EoNPV對灰茶尺蠖的致病特性及高效毒株篩選

唐美君，郭華偉，葛超美，殷坤山，肖 強

(1.中國農業科學院 茶葉研究所， 浙江 杭州 310008； 2.農業部茶葉質量安全控制重點實驗室，浙江 杭州 310008)

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(10): 1686-1691

唐美君，郭華偉，葛超美，等. EoNPV對灰茶尺蠖的致病特性及高效毒株篩選[J].浙江農業學報，2017，29(10)： 1686-1691.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.10.13

2017-04-11

國家重點研發計劃(2016YFD0200902)；浙江省公益性技術應用研究計劃(2014C32095)

唐美君(1972—)，女，江蘇丹徒人，推廣研究員，主要從事茶樹病蟲防治技術研究。E-mail: tmjtea@tricaas.com

EoNPV對灰茶尺蠖的致病特性及高效毒株篩選

唐美君1，2，郭華偉1，2，葛超美1，殷坤山1，肖 強1，2

(1.中國農業科學院 茶葉研究所， 浙江 杭州 310008； 2.農業部茶葉質量安全控制重點實驗室，浙江 杭州 310008)

茶尺蠖核型多角體病毒(Ectropisobliquanucleopolyhedronviruses，EoNPV)是茶尺蠖的重要天敵。灰茶尺蠖(EctropisgrisescensWarren)是茶尺蠖的近緣種，也是茶樹主要害蟲。為了探明應用EoNPV防控灰茶尺蠖的效果，發揮其對灰茶尺蠖的生物防治作用，通過生物測定，研究了EoNPV對灰茶尺蠖的致病特性，并進行了高效毒株的篩選。結果表明，EoNPV對灰茶尺蠖1齡幼蟲致病力最強，2×104～2×108PIB·mL-1處理對1齡幼蟲的致死率達82.7%～100%；對灰茶尺蠖2齡幼蟲的LC50值為2.32×106PIB·mL-1(飼毒后9 d)；對不同代別灰茶尺蠖的致病力有明顯差別，以第2代為最高。從用灰茶尺蠖連續增殖5代的病毒樣品中，篩選出高效毒株QF4，該毒株對灰茶尺蠖致死率比原始毒株提高51.5%，致死中時間縮短1.5 d。研究表明，應用EoNPV防治灰茶尺蠖最適宜在第2代1齡期施用；QF4可作為病毒生產用毒株。

EoNPV；灰茶尺蠖；致病特性；高效毒株；

茶尺蠖核型多角體病毒(Ectropisobliquanucleopolyhedronviruses，EoNPV)自1980年在茶尺蠖(EctropisobliquaProut)上首次發現以來[1]，一直是茶園生物防治研究的重點，其生物學特性[2-5]、制劑研制[6-7]、田間應用技術[8]等方面均得到了深入研究，并逐步實現了商品化，在出口茶和有機茶生產基地得到推廣應用，取得了良好的防治效果[9]。但近年來研究發現，EoNPV對茶尺蠖不同地理種群的致病力存在較大差異[10]，對很多地理種群(湖北、湖南、河南、浙江的大部分地區等)的防效不理想，田間病毒致死率僅20%～30%。進一步研究表明，茶尺蠖不同地理種群已分化為2個種，即茶尺蠖(E.obliquaProut)和灰茶尺蠖(E.grisescensWarren)[11]。這兩種尺蠖幼蟲期外形相像，在生物學特性上也極其相似，肉眼幾乎難以區分，過去一直統稱為茶尺蠖。迄今為止，EoNPV對灰茶尺蠖的致病性尚未有研究報道。試驗表明，灰茶尺蠖也能被茶尺蠖核型多角體病毒感染，但感染后死亡率與茶尺蠖相比存在較大差異。為了明確茶尺蠖核型多角體病毒對灰茶尺蠖的致病特性，提高病毒的防治效果，為田間應用EoNPV防治灰茶尺蠖提供依據，我們測定了不同病毒液濃度、不同蟲齡和不同代別下EoNPV對灰茶尺蠖的致病力，并開展了高效毒株篩選的初步研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

灰茶尺蠖幼蟲采集于浙江衢州茶園(118.88°E，28.97°N)，茶尺蠖幼蟲采集于杭州余杭區茶園(119.90°E，30.39°N)，室內連續飼養2代以上供試。EoNPV為中國農業科學院茶葉研究所實驗室保存的EoNPV原液冷藏樣品，經室內活體繁殖獲得。尺蠖飼養及病毒繁殖提取方法同文獻[9]。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物測定方法

病毒劑量和蟲齡試驗：EoNPV使用劑量設2×108、2×107、2×106、2×105、2×104PIB·mL-15種處理，分別對灰茶尺蠖1齡、2齡、3齡幼蟲進行室內活性測定，以清水處理作對照。

不同代別試驗：分別設第1代、第2代、第3代、第4代、第5代5種處理，采用浸葉法以1齡灰茶尺蠖幼蟲、2×106PIB·mL-1的病毒使用劑量進行活性測定。不同蟲齡和劑量的試驗均在(24±0.5)℃恒溫人工氣候室或恒溫培養箱中進行，不同代別試驗模擬田間試驗，在自然溫度下進行。上述各處理均設3次重復，每重復20頭蟲以上。幼蟲開始死亡后，每天記錄死蟲數。統計計算逐日累計死亡率，并采用DPS分析軟件進行差異顯著性分析和LC50、LT50計算。

1.2.2 毒株篩選方法

將EoNPV原始毒株稀釋成1×107PIB·mL-1的病毒液。從田間采集新鮮茶樹嫩梢，將嫩梢在已配好的病毒液中浸濕后晾干備用。取室內大量飼養的2齡灰茶尺蠖幼蟲，用帶病毒的嫩梢飼養3 d，然后用無病毒的葉片繼續飼養。待幼蟲開始死亡后，每天將蟲尸收集在廣口瓶(250 mL)中。經病毒提純定量后，即獲得病毒小樣QF1。用QF1重復上述增殖步驟，再次提純獲得的病毒小樣即為QF2，以此類推，共獲得QF1、QF2、…、QF66個小樣。放置在冰箱內冷藏備用。

1.2.3 毒效測定方法

將各病毒樣品分別稀釋至1×106PIB·mL-1。剪取新鮮干凈茶梢，在病毒液中浸濕后自然晾干。剪下帶病毒茶梢放入玻璃罐頭瓶中，分別接入相應供試種群的2齡幼蟲，在(24±0.5)℃條件下飼養。飼毒3 d后，更換無病毒葉片飼養，觀察記錄死蟲數與活蟲數。每處理設3次重復，每重復接蟲20頭以上。統計逐日累計死亡率和LT50。

2 結果與分析

2.1茶尺蠖核型多角體病毒對灰茶尺蠖的致病特性

2.1.1 EoNPV不同使用劑量對不同齡期灰茶尺蠖幼蟲的致病力

測定了EoNPV不同使用劑量(2×108、2×107、2×106、2×105、2×104PIB·mL-1)對灰茶尺蠖1～3齡幼蟲的致死率，圖1顯示，使用劑量越大、蟲齡越小則幼蟲死亡率越高、死亡速率越快。高劑量處理(2×107、2×108PIB·mL-1)對1～3齡幼蟲均有較高致死率，致死率在90%以上；2×106PIB·mL-1處理對1、2齡幼蟲可達100%致死率，但對3齡幼蟲致死率則不到20%；2×104、2×105PIB·mL-1處理對1齡幼蟲的致死率可達82.7%～95.4%，對2齡幼蟲的致死率下降為29.8%～76.1%，對3齡幼蟲則降至3.0%～11.4%(表1)。茶尺蠖核型多角體病毒對灰茶尺蠖的致病力隨病毒劑量的增大而增強，并隨灰茶尺蠖蟲齡的增加而下降。

EoNPV對灰茶尺蠖的致病力呈明顯的劑量效應，以圖1中2齡幼蟲飼毒9 d后的數據計算，EoNPV對灰茶尺蠖2齡幼蟲的LC50值為2.32×106PIB·mL-1(95%置信限1.37×106～3.98×106PIB·mL-1)。與EoNPV對茶尺蠖2齡幼蟲的LC50值(1.26×103PIB·mL-1)[9]相比，LC50值提高了近2 000倍，說明EoNPV對灰茶尺蠖的致病力低于茶尺蠖。

2.1.2 EoNPV對不同代別灰茶尺蠖幼蟲的致病力

分別以灰茶尺蠖第1、2、3、4、5代1齡幼蟲為對象，用2×106PIB·mL-1的EoNPV進行活性測定，結果表明，第1、2、5代幼蟲期死亡率可達100%，極顯著高于第3、4代；幼蟲死亡速率以第2代為最快，LT50值(11.8 d)為最小(表2、圖2)。不同代別之間死亡率差異的原因主要與氣溫有關，第3、4代灰茶尺蠖發生于7、8月份，氣溫較高，而高溫對病毒有明顯的抑制作用[3，8]。且高溫季節灰茶尺蠖生長發育快，尚未發病即化蛹。

圖1 不同EoNPV濃度處理對灰茶尺蠖1-3齡幼蟲的致死動態Fig.1 Lethal dynamics for 1st-3rd instar of Ectropis grisescens infected with different concentrations of EoNPV

表1不同EoNPV濃度處理對灰茶尺蠖1-3齡幼蟲的致死率和LT50

Table1Lethality rate and LT50for 1st-3thinstar ofE.grisescensinfected with different concentrations of EoNPV

EoNPV濃度ConcentrationofEoNPV/(PIB·mL-1)幼蟲期死亡率Larvalmortality/%1齡1st2齡2nd3齡3rdLT50/d1齡1st2齡2nd3齡3rd2×108100aA100aA100aA32391072×107100aA100aA900aA39641302×106100aA100aA242bB61105—2×105954aA761bB30cC94145—2×104827bB298cC114cBC129——

同列數據后沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，沒有相同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

The values in the same column followed by different lowercase letters or uppercase letters showed significance at the level of 0.05 or 0.01.

表2不同代別下EoNPV對灰茶尺蠖的防治效果

Table2Control effect of EoNPV on the larvae of different generations ofE.grisescens

代別Generation幼蟲期死亡率Larvalmortality/%差異顯著性Significance最終死亡率Finalmortality/%差異顯著性SignificanceLT50/d相關系數Correlationcoefficent1100A100A136097472100A100A118099173791B963B149096434784B897C160098385100A100A12909185

圖2 不同代別灰茶尺蠖感染EoNPV后的死亡動態Fig.2 Lethal dynamics for the larvae of different generations of E. grisescens with the infection of EoNPV

因此，田間應用EoNPV防治灰茶尺蠖以第2代為最佳，其次為第5代和第1代。

2.2茶尺蠖核型多角體病毒高效毒株的篩選

毒株篩選試驗結果(表3)表明，QF4毒株的效果最好，12 d內死亡率達100%，致死中時間僅7.7 d，比其他毒株的平均值縮短3.5 d。用QF4毒株分別對灰茶尺蠖和茶尺蠖進行了毒效試驗，結果表明，無論對灰茶尺蠖還是茶尺蠖，QF4毒株均比原始毒株EoNPV(CK)的效果好，致死中時間短(表4、表5)。

將篩選出的高效毒株QF4和原始毒株均用灰茶尺蠖進行大量繁殖，獲得相應的大量增殖病毒樣品，記為QF4(Q)和QV。分別用這兩個大量增殖樣品對灰茶尺蠖和茶尺蠖進行生測，結果(表6)表明，QF4(Q)對灰茶尺蠖和茶尺蠖的毒效均有提高，QF4(Q)用于防治灰茶尺蠖，不僅死亡速度比對照快，致死中時間縮短1.5 d，而且最終防治效果比對照提高51.5%；用于防治茶尺蠖，QF4(Q)與QV最終防治效果相同，但死亡速度加快，致死中時間縮短1.6 d。

表3EoNPV不同毒株對灰茶尺蠖的毒效測定

Table3The evaluation of the effect of different strains of EoNPV againstE.grisescens

EoNPV毒株EoNPVstrain供試總蟲數Totalnumberofinsectstested重復Replication飼毒后不同時間死亡率Mortalityatdifferenttimesafterinoculation/%8d10d12d死亡率(y)對時間(x)的直線回歸式Thelinearregressionofmortality(y)versustime(x)相關系數Correlationcoefficent(r)致死中時間Medianlethaltime(LT50)QF1863185513783y=1649x-1165809794101QF285396275519y=1046x-765409922121QF395334299585y=1137x-810709767115QF4843391798100y=1316x-51910995277QF586394291638y=1369x-1066209890114QF695364402674y=1101x-712109305111

表4EoNPV-QF4毒株對灰茶尺蠖的毒效

Table4Effect of EoNPV-QF4strain againstE.grisescens

毒株strain供試總蟲數Totalnumberofinsectstested重復Replication飼毒后不同時間死亡率Mortalityatdifferenttimesafterinoculation/%8d10d12d死亡率(y)對時間(x)的直線回歸式Thelinearregressionofmortality(y)versustime(x)相關系數Correlationcoefficent(r)致死中時間Medianlethaltime(LT50)QF4963246612890y=160x-10020992294EONPV(CK)105300160y=88x-89309915158

表5EoNPV-QF4毒株對茶尺蠖的毒效

Table5Effect of EoNPV-QF4strain againstE.obliqua

毒株strain供試總蟲數Totalnumberofinsectstested重復Replication飼毒后不同時間死亡率Mortalityatdifferenttimesafterinoculation/%4d7d8d死亡率(y)對時間(x)的直線回歸式Thelinearregressionofmortality(y)versustime(x)相關系數Correlationcoefficent(r)致死中時間Medianlethaltime(LT50)QF41043225842950y=200x-6460970757EoNPV(CK)107327431758y=211x-10510969074

表6EoNPV-QF4大量增殖樣品對灰茶尺蠖和茶尺蠖的毒效

Table6Effect of the mass multiplication sample of EoNPV-QF4strain againstE.grisescensandE.obliqua

3 結論與討論

昆蟲桿狀病毒具有很強的宿主專化性。一般來說，一種NPV只能感染一種蟲，但也有例外，如AcMNPV(苜蓿銀紋夜蛾NPV)可感染苜蓿銀紋夜蛾、甜菜夜蛾、小菜蛾、斜紋夜蛾等30多種害蟲。過去一直認為，茶尺蠖是EoNPV的唯一宿主，而本研究結果表明，灰茶尺蠖也是EoNPV的宿主之一。灰茶尺蠖田間分布區域廣于茶尺蠖[12]，在有些省份兩種尺蠖還混合發生，同時這兩種尺蠖的幼蟲肉眼難以區分。了解EoNPV對灰茶尺蠖的致病特性，篩選應用高效毒株，對灰茶尺蠖和茶尺蠖的生物防治十分有益。本研究首次明確了EoNPV對灰茶尺蠖的致病特性，并篩選出1株高效毒株，研究結果對EoNPV生產與應用有重要的實際意義和參考價值。

根據EoNPV對灰茶尺蠖的致病特性，使用EoNPV防治灰茶尺蠖時應注意病毒的使用濃度、使用蟲齡和代別等方面。從本文試驗結果來看，田間應用時應著重在低齡期(1齡期)施用，第2代防治為最佳。這與EoNPV防治茶尺蠖的研究結果[8]相似，但是防治期有所提前，防治齡期更小。本研究初步篩選出了1個高效毒株，但其高效的機制尚不清楚，是否是病毒的致病基因發生了變化還有待深入研究。

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PathogeniccharactersofEctropisobliquanucleopolyhedrovirusesonEctropisgrisescensWarrenandscreeningofhighefficientstrain

TANG Meijun1，2， GUO Huawei1，2， GE Chaomei1， YIN Kunshan1， XIAO Qiang1，2

(1.TeaResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310008，China; 2.KeyLaboratoryofTeaQualityandSafetyControl，MinistryofAgriculture，Hangzhou310008，China)

Ectropisobliquanucleopolyhedroviruses (EoNPV) is an effective pathogen ofEctropisobliquaProut larvae.EctropisgrisescensWarren is a related species ofE.obliqua， which is the major pest of tea plant. To investigate the using of EoNPV againstE.grisescens， the pathogenic characters of EoNPV onE.grisescensand screening of high efficient strain were studied. The results showed the 1stinstar larvae ofE.grisescenswas the most sensitive to EoNPV， the mortality was 82.7%-100% infected with EoNPV in the concentration of 2×104-2×108PIB·mL-1. The value of LC50for the 2ndinstar larvae was 2.32×106PIB·mL-1on the 9thday after inoculation. The virulence of EoNPV against the larvae of 2ndgeneration ofE.grisescenswas highest among the 1st-5thgenerations. The strain QF4was screened as high efficient strain through bioassay among all the strains which was extracted from the dead larvae ofE.grisescensinfected by EoNPV constantly. The mortality rate ofE.grisescensinfected by this virus strain increased by 51.5% than that of original strain， and the median lethal time was shortened by 1.5 days. Thus it is suggested that the suitable period of spraying in the field could be at the 1stinstar larvae of 2ndgenerations and the QF4stain could be used to multiply the virus.

EoNPV;Ectropisgrisescens; pathogenic character; high efficient strain

S435.711

A

1004-1524(2017)10-1686-06

（責任編輯張 韻)