and emulsifying properties[J].Journal of Food and Nutrition Research, 2015,3(7):471-477.

[15] 王軍,王忠合,傅力,等.美拉德反應對金帶細鲹魚肉蛋白酶解物功能特性及潛在危害物形成的影響[J].食品與發酵工業,2015,41(11):23-28.

[16] WAHYUNI M, ISHIZAKI S, TANAKA M.Improvement of thermal stability of fish water soluble proteins with glucose-6-phosphate through the maillard reaction[J].Fisheries Science,1998,64(6):973-978.

[17] GOODNO CC, SWAISGOOD H E, CATIGNANI G L.A fluorimetric assay for available lysine in proteins[J].Anal Biochem,1981,115(1):203-211.

[18] BRADFORD MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry1976,72:248-254.

[19] DAMODARAN S, PARKIN K L, FENNEMA O R.Fennema’s Food Chemistry[M].Boca Raton:CRC Press,2007:825-826.

[20] TANABE M, SAEKI H.Effect of maillard reaction with glucose and ribose on solubility at low ionic strength and filament-forming ability of fish myosin[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001,49(7):3 403-3 407.

[21] SATO R, SAWABE T, KISHIMURA H, et al.Preparation of neoglycoprotein from carp myofibrillar protein and alginate oligosaccharide:improved solubility in low ionic strength medium[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry ,2000,48(1):17-21.

[22] YOU J, LUO Y K, SHEN H X.Functional properties of water-soluble proteins from silver carp (Hypophthalmichthysmolitrix) conjugated with five different kinds of sugar[J].Food Bioprocess Technol,2013,6(12):3 596-3 603.

[23] 陳欣.羅非魚肉肌原纖維蛋白糖基化改性研究[D].湛江:廣東海洋大學，2010.

[24] 吳惠玲,王志強,韓春,等.影響美拉德反應的幾種因素研究[J].現代食品科技, 2010,26(5):440-444.

[25] 孫麗平,汪東風,徐瑩,等.pH和加熱時間對美拉德反應揮發性產物的影響[J].食品工業科技,2009,30(4):122-125.

[26] 孫方達,孔保華,韓齊,等.反應初始pH和加熱時間對豬骨蛋白水解物美拉德產物特性的影響[J].食品工業科技,2003,34(22):106-115.

ThecharacterizationofglycosylationofproteinisolatedfromChlamysfarreriadductormuscle

JIANG Meng-yun, LIU Jun-rong*, ZHOU Yan-lin, ZHANG Qing, LIU Hui-hui, TIAN Yuan-yong

(College of Food Science and Engineering, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China)

To explore the functionality of marine invertebrates’ fish protein isolate,Chlamysfarreriwas studied; fish protein was isolated by using acid-aided solution from adductor muscle, soluble protein (ACSP) was extracted under critical pH. Acidic protein precipitation (ACPP) was obtained from ACSP by isoelectric precipitation. ACSP and ACPP were modified by glycosylation respectively. The characterization of glycosylation in different reducing sugars(glucose, lactose and dextran) , temperature (40,50 and 60 ℃), the mass ratio of protein to sugar (1∶3,1∶5 and 1∶7) and pH were investigated by measuring the available lysine content, fructosamine content and brown color development. Among several reducing sugars, glucose was the most effective in glycosylation, and its available lysine was decreased 43.09%, fructosamine increased 1.41 mmol/L. Significant differences were observed at different temperature, the most efficiency was at 60 ℃ and its available lysine was decreased 46.95%, fructosamine increased 1.41 mmol/L. Glycosylation was not affected by the weight ratio of protein to sugar. ACSP was not glycosylated directly, when adjusting pH to neutral, glycosylation was obtained. Its available lysine was decreased 48.89%, fructosamine was increased 1.49 mmol/L. The results suggested that glycosylation may be a useful approach for modification of fish protein isolate fromChlamysfarreri.

Chlamysfarreri; adductor muscle; protein isolate; glycosylation

碩士研究生(劉俊榮教授為通訊作者,E-mail：ljunrong@dlou.edu.cn)。

國家自然科學基金(31271980)

2017-01-03，改回日期：2017-03-15

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013743