樟子松外生菌根形態類型及分子鑒定

張文泉，羅國濤，余 洋，閆 偉

(1.凱里學院，貴州 凱里 556011； 2.中國地質環境監測院，北京 100081； 3.內蒙古農業大學 林學院，內蒙古 呼和浩特 010019)

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(10): 1678-1685

張文泉， 羅國濤， 余洋， 等. 樟子松外生菌根形態類型及分子鑒定[J]. 浙江農業學報， 2017， 29(10): 1678-1685.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.10.12

2017-06-14

貴州省科技廳基礎研究項目(黔科合基礎[2017]1165號)；貴州省科技廳聯合基金項目(黔科合LH字[2014]7241號)；國家自然科學基金項目(41504112)；貴州省科技廳聯合基金項目(黔科合LH字[2015]7752號)；凱里學院博士專項課題(凱院合BS201339號)

張文泉(1984—)，男，湖南冷水江人，博士，副教授，主要從事林木生物技術方面的研究。E-mail: 445659248@qq.com

*通信作者，閆偉，E-mail: 597139389@qq.com

樟子松外生菌根形態類型及分子鑒定

張文泉1，羅國濤1，余 洋2，閆 偉3，*

(1.凱里學院，貴州 凱里 556011； 2.中國地質環境監測院，北京 100081； 3.內蒙古農業大學 林學院，內蒙古 呼和浩特 010019)

以內蒙古及周邊地區樟子松的外生菌根為材料，采用形態解剖學與分子生物學手段相結合的方法，對與樟子松共生的外生菌根真菌多樣性進行了全面調查及研究，并將所測序列在GenBank中進行比對。結果表明：在內蒙古及周邊地區與樟子松共生的外生菌根真菌共19種，擔子菌15種，子囊菌4種，分別來自于絲膜菌屬(Cortinarius)、絲蓋傘屬(Inocybe)、牛肝屬(Suillus)、蠟殼耳屬(Sebacina)、紅菇屬(Russula)、乳菇屬(Lactarius)、棉革菌屬(Tomentella)、黏滑菇屬(Hebeloma)和空團菌屬(Cenococcum)、塊菌屬(Tuber)、口蘑屬(Tricholoma)。表明樟子松外生菌根真菌多樣性相對較高，且與利用地上子實體鑒定的外生菌根真菌種類有一定的區別。

樟子松；外生菌根；形態解剖學；分子鑒定；ITS

外生菌根(ectomycorrhiza，ECM)是土壤中某些真菌的菌絲與植物根系形成的一種共生體，其特點是菌絲侵入到皮層細胞的間隙中，而未進入細胞內，多形成于喬木及灌木。目前，我國對外生菌根資源的調查多集中在形成外生菌根的真菌資源調查[1]，從某一樹種出發，以菌根共生體為研究對象，系統地研究與這一樹種共生的菌根類型的報道較少。趙忠等[2]、唐明等[3]、陳輝等[4]對楊樹的菌根進行了分類鑒定[2-4]，弓明欽等[5]、李桂蘭等[6]、Jones等[7]、Simard等[8]對樺樹的菌根進行了分類鑒定[5-8]。樊永軍[9]以形態特征為依據，對內蒙古的興安落葉松、青海云杉、白樺、山楊等4個樹種的外生菌根進行了分類，并進行了分子鑒定。

有關松屬樹種的外生菌根，主要是針對馬尾松、油松的外生菌根進行研究。樟子松(Pinussylvestrisvar. mongolica)具有耐旱、耐貧瘠、耐寒和較速生等特點，是我國北方地區的主要造林樹種。本研究以樟子松外生菌根的形態特征及解剖結構為依據進行分類，再采用分子鑒定的手段進行物種鑒定，可為樟子松造林過程中菌根生物技術的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

外生菌根分別取自內蒙古大興安嶺林場紅花爾基林業站、莫爾道嘎林業站，內蒙古赤峰市黃崗梁林場、呼和浩特市涼城林場、鄂爾多斯伊金霍洛旗林場，呼和浩特市樟子松大苗基地和遼寧章古臺林場共7個地方的樟子松天然林及人工林。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌根的采集

根據Agerer[10]的方法，在樟子松純林群落中依據海拔高度，隨機選取3～5個樣地。在每個樣地內用小鐵鍬沿著樟子松根部挖至根的末級，取體積為20 cm ×20 cm×20 cm、帶有細根的土塊裝袋、編號，每個樣地取3袋以上。分別于2012與2013年的每個生長季(4—10月)取2次樣，樣品放于4 ℃冰箱中保鮮待測。

1.2.2 樣品處理

采回的樣品置于鋼絲篩流水沖洗，洗凈根部表面的沙土后剪成長約1 cm的根段，再置于體視顯微鏡下用鑷子、細小的毛刷及解剖針進一步清洗。

1.2.3 宏觀形態觀察

在體視顯微鏡下，觀察記錄菌根的形狀、顏色、分叉情況、菌索及外延菌絲的有無、菌套表面質地、是否透明、有無囊狀體等，用電腦顯微系統進行拍照并記錄其形態特征；同時選取新鮮、幼嫩、純凈的同一分支系統菌根2～3個，置于CTAB緩沖液中，室溫保存，作為提取DNA的樣品。

1.2.4 顯微結構觀察

新鮮菌根的菌套制片：將分類的新鮮菌根在體視顯微鏡下剝取菌套，制成臨時切片。

永久封片制作：將新鮮菌根的短根組織(2～3 mm長的根段)固定于FAA固定液中，采用常規石蠟切片法，番紅固綠雙重染色，制成永久封片。

將切片置于OLYMPUS-BH2顯微鏡下觀察，記錄菌套內外表面菌絲的排列方式、外延菌絲的形狀、直徑，哈蒂氏網排列方式、菌索的類型以及菌絲是否有隔有核、分叉、鎖狀聯合等特征，最后記錄并拍照。

1.2.5 分類

以所采集樣品外生菌根的宏觀形態和顯微結構特征為鑒定依據，參照Agerer[10]體視顯微鏡菌根圖譜和Haug等[11]的菌根圖譜進行分類鑒定，菌套表面類型劃分參考圖1[9]。

1.2.6 分子鑒定

DNA的提取采用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒，采用ITS1F、ITS4引物[12-15]擴增菌根的rDNA ITS序列。PCR反應體系50 μL:DNA模板2 μL，ITS1F、ITS4引物各2 μL，2×Master Mixture 25 μL，用ddH2O補足至50 μL。PCR擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 60 s，72 ℃延伸60 s，35個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物的純化和測序交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。序列編輯用bioedit完成，將獲得的菌根rDNA ITS序列在GenBank中進行比對分析，根據序列的相似度來確定菌根真菌的分類[16-19]。

類型A—I， 密絲組織菌套；類型K-Q， 擬薄壁組織菌套Type A-I， plectenchymatous mantles; Type K-Q， pseudoparenchymatous mantles圖1 菌套表面類型對照圖Fig.1 The contrast plan of fungal mantle surface types

2 結果與分析

2.1 樟子松外生菌根形態解剖特征

依據菌根外部形態、菌根內外表面結構和哈蒂氏網等特征將7個樣地樟子松外生菌根初步劃分出19種類型，并采用圖譜的形式對其進行了詳細的描述，具體形態描述如下所示。

(1)類型1

形態特征(圖2中①)：菌根系統單軸分支，長(10±2)mm，直徑(0.6±0.2)mm，菌根表面疏松，菌根黃褐色，成熟時顏色加深，外延菌絲短而稀，無根狀菌索。解剖學特征(圖2中②)：菌套較厚，易剝離，菌套外表面不透明，菌絲互相連接彎曲分支形成網狀，且細胞壁比較厚，無鎖狀聯合，菌套類型為M。

(2)類型2

形態特征(圖2中③)：菌根系統單軸羽狀分支，長(6±3)mm，直徑(1.0±0.2)mm，菌根乳白色，外延菌絲纏繞形成較長、肉質根狀菌索。解剖學特征(圖2中④)：菌套較薄，外層為密絲組織，透明，菌絲有隔，無鎖狀聯合，哈蒂氏網深入達到內皮層細胞，菌套類型為F。

(3)類型3

形態特征(圖2中⑤)：菌根系統單軸分枝，長(11±2)mm，直徑(0.8±0.2)mm，菌根肉色，成熟時逐步變為紅色，菌根表面有少量白色外延菌絲，較長，交織成網狀或絨氈狀，無根狀菌索松。解剖學特征(圖版2中⑥)：菌套表面為密絲組織，菌絲排列疏松，相互纏繞，菌絲壁較厚，邊緣光滑，分隔明顯，隔處無收縮，分叉，無明顯鎖狀聯合，菌套類型為E。

(4)類型4

形態特征(圖2中⑦)：菌根系統多級二叉分支，呈珊瑚狀，長(3±1)mm，直徑(1±0.3)mm，菌根灰褐色，有純白色粉末包被于全株表面，菌根稍扭曲，無外延菌絲，無根狀菌索。解剖學特征(圖2中⑧)：菌套為擬薄壁組織，內表面菌絲平行排列，菌絲有隔，但無鎖狀聯合，菌絲細胞從間斷處進入到皮層細胞3～4層，達內皮層細胞。

(5)類型5

形態特征(圖2中⑨)：菌根系統不分支或單軸分支，基部有念珠狀結構，(4±1)mm長，直徑(1.5±0.4)mm，菌根紅褐色，表面有少量黃白色且纏繞成絨毛狀的外延菌絲，有根狀菌索。解剖學特征(圖版2中⑩)：菌套為擬薄壁組織，半透明，菌絲排列緊密，菌絲有隔，有不明顯的鎖狀聯合，哈蒂氏網達內皮層細胞，菌套類型為Q。

(6)類型6

(7)類型7

(8)類型8

(9)類型9

(10)類型10

(11)類型11

(12)類型12

(13)類型13

編號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37分別是樟子松外生菌根外部形態結構圖(×45)；編號2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38分別是樟子松外生菌根外菌套解剖結構圖(×400)No. 1， 3， 5， 7， 9， 11， 13， 15， 17， 19， 21， 23， 25， 27， 29， 31， 33， 35， 37 were morphology of ectomycorrhizae on Pinus sylvestris var. mongolica(×45); No. 2， 4， 6， 8， 10， 12， 14， 16， 18， 20， 22， 24， 26， 28， 30， 32， 34， 36， 38 were anatomical features of ectomycorrhizae mantle on Pinus sylvestris var. mongolica圖2 十九種不同類型樟子松外生菌根外部形態結構和菌套解剖結構Fig.2 Morphological and anatomical characteristics of 19 different EMC types on Pinus sylvestris var. mongolica

(14)類型14

(15)類型15

(16)類型16

(17)類型17

(18)類型18

(19)類型19

形態特征：菌根從上至下由幼嫩部至成熟部通體為黑色，末端圓鈍，明顯膨大，菌根多數不分支，少數二叉分支，長3～7 mm，直徑為0.5～0.6 mm，菌根表面有大量黑色剛毛狀的外延菌絲，菌絲剛硬，菌根表面粘附有大量的土壤粒，無根狀菌索，菌根周圍有許多菌核，菌核多圓球形或橢圓形，深黑色，直徑0.4～1.0 mm，菌核表面不光滑，但有光澤，表面也有剛毛狀的菌絲伸出(圖2中)。解剖學特征：菌套表面為排列緊密的擬薄壁組織，菌套類型為G型，菌絲排列呈星狀，菌絲在中央伸向一處，隆起，越往中央菌絲的壁越厚，而凹陷處的菌絲壁較薄，顏色較淡；菌套菌絲有隔，厚壁，直徑4.0～6.0 μm，整個菌套表面由一個接一個排列整齊的星狀突起連接而成，菌核表面的菌絲排列也與此相仿。平面觀菌套菌絲排列規則為圓形菌絲和長條形菌絲相間排列，菌套較厚，達14～16 μm，哈蒂氏網伸入皮層細胞2～3層(圖2中)。依據其外形，可將類型19鑒定為土生空團菌(Cenococcumgeophilum)，屬子囊菌亞門。

2.2 外生菌根分子鑒定

樟子松外生菌根根據外形可分為19個形態類型，類型19依據外形即可判定為土生空團菌。對供試的其他18個類型的外生菌根真菌采用分子方法進行鑒定，對其PCR擴增產物直接測序后，并運用GenBank的序列局部相似性查詢系統，基于rDNA的ITS區段分析后，結果如表1所示。大部分菌根真菌rDNA的ITS與GenBank數據庫中序列相似性達到97%以上；類型8相似性僅有91%，但通過與其他數據庫(如DDBJ)比對可確定為Hydnobolitescerebriformis；確定到科水平的有3種類型，到屬水平的有1種類型，到種水平的有14種類型，其中15個屬于擔子菌亞門，3個屬于子囊菌亞門。

3 結論與討論

本研究主要根據真菌與其宿主共生后形成的外生菌根形態、顏色、外延菌絲的結構及菌套表面質地、菌套表面菌絲和菌套切面菌絲分化程度以及哈蒂氏網菌絲的排列方式，利用光學顯微鏡，逐一記錄外生菌根由表及里、由宏觀至微觀乃至超微觀、由整體及局部的特征，并以此作為分類鑒定依據，發展了外生菌根共生體的直接分類鑒定技術，無論理論上還是實踐中都是可行的。

表1樟子松外生菌根真菌ITS序列鑒定結果

Table1Molecular identification of EMC fungi onPinussylvestrisvar. mongolica based on ITS sequences

類型Type最相近BLAST比對(GenBank登錄號)Closestblastmatch(GenBankaccessionNo．)相似度Similarity/%分類Classifiedas綱Class1Tuberliaotongense(GU9790371)99TuberliaotongenseAscomycotina2Suillusgranulatus(AJ2724101)97SuillusgranulatusBasidiomycotina3Sebacinaceaesp．(FJ8039331)99Sebacinaceaesp．Basidiomycotina4Suillusluteus(AY8986201)99SuillusluteusBasidiomycotina5Amphinemabyssoides(JQ7118161)97AmphinemabyssoidessBasidiomycotina6Sebacinaendomycorrhiza(AF4406511)97SebacinaBasidiomycotina7Sebacinaincrustans(DQ5200951)99SebacinaincrustansBasidiomycotina8Hydnobolitescerebriformis(EU7842711)91HydnobolitescerebriformisAscomycotina9Russulaxerampelina(FJ8454331)99RussulaxerampelinaBasidiomycotina10Hebelomaleucosarx(AB2112681)98HebelomaleucosarxBasidiomycotina11Cortinariuscoerulescentium(DQ083781)93CortinariuscoerulescentiumBasidiomycotina12Tubercastilloi(HM4854031)94TubercastilloiAscomycotina13Lactariuspubescens(AY6069531)99LactariuspubescensBasidiomycotina14Unculturedectomycorrhiza(Tomentella)(EF2188401)99TomentellaspBasidiomycotina15Cortinariusatrocoerulaeus(JQ7240221)99CortinariusatrocoerulaeusBasidiomycotina16UnculturedTricholomataceae(AF377210)98TricholomaspBasidiomycotina17Tommentellasp(HQ215817)97TomentellaspBasidiomycotina18Inocybesplendens(FN550911)99InocybespBasidiomycotina

本研究首先從形態學和解剖學角度對樟子松外生菌根進行了分類、鑒定和描述，并結合分子生物學方法，利用真菌特有引物ITS1F和ITS4進行PCR擴增，對外生菌根真菌rDNA的ITS區段進行序列測定，再與GenBank數據庫進行比對，確定到科水平的有3種類型，到屬水平的有1種類型，到種水平的有14種類型。其中，15個屬于擔子菌亞門，4個屬于子囊菌亞門。5、11、15號為絲膜菌屬，18號為絲蓋傘屬，2、4號為牛肝屬，3號為蠟殼耳科，6、7號為蠟殼耳屬，8號為盤菌科，9號為紅菇屬，13號為乳菇屬，14、17號為棉革菌屬，10號為黏滑菇屬，19號為空團菌屬，1、12號為塊菌屬，16號為口蘑屬?？傮w來看，北方地區與樟子松共生的外生菌根真菌多樣性較高，這與該地區干旱、半干旱環境條件相適應。在所分離的19種菌根類型中，菌根系統分支情況、顏色種類極其多樣化。由采樣地的環境條件與所采集的菌根外形條件分析可得出，水分、土壤等環境條件較好的區域，其外生菌根比較粗壯，外延菌絲多且發達、根狀菌索明顯，而菌根顏色、外延菌絲形態、菌套解剖學結構等特征則由形成外生菌根的真菌自身生物學特征決定。

土生空團菌是一個例外，其不論與哪個樹種形成外生菌根，外觀形態特征均一致，大量黑色剛毛狀的外延菌絲，樊永軍[9]在對山楊、白樺外生菌根的研究中發現，土生空團菌所形成的菌根有一些共同的特征。所以在本研究中，僅根據其外部形態特征，即可作出鑒定，同時也證明土生空團菌所形成的外生菌根外部形態特征與寄主植物無關，由土生空團菌本身決定。

[1] SMITH S E， READ D J. Mycorrhizal symbiosis[M]. San Diego: Academic Press， 2008: 23-46.

[2] 趙忠， 馬刊欣， 段安安. 毛白楊外生菌根類型及其生態學特性的研究[J]. 林業科學， 1993， 29(1): 12-18.

ZHAO ZH， MA K X， DUAN A A. Research on types and ecological characteristics of ectomycorrhiza ofPopulustomentosa[J].ScientiaSilvaeSinicae， 1993， 29(1): 12-18. (in Chinese with English abstract)

[3] 唐明， 陳輝， 郭建林，等. 陜西省楊樹外生菌根種類的調查研究[J]. 林業科學， 1994， 30(5): 437-441，482.

TANG M， CHEN H， GUO J L， et al. A study of the ectomycorrhiza of poplar[J].ScientiaSilvaeSinicae， 1994， 30(5): 437-441， 482. (in Chinese with English abstract)

[4] 陳輝， 唐明. 楊樹菌根研究進展[J]. 林業科學， 1997， 33(2): 183-188.

CHEN H， TANG M. Advances in mycorrhizal research on poplar[J].ScientiaSilvaeSinicae， 1997， 33(2): 183-188. (in Chinese with English abstract)

[5] 弓明欽， 王鳳珍， 陳羽，等. 西南樺對菌根的依賴性及其接種效應研究[J]. 林業科學研究， 2000， 13(1): 8-14.

GONG M Q， WANG F Z， CHEN Y， et al. Mycorrhizal dependency and inoculant effects on the growth ofBetulaalnoidesseedlings[J].ForestResearch， 2000， 13(1): 8-14. (in Chinese with English abstract)

[6] 李桂蘭， 麻德業. 白樺幼苗外生菌根的初步研究[J]. 山西農業大學學報(自然科學版)， 2002， 22(2): 127-128.

LI G L， MA D Y. Ectomycorrhizal formation in seedlings ofB.platyphyllaSuk[J].JournalofShanxiAgriculturalUniversity(NaturalScienceEdition)， 2002， 22(2): 127-128. (in Chinese with English abstract)

[7] SIMARD S W， MOLINA R， SMITH J E， et al. Shared compatibility of ectomycorrhizae onPseudotsugamenziesiiand B.[J].CanadianJournalofForestResearch， 1997， 27(3): 331-342.

[8] JONES M D， DURALL D M， HARNIMAN S M K. Ectomycorrhizal diversity onBetulapapyriferaandPseudotsugamenziesiiseedlings grown in the greenhouse or outplanted in single-species and mixed plots in southern British Columbia[J].KluwerAcademicPublishers，1997，27(11):1872-1889.

[9] 樊永軍. 內蒙古地區四種樹木外生菌根形態多樣性及分子鑒定[D]. 呼和浩特: 內蒙古農業大學， 2010.

FAN Y J. Diversity analysis and molecular identification of ectomycorrhizae of several dominant tree species in Inner Mongolia Area[D]. Hohhot: Inner Mongolia Agricultural University， 2010.

[10] AGERER R. Characterization of ectomycorrhiza[M]// NORRIS J R， READ D J， VARMA A K. Techniques for the study of mycorrhiza[M]. Amsterdam: Academic Press， 1991.

[11] HAUG I， PRITSCH K. Ectomycorrhizal types of spruee (PiceaabiesCL.karst.) in the Blank forest: A microscopical alas[M]. Tubingen: Kernforschungszentrun Karlsruhe， 1992: 71-89.

[12] JAKUCS E， KOVCS GM， SZEDLAY G， et al. Morphological and molecular diversity and abundance of tomentelloid ectomycorrhizae in broad-leaved forests of the Hungarian Plain[J].Mycorrhiza， 2005， 15(6): 459-470.

[13] GARDES M， BRUNS T D. Community structure of ectomycorrhizal fungi in aPinusmuricata， forest: above-and below-ground views[J].CanadianJournalofBotany， 1996， 74(10): 1572-1583.

[14] GARDES M， BRUNS T D. ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes: application to the identification of mycorrhizae and rusts[J].MolecularEcology， 1993， 2(2): 113.

[15] WHITE T J， BRUNS T D， LEE S B， et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]// INNIS M A， GELFAND D H， SNINSKY J J. PCR Protocols: a guide to methods and applications. New York: Academic Press Inc.， 1990: 315-322.

[16] 樊永軍， 閆偉， 王黎元. 賀蘭山地區青海云杉外生菌根的形態類型及分子鑒定[J]. 林業科學， 2011， 47(6):108-113.

FAN Y J， YAN W， WANG L Y. Morphological type and molecular identification of ectomycorrhizae onPiceacrassifoliain Helan Mountain[J].ScientiaSilvaeSinicae， 2011， 47(6): 108-113. (in Chinese with English abstract)

[17] 樊永軍， 閆偉. 內蒙古地區白樺外生菌根形態類型及分子鑒定[J]. 西北植物學報， 2013， 33(11): 2209-2215.

FAN Y J， YAN W. Morphological type and molecular identification of ectomycorrhizae onBetulaplatyphyllain Inner Mongolia Area[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica， 2013， 33(11): 2209-2215. (in Chinese with English abstract)

[18] 弓明欽， 仲崇祿，陳羽， 等. 菌根型食用菌及其半人工栽培[M]. 廣州: 廣東科技出版社中國林業出版社， 2007.

[19] 郭尚， 周林. 菌根食藥用菌研究[M]. 北京: 中國農業科技出版社， 2017.

MorphologicaltypeandmolecularidentificationofectomycorrhizaonPinussylvestrisvar.mongolica

ZHANG Wenquan1， LUO Guotao1， YU Yang2， YAN Wei3，*

(1.KailiUniversity，Kaili556011，China; 2.ChinaInstituteofGeo-EnvironmentMonitoring，Beijing100081，China; 3.CollegeofForestry，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Hohhot010018，China)

The primary study on the diversity of ectomycorrhiza associated withPinussylvestrisvar mongolica in Inner Mongolia surrounding area was investigated using morphological, anatomical and molecular method， and the sequences obtained were blasted using GenBank. The results indicated that there were 19 species different ectomycorrhizas onPinussylvestrisvar. mongolica in Inner Mongolia area. Among these 19 species ectomycorrhizas fungi， 3 species belong to Ascomycotina and the rest species belong to Basidiomycotina， they belong respectively toCortinarius，Inocybe，Suillus，Sebacina，Russula，Lactarius，Tomentella，Hebeloma，Cenococcum，Tuber，Tricholoma. The results showed that the diversity of ectomycorrhizas onPinussylvestrisvar. mongolica was high， and it was different with results identified by fruiting body associated withPinussylvestrisvar. mongolica.

Pinussylvestrisvar. mongolica; ectomycorrhiza; morphological and anatomical characteristics; molecular identification; ITS

S718.81

A

1004-1524(2017)10-1678-08

（責任編輯侯春曉)