芝麻香型機械化和手工工藝酒醅發酵過程中的糖與糖苷

江流，范文來，徐巖

(教育部工業生物技術重點實驗室，江南大學 生物工程學院釀造微生物與應用酶學研究室，江蘇 無錫， 214122)

芝麻香型機械化和手工工藝酒醅發酵過程中的糖與糖苷

江流，范文來*，徐巖

(教育部工業生物技術重點實驗室，江南大學 生物工程學院釀造微生物與應用酶學研究室，江蘇 無錫， 214122)

采用六甲基二硅氮烷(HMDS)作為衍生劑，結合氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry ，GC-MS)技術研究了機械化和手工工藝酒醅中的糖類化合物(糖、糖苷和糖醇)在發酵過程中的變化。研究結果表明，酒醅發酵過程中，糖總量呈下降趨勢，糖醇總含量呈上升趨勢，糖苷呈現先上升再下降趨勢。手工酒醅中葡萄糖、糖苷、糖醇含量均明顯高于機械化酒醅，但機械化酒醅中阿拉伯糖含量比手工酒醅高；2種工藝酒醅中的二糖含量差異不明顯。

酒醅；糖醇；糖；糖苷；硅烷化；氣相色譜-質譜(GC-MS)；發酵

白酒酒醅發酵過程中，原料淀粉被微生物分解為葡萄糖等糖類，還原糖進一步被微生物轉化為各種小分子物質，這些小分子物質在常溫、長期發酵時發生各種化學反應(如糖與氨基酸的反應)，產生風味物質。糖是微生物的重要碳源，能影響微生物的生長、繁殖[1]。

目前我國酒醅中糖的研究主要集中在還原糖[2-3]和總糖[4]方面，較少涉及糖及糖醇的研究，未見糖苷研究的報道。唐潔[5]曾利用高效液相色譜法(HPLC)測定了清香型酒醅發酵過程中葡萄糖的變化；2015年孫潔等人[6]應用離子色譜方法測定了酒醅中的赤蘚糖醇、木糖醇、葡萄糖等10種糖和糖醇；而被大量研究的國外飲料酒發酵過程中的糖苷，則未見在我國白酒酒醅中的進行過相關報道。

測定糖類物質(糖、糖醇、糖苷)的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[7]、毛細管電泳法(CE)[8]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[9]、離子色譜法[6]等。硅烷化衍生結合GC-MS法是檢測多羥基化合物的常用方法[9-11]，常見硅烷化試劑有六甲基二硅氮烷(HMDS)、三甲基氯硅烷(TMCS)、N-(特丁基二甲基硅)-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)、N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)等。硅烷化HMDS因其與糖反應時間短，響應較好，在葡萄酒研究中獲得廣泛應用[10]。

本研究以芝麻香型機械化和手工2種不同工藝的酒醅為研究對象，采用HMDS衍生化結合GC-MS方法對糖、糖醇、糖苷進行定性、定量分析，分析酒醅發酵過程中糖、糖醇和糖苷的變化，以便于更進一步研究發酵過程中微生物及其代謝情況。

1 材料和方法

1.1材料和儀器

芝麻香型酒醅由山東某酒廠提供，機械化酒醅發酵期49 d，手工酒醅發酵期52 d，堆積結束取1次樣，發酵前5天每天取1次樣，之后每隔5天取1次樣，直至發酵結束。

試劑:阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、松二糖、海藻糖、木糖醇、阿拉伯糖醇、核糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、甘油、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷、水楊苷(內標，IS)、吡啶、三氟乙酸(TFA，色譜純)、HMDS(衍生劑，色譜純)，Sigma-Aldrich(上海)公司；0.22 μm 微孔濾膜(有機相)，上海泰坦科技。

儀器:Thermo Scientific GC TSQ8000-MSD Trace 1310，美國Thermo Fisher公司；N-EVAP 氮吹儀，美國Organomation公司；超純水儀，美國Millipore公司。

1.2實驗方法

1.2.1 糖類提取

使用改進的PARTRICIA等[12]方法。取5.0 g酒醅于50 mL離心管中，加入25 mL超純水，振蕩均勻后，置于4 ℃冰箱中過夜，冰浴超聲15 min，取上清液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，收集在25 mL容量瓶中，最后用超純水定容至25 mL，置于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 HDMS衍生化

參考FRANCIS[13]的方法。取100 μL上述萃取液于2 mL樣品瓶中，加入100 μL 內標水楊苷，終含量為220 mg/L，輕輕振蕩搖勻，緩慢氮氣吹干。吹干后，加入100 μL吡啶、100 μL HMDS和10μL TFA，振蕩搖勻后，于45 ℃條件下反應30 min，冷卻至室溫再進行GC-MS分析。

1.2.3 GC-MS條件

根據石亞林等[14]的方法。取反應后的樣品進行GC-MS分析，進樣量為1 μL。GC條件：色譜柱為TG-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，進樣口溫度為280 ℃; 載氣為氦氣，流速1. 3 mL/min，分流比為20∶1;升溫程序為:65 ℃保持2 min，以6 ℃/min 升溫至280 ℃，并保持15 min。MS 條件:EI 電離源，電子能量70 eV，掃描范圍:50～650 amu，離子源溫度:300 ℃。

測定結果與NIST08質譜庫進行比對，通過特征離子、保留時間、匹配度進行初步鑒定，再用標準物質進行最終確認。沒有標準品的化合物為臨時性鑒定的化合物。

1.2.4 定量分析

糖類物質定量使用選擇離子模式(SIM)，繪制標準曲線：用煮沸過的超純水配制待測物質的混合標準溶液，各物質的最初含量為阿拉伯糖637 mg/L、木糖1 483 mg/L、葡萄糖2 394 mg/L、松二糖318 mg/L、海藻糖1 413 mg/L、赤蘚糖醇 916 mg/L、木糖醇 1 090 mg/L、阿拉伯糖醇1 029 mg/L、核糖醇 635 mg/L、半乳糖醇 823 mg/L、甘露糖醇 1 001 mg/L、山梨糖醇 804 mg/L、肌醇523 mg/L、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷1 297 mg/L，然后將混合標準溶液梯度稀釋(1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/1 024)，各梯度溶液與樣品處理方式、反應條件和測定條件完全相同。以糖類物質與內標的含量比作為縱坐標，糖類物質峰面積與內標物質的峰面積比作為橫坐標繪制標準曲線。檢測限(LOD)：儀器信噪比為 3時可檢測到的化合物的質量含量；定量限(LOQ)：取10倍信噪比。

2 結果與討論

2.1酒醅中糖類物質定性和定量

本研究采用HMDS衍生化結合GC-MS方法對酒醅中的糖類物質進行了分析檢測，共定性了5種糖、8種糖醇和2種糖苷(1種是臨時性鑒定)，其中葡萄糖、赤蘚糖醇、甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇、阿拉伯糖醇已有文獻報道[6]，阿拉伯糖、木糖、松二糖、海藻糖、核糖醇、肌醇、甲基-α-吡喃葡萄糖苷、甘油葡萄糖苷(臨時性鑒定)等8種化合物是首次在酒醅中檢測到。甘油葡萄糖苷已經在日本清酒中鑒定出[15]。由于沒有標準品，故采用其峰面積與內標峰面積比來計算其含量(半定量)。

因吡喃和呋喃環上的—OH 存在1α-和1β-立體異構，故單糖和甲基-α-吡喃葡萄糖苷、甘油葡萄糖苷(臨時性鑒定)有2個色譜峰，計算峰面積時將2個色譜峰的面積相加[12]。

1-赤蘚糖醇；2，2*-阿拉伯糖；3，3*-核糖；4，4*-木糖；5-木糖醇；6-阿拉伯糖醇；7-核糖醇；8，8*-甲基-α-吡喃葡萄糖苷；9，9*-葡萄糖；10-甘露糖醇；11-山梨糖醇；12-半乳糖醇；13-肌醇；14，14*-甘油葡萄糖苷；IS-內標；15-松二糖；16-海藻糖圖1 酒醅中糖類物質衍生化后總離子流圖(TIC)Fig.1 GC-MS total ion current of silylated carbohydrates in fermented grains

從表1可以看出，所有待測定化合物標準曲線R2在0.986～0.999之間，線性較好；相對標準偏差(RSD)在2%～7%之間；回收率在89%～104%之間，該法能夠定量酒醅中的糖類物質。

2.2發酵過程中糖類物質變化

2.2.1 發酵過程中糖和糖苷變化

無論是手工工藝還是機械化工藝，隨著發酵進行糖總含量呈下降趨勢，酒醅中糖最高含量為11.80 mg/g(濕重，下同)，發酵結束時僅有1.18 mg/g(見圖2和圖3)。酒醅發酵初期，原料中淀粉經糖化酶作用產生葡萄糖等還原糖。第1天，葡萄糖含量最高，達9.38 mg/g，低于文獻報道值27.65 mg/g[6]；后葡萄糖含量開始下降，其他糖具有類似變化。含量第2高的糖是阿拉伯糖，在整個發酵過程中最高達1.18 mg/g；含量較高的糖還有木糖和核糖，最高含量分別為0.57 mg/g和0.59 mg/g。

表1 糖類物質的定量離子、標準曲線、R2、LOD、LOQ、回收率、RSD(n=3)和線性范圍

圖2 機械化酒醅發酵過程中游離態單糖的變化Fig.2 Concentrations of free monosaccharides during fermentation of grains by mechanical production

圖3 手工酒醅發酵過程中游離態單糖的變化Fig.3 Concentrations of free monosaccharides during fermentation of grains by traditional production

首次檢測到的2種二糖即海藻糖和松二糖含量較低，最高含量分別為0.39 mg/g和0.20 mg/g，且發酵前后變化不明顯(圖4和圖5)。海藻糖是原料中淀粉水解產物[16]，也是某些酵母菌抵抗不良環境的應激代謝產物[17]。松二糖是蔗糖的同分異構體，在某些酶存在的條件下，蔗糖可轉化為松二糖[18]。

圖4 機械化酒醅發酵過程中二糖和糖苷的變化Fig.4 Concentrations of free disaccharides and glucoside during fermentation of grains by mechanical production

圖5 手工酒醅發酵過程中二糖和糖苷的變化Fig.5 Concentrations of free disaccharides and glucoside during fermentation of grains by traditional production

首次鑒定出的2個糖苷甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷和甘油葡萄糖苷(臨時性鑒定)在2種工藝酒醅發酵過程中變化基本一致，總體呈下降趨勢(圖4和圖5)。手工酒醅中甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷和甘油葡萄糖苷最高含量均比機械化中最高含量高，分別比機械化酒醅中含量高78.50%和139.69%，甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷含量于第20天達到最大值，為0.83 mg/g；甘油葡萄糖苷第10天達到最高，為1.16 mg/g。

2.2.2 發酵過程中糖醇變化

不論是何種工藝，糖醇在酒醅發酵過程中的含量總體呈上升趨勢(見圖6和圖7)。機械化酒醅中糖醇總量在發酵第45天最高，達8.07 mg/g，手工酒醅糖醇總量發酵結束時，即第52天達到最高，為7.80 mg/g。酒醅中含量最高的糖醇為赤蘚糖醇，最高含量達2.08 mg/g，與文獻報道值類似[6]。其次為木糖醇、核糖醇和阿拉伯糖醇，最高含量依次為1.83 mg/g、1.66 mg/g和1.61 mg/g。從圖6和圖7可以看出，木糖醇和阿拉伯糖醇同步變化。木糖醇和阿拉伯糖醇含量都低于文獻報道芝麻香型酒醅中的含量(分別為4.31 mg/g和5.67 mg/g)[6]。

圖6 機械化酒醅發酵過程中游離態糖醇的變化Fig.6 Concentrations of free alditols during fermentation of grains by mechanical production

圖7 手工酒醅發酵過程中游離態糖醇的變化Fig.7 Concentrations of free alditols during fermentation of grains by traditional production

2.2.3 兩種工藝酒醅中糖類物質比較

無論何種工藝，酒醅發酵過程中糖含量總體呈下降趨勢。比較2種工藝中糖類物質，其變化存在差異。機械化和手工酒醅中葡萄糖在第1天同時達到最高值，但機械化酒醅中含量更高，比手工酒醅高30.78%。機械化酒醅中阿拉伯糖含量在第5天達到最高值(1.18 mg/g)，而手工酒醅第15天達到最高值(1.15 mg/g)。發酵結束時，手工酒醅中葡萄糖含量比機械化酒醅高4.62%；但機械化酒醅中阿拉伯糖含量比手工酒醅中高24.57%。

二糖在發酵過程總體呈下降趨勢(圖4和圖5)。發酵過程中，2種工藝酒醅中松二糖含量差異較小。第0～4天，2種工藝酒醅中海藻糖含量均先上升后下降再上升，機械化中海藻糖含量第2天達到最高值(0.46 mg/g)，相比第0天上升了76.50%，而手工酒醅中第1天達到最高值(0.38 mg/g)，相比第0天上升了4.63%。第4天之后，2種工藝中海藻糖含量都下降，機械化中下降得較快。發酵結束時2種工藝酒醅中海藻糖含量差異不大。

2種工藝中糖苷變化趨勢一致，總體而言，手工酒醅中含量高于機械化酒醅。第0～5天，2種工藝中糖苷變化較小，第5～10天大幅上升，且手工酒醅中上升得更快；之后則逐漸下降。機械化酒醅中甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷含量在第10天達到最高值0.46 mg/g，而手工酒醅第20天達最高值0.83 mg/g。2種工藝中甘油葡萄糖苷含量都在第10天達到最高，機械化和手工酒醅中分別為0.48 mg/g和1.16 mg/g。發酵結束時，手工酒醅中甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷和甘油葡萄糖苷含量均高于機械化酒醅，前者高57.79%，后者高172.10%(圖4和圖5)。理論上講，糖苷在酸性的酒醅中應該處于水解狀態，但本研究卻發現在酒醅發酵前10天處于上升趨勢，是反應產生的，還是其他原因造成的，值得深入研究。

手工生產時酒醅中糖醇含量較高。發酵前后，機械化酒醅中糖醇總含量上升了53.86%，而手工酒醅中糖醇總含量上升了84.97%，機械化酒醅中赤蘚糖醇在第35天達到最高2.08 mg/g，而手工酒醅在第40天達最高值1.97 mg/g。發酵結束時，手工酒醅中赤蘚糖醇含量比機械化酒醅高31.55%；此外，發酵結束時，手工酒醅中木糖醇、阿拉伯糖醇和核糖醇含量分別比機械化酒醅中高11.82%、59.58%和26.33%。

3 結論

本研究定性定量了芝麻香型酒醅發酵過程中的糖類物質，首次在酒醅中檢測到阿拉伯糖、木糖、松二糖、海藻糖、核糖醇、肌醇、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷、甘油葡萄糖苷(臨時性鑒定)。發酵過程中糖總體呈下降趨勢，而糖醇總體呈現上升趨勢，至發酵結束時，呈下降趨勢。甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷和甘油葡萄糖苷(臨時性鑒定)是先上升，到第10天后再緩慢下降，且手工酒醅發酵過程中糖苷含量明顯高于機械化酒醅。至發酵結束時，手工酒醅中葡萄糖含量比機械化酒醅高，但機械化酒醅中阿拉伯糖含量比手工酒醅高；發酵結束時2種工藝酒醅中二糖含量差異不明顯；與機械化酒醅相比，手工酒醅中含有更多的糖苷、糖醇。

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CarbohydratesandglucosidesfromfermentedgrainsduringmechanicalandtraditionalproductioninChineseroasted-sesame-likearomatypeliquor

JIANG Liu,FAN Wen-lai*,XU Yan

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Laboratory of Brewing Microbiology and Applied Enzymology，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Free soluble carbohydrates and glucosides in fermented grains during mechanical and traditional production were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS) as their trimethylsilyl derivatives using hexamethyldisilazane (HMDS). The results suggested that the total content of sugar decreased and the total content of glucosides increased before reduction. The total content of alditols increased. The content of glucose, glucosides and altitols in fermented grains by traditional production was higher than that of fermented grains by mechanical production, but the content of arabinose was lower. There was no significant difference in the content of disaccharides between these two kinds of fermented grains.

fermentedgrains；alditols；sugars；glucosides；silylation；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)；fermentation

碩士研究生(范文來研究員為通訊作者，E-mail：wenlai.fan@163.com)。

國家重點研發計劃(National Key R&D Program,2016YFD0400503)；國家高技術研究發展計劃(863計劃)(2013AA102108)

2017-03-31，改回日期：2017-04-21

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014421