懷玉山高山馬鈴薯莖尖再生苗6種病毒的DAS-ELISA檢測與分析

尹明華，劉 燕，郁雪婷，李遠芳，周 榕，范亞紅，羅玉婕，萬小霞

(上饒師范學院 生命科學學院，江西 上饒 334001)

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(10): 1699-1705

尹明華，劉燕，郁雪婷，等. 懷玉山高山馬鈴薯莖尖再生苗6種病毒的DAS-ELISA檢測與分析[J].浙江農業學報，2017，29(10)： 1699-1705.

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2017-04-01

上饒師范學院2017年大學生創新創業訓練計劃項目(2017-CX-72)

尹明華(1973—)，女，江西永新人，碩士，副教授，主要從事植物生物技術方面的研究。E-mail: yinminghua04@163.com

懷玉山高山馬鈴薯莖尖再生苗6種病毒的DAS-ELISA檢測與分析

尹明華，劉 燕，郁雪婷，李遠芳，周 榕，范亞紅，羅玉婕，萬小霞

(上饒師范學院 生命科學學院，江西 上饒 334001)

對懷玉山高山馬鈴薯莖尖再生苗6種病毒(馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯M病毒和馬鈴薯A病毒)進行了DAS-ELISA檢測與分析，并比較不同莖尖脫毒方法的效率，旨在確定懷玉山高山馬鈴薯的病毒種類，并篩選出懷玉山高山馬鈴薯脫毒苗。結果表明，懷玉山高山馬鈴薯感染的病毒包括馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯M病毒和馬鈴薯A病毒6種。“單純的莖尖培養”以及“莖尖培養→熱處理→莖尖培養”只能脫除部分病毒，而“莖尖培養→熱處理→莖尖培養→熱處理→莖尖培養”可脫除全部6種病毒。本試驗成功獲得了脫毒效果較好的編號為5-1-2和6-4-1以及脫毒效果最好的編號為5-3-2和6-2-2的懷玉山高山馬鈴薯莖尖再生脫毒苗。本試驗結果為懷玉山高山馬鈴薯脫毒苗的工業化生產及其主糧化背景下高山馬鈴薯的產業化發展提供了技術支撐和理論依據。

懷玉山高山馬鈴薯；莖尖再生苗；病毒；雙抗體夾心酶聯免疫吸附測定法

2015年2月1日，“中央一號”文件明確提出，將馬鈴薯列為水稻、小麥、玉米之外的第四大主糧作物[1]。在主糧化背景下，馬鈴薯產業化是必然選擇。懷玉山高山馬鈴薯又叫麻籽洋芋，主要種植區域為玉山縣懷玉鄉境內的玉峰村、洋塘村、金坪村、隴首村、關口村5個行政村。懷玉山高山馬鈴薯塊莖含有豐富的蛋白質、賴氨酸和色氨酸、鉀、鋅、鐵、VC、VB1、VB2等，且淀粉和脂肪含量低，不含還原糖，適合“三高”人群食用。另外，麻籽洋芋塊莖所含的纖維素細嫩，對胃腸黏膜無刺激作用，有解痛或減少胃酸分泌功能。因此，懷玉山高山馬鈴薯具有和中養胃、健脾利濕、降糖降脂、美容養顏、防治胃癌等功效。2013年4月，懷玉山高山馬鈴薯獲準為國家地理標志農產品。懷玉山高山馬鈴薯的繁殖主要通過無性繁殖的方式，長期的無性繁殖容易造成病毒在植物體內逐代積累，從而發生種性退化，造成大幅減產和品質下降，并且感病薯塊在貯運期間也易發生腐爛，對生產和銷售都造成巨大損失。因此，如何對懷玉山高山馬鈴薯進行脫毒，成為懷玉山高山馬鈴薯實現產業化的重中之重。

目前已知的馬鈴薯病毒約有40余種，因國家和地域分布而異，但其中分布廣泛、為害嚴重的病毒有馬鈴薯卷葉病毒(potato leaf roll virus，PLRV)、馬鈴薯Y病毒(potato virus Y，PVY)、馬鈴薯X病毒(potato virus X，PVX)、馬鈴薯S病毒(potato virus S，PVS)、馬鈴薯M病毒(potato virus M，PVM)和馬鈴薯A病毒(potato virus A，PVA)[2-3]。利用組織培養莖尖脫毒技術培育試管苗來繁育馬鈴薯脫毒試管苗，是目前克服因馬鈴薯病毒造成種性退化、提高產量和品質的主要途徑[4]。在馬鈴薯脫毒苗培育中，病毒檢測是保證馬鈴薯莖尖再生苗脫毒效果的關鍵。一般而言，病毒檢測不只是針對馬鈴薯莖尖再生苗某一病毒進行檢測，而更多是針對馬鈴薯莖尖再生苗幾種主要病毒同時進行檢測，從大量的樣品中選出生產上可利用的馬鈴薯脫毒苗[5]。DAS-ELISA(雙抗體夾心板酶聯免疫吸附法)是鑒定馬鈴薯莖尖再生苗是否脫除多種病毒的常規方法[6]，具有靈敏、快速、準確、操作簡單等優點，適于鑒定大量樣品的常規病毒鑒定，能快速而準確地檢測出馬鈴薯中含有的病毒類型，早已被列為國家標準檢測方法(GB/18133-2012)[3，7]。目前，DAS-ELISA成功應用于番茄花葉病毒[8]、葡萄卷葉病毒Ⅲ[9]等園藝植物的病毒檢測工作。關于馬鈴薯病毒DAS-ELISA檢測的研究也有報道[5-6，10]，但有關懷玉山高山馬鈴薯莖尖脫毒苗的培育及其脫毒效果的DAS-ELISA 檢測尚未見報道。本研究以懷玉山高山馬鈴薯塊莖為材料，切取其莖尖獲得再生苗并對其進行PLRV、PVY、PVX、PVS、PVM和PVA的檢測，探究懷玉山高山馬鈴薯感染的病毒種類，篩選出不含PLRV、PVY、PVX、PVS、PVM和PVA 6種病毒的脫毒苗，旨在為懷玉山高山馬鈴薯脫毒苗的工業化生產及其主糧化背景下高山馬鈴薯產業化發展提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

懷玉山高山馬鈴薯塊莖(由上饒市紅日農業開發有限公司提供)。

1.2 方法

1.2.1 懷玉山高山馬鈴薯塊莖的催芽

將懷玉山高山馬鈴薯塊莖置于25 ℃恒溫培養箱內黑暗催芽，待芽長至6～8 cm時，選取強壯的芽切下，用于其無菌體系的建立。

1.2.2 懷玉山高山馬鈴薯無菌體系的建立

將懷玉山高山馬鈴薯塊莖萌發的芽摘下，自來水洗凈，用飽和無磷洗衣粉浸泡1 h后，帶進超凈工作臺內，先用70%乙醇消毒30 s，無菌水洗滌3次，再用0.1%氯化汞消毒8 min，無菌水洗滌3次，接種到MS固體培養基上。待新芽長出，即表明無菌體系建成。

1.2.3 懷玉山高山馬鈴薯的快繁

將無菌體系的芽切成1.5～2.0 cm長，繼續接種到MS固體培養基上。如此反復，就可獲得較多的試管苗。

1.2.4 懷玉山高山馬鈴薯試管苗莖尖切取及其再生苗病毒的DAS-ELISA檢測

取生長時間約為20～30 d的懷玉山高山馬鈴薯試管苗，在40倍的顯微鏡下用解剖刀與解剖針剝取大小約為 0.2～0.3 mm(含1～2個葉原基)的莖尖，接種在MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA的固體培養基上。莖尖長出肉眼可見的綠色小點即視為成活，成活的莖尖長出帶有2個以上葉片的小植株即視為莖尖已成苗。莖尖成苗后轉移到MS固體培養基上繼續生長20～30 d，就可對每個莖尖的成苗編號，并分別繼代快繁，待苗數量較多時，則對編號的莖尖再生苗進行病毒的DAS-ELISA檢測。DAS-ELISA檢測方法具體見試劑盒說明書，并參考張志軍等[3]提供的方法。馬鈴薯病毒DAS-ELISA檢測試劑盒購自美國Agdia公司。

1.2.5 懷玉山高山馬鈴薯試管再生苗的病毒DAS-ELISA檢測

取第一次莖尖脫毒效果較好的懷玉山高山馬鈴薯莖尖再生苗，按照馮光惠等[11]和Tomassoli等[12]的方法，在光照培養箱內每天升溫1 ℃，持續15 d，然后每天在溫度(38±1)℃，光照強度 3 000 lx 條件下培養16 h，在溫度18 ℃條件下暗培養8 h，如此變溫熱處理4周以鈍化病毒。最后在40倍的顯微鏡下繼續剝取大小約為 0.2～0.3 mm(含1～2個葉原基)的莖尖，接種在MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA的固體培養基上。莖尖第二次成苗后轉移到MS固體培養基上繼續生長20～30 d，就可對每個莖尖的成苗再次編號，并分別繼代快繁，待苗數量較多時，則對第二次莖尖再生苗進行病毒的DAS-ELISA檢測，檢測方法同上。

取第二次莖尖脫毒效果較好的懷玉山高山馬鈴薯莖尖再生苗，在光照培養箱內每天升溫1 ℃，持續15 d，然后每天在溫度(38±1)℃，光照強度 3 000 lx 條件下培養16 h，在溫度18 ℃條件下暗培養8 h，如此變溫熱處理4周以鈍化病毒。最后在40倍的顯微鏡下繼續剝取大小約為0.2～0.3 mm(含1～2個葉原基)的莖尖，接種在MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA的固體培養基上。莖尖第三次成苗后轉移到MS固體培養基上繼續生長20～30 d，而后對每個莖尖的成苗再次編號，并分別繼代快繁，待苗數量較多時，則對第三次莖尖再生苗進行病毒的DAS-ELISA檢測，檢測方法同上。以上試驗重復3次，所有數據表示為平均值。

2 結果與分析

2.1懷玉山高山馬鈴薯試管苗第一次莖尖再生苗病毒的DAS-ELISA檢測

對懷玉山高山馬鈴薯試管苗第一次莖尖再生苗進行PLRV、PVY、PVX、PVS、PVM和PVA 6種病毒的DAS-ELISA檢測，發現樣本1-9均未能脫除PVX病毒；樣本1、2、4未能脫除PVY病毒；樣本1未能脫除PLRV病毒；樣本1、2、3、4、8、9未能脫除PVS病毒；樣本1、2、4、8未能脫除PVA病毒；樣本1未能脫除PVM病毒(表1)。因此，常規的莖尖培養完全脫除懷玉山高山馬鈴薯的PVX病毒，而PVS的脫除率為44.4%，PVA的脫除率為55.6%，PVY的脫除率為66.6%，PLRV和PVM的脫除率均為88.9%。因此，常規的0.2～0.3 mm莖尖脫毒并不能完全脫除懷玉山高山馬鈴薯PLRV、PVY、PVX、PVS、PVM和PVA 6種病毒。但樣本5、6、7只帶有PVX一種病毒，其他5種病毒已經脫除。

2.2懷玉山高山馬鈴薯試管苗“莖尖培養→熱處理→莖尖培養”再生苗的病毒DAS-ELISA檢測

在2.1節中，樣本1未能脫除6種病毒，樣本5、6、7只帶有PVX一種病毒。然后對樣本1、樣本5和樣本6第一次莖尖再生苗進行熱處理后再次切取莖尖培養，最后對其第二次莖尖再生苗進行PLRV、PVY、PVX、PVS、PVM和PVA 6種病毒的DAS-ELISA檢測，發現樣本1-1脫除了PVM病毒；樣本1-2、1-3、1-4、1-5和樣本6-4對6種病毒的脫除還是沒有效果；樣本5-1沒有脫除PVX、PVY和PVA病毒，但脫除了PLRV、PVS和PVM病毒；樣本5-3和樣本6-2沒有脫除PVY病毒，但脫除了PLRV、PVX、PVS、PVM和PVA 5種病毒。這表明，在第1次病毒DAS-ELISA檢測時，樣本5和樣本6有些病毒未被檢出，但第二次檢測時被有效檢出，如樣本5-1仍帶有PVX、PVY和PVA，樣本6-4仍帶有6種病毒。通過“莖尖培養→熱處理→莖尖培養”和病毒的第二次DAS-ELISA檢測，樣本5-3和樣本6-2仍帶有PVY病毒，原先帶有的PVX病毒被脫除了(表2)。綜上所述，經過“莖尖培養→熱處理→莖尖培養”后，PVX病毒的脫除率為22.2%，PVY的脫除率為0，PLRV、PVS和PVA的脫除率均為33.3%，PVM的脫除率均為44.4%。

表1懷玉山高山馬鈴薯第一次莖尖再生苗的病毒DAS-ELISA檢測結果

Table1Results of virus DAS-ELISA detection of the first shoot-tip regenerated plantlets of Huaiyushan high mountain potato

酶聯板序號AssayplateNo．樣本編號SampleNo．馬鈴薯X病毒PVX馬鈴薯Y病毒PVY馬鈴薯卷葉病毒PLRV馬鈴薯S病毒PVS馬鈴薯A病毒PVA馬鈴薯M病毒PVM47116480461087602990559020048217900423010503530287009649310630098012202590171011050417610148013302590311010151506050090016901730096008452618890103010401730157008053714070081010301550117008854813920091011602390178010155913340105009402460105009491陽性對照Positivecontrol06830205010901250310029892陽性對照Positivecontrol04920278010501110281027393陰性對照Negativecontrol01020070008501040087008094陰性對照Negativecontrol00900070010201230084009295空白對照Blankcontrol00890065008001210077008496空白對照Blankcontrol008800690080011300770076

在波長405 nm處讀數，下劃實線的數值為病毒值高于陰性對照2倍，下劃虛線的數值為病毒值低于陰性對照2倍但是高于陰性對照1.8倍，不劃線的數值為符合國家標準的脫毒材料，帶方框的數值為符合國家標準且效果最好的脫毒材料。下同。

Values were read at the wavelength of 405 nm; The value with the lower real line was two times higher than that of the negative control; The value with the lower dashed line was 2 times lower than that of the negative control， but higher than that of the negative control by 1.8 times; Non marking values indicate that they are virus-free materials which meet national standards; The value within the box is in line with national standards， which has the best results. The same as below.

表2懷玉山高山馬鈴薯第二次莖尖再生苗的病毒DAS-ELISA檢測結果

Table2Results of virus DAS-ELISA detection of the second shoot-tip regenerated plantlets of Huaiyushan high mountain potato

酶聯板序號AssayplateNo．樣本編號SampleNo．馬鈴薯X病毒PVX馬鈴薯Y病毒PVY馬鈴薯卷葉病毒PLRV馬鈴薯S病毒PVS馬鈴薯A病毒PVA馬鈴薯M病毒PVM351?1126101310721016001560040361?2037801890958039001750089371?3016901421130008900880057381?4028003191534010003790053395?3006301080046002900370033406?2003408930032003500370029885?1082202280024006300550032896?4127901070092010000610076901?511570071070300840223012391陽性對照Positivecontrol11331094316205311263314892陽性對照Positivecontrol11471042316205891082319293陰性對照Negativecontrol00350039003800330046004194陰性對照Negativecontrol00300033003300340029002895空白對照Blankcontrol00320037003300280046003796空白對照Blankcontrol006900360036003600370048

2.3懷玉山高山馬鈴薯試管苗“莖尖培養→熱處理→莖尖培養→熱處理→莖尖培養”再生苗的病毒DAS-ELISA檢測

在2.2節中，樣本5-1仍帶有PVX、PVY和PVA，樣本6-4仍帶有6種病毒，樣本5-3和樣本6-2仍帶有PVY病毒。然后對樣本5-1、樣本6-4、樣本5-3和樣本6第二次莖尖再生苗進行熱處理后再次切取莖尖培養，最后對其第三次莖尖再生苗進行PLRV、PVY、PVX、PVS、PVM和PVA 6種病毒的DAS-ELISA檢測，發現樣本5-1-2、樣本5-3-2、樣本6-2-2和樣本6-4-1均脫除6種病毒，其中樣本5-1-2和樣本6-4-1為符合國家標準的脫毒材料，樣本5-3-2和樣本6-2-2為符合國家標準且效果最好的脫毒材料(表3)。綜上所述，經過“莖尖培養→熱處理→莖尖培養→熱處理→莖尖培養”后，6種病毒的脫除率均為100%。

表3懷玉山高山馬鈴薯第三次莖尖再生苗的病毒DAS-ELISA檢測結果

Table3Results of virus DAS-ELISA detection of the third shoot-tip regenerated plantlets of Huaiyushan high mountain potato

酶聯板序號AssayplateNo．樣本編號SampleNo．馬鈴薯X病毒PVX馬鈴薯Y病毒PVY馬鈴薯卷葉病毒PLRV馬鈴薯S病毒PVS馬鈴薯A病毒PVA馬鈴薯M病毒PVM745?1?2011201080124010801090103755?3?2009801000131010501050102766?2?2010401020127011201090109776?4?101050115011101130115010891陽性對照Positivecontrol11140168291401850291190892陽性對照Positivecontrol11400165294201770285197793陰性對照Negativecontrol01100113011701090112011794陰性對照Negativecontrol01030109011501070106011095空白對照Blankcontrol01010103010001040100010296空白對照Blankcontrol010701100103009101090100

3 討論

莖尖培養能夠脫除病毒的原理是病毒在植物體內的分布存在不均勻性，而在植物兩個生長點即莖尖和根尖含病毒量少或不含病毒，因為這兩個地方尚未形成維管束，而病毒一般是通過維管束傳播的。由于根尖易形成愈傷組織，而莖尖易形成芽，因此，在脫毒時一般選取莖尖作為脫毒材料。選取莖尖時，生長點附近的組織要盡量少，長度約0.1～0.3 mm，既保證莖尖的成活，也保證脫除大多數病毒[13]。劉江娜等[14]剝取馬鈴薯大西洋、中聯紅、夏波蒂和隴薯三號4個品種無菌苗帶有2個直徑約為0.1～0.2 mm葉原基的莖尖，分別可獲得 28.05%、13.60%、13.65% 和 23.40% 脫毒效果較好的脫毒苗。徐茜等[15]認為馬鈴薯新品種渝馬鈴薯3號莖尖大小為帶1～2個長約0.2～0.3 mm葉原基為好。但在本試驗中，常規的0.2～0.3 mm莖尖脫毒并不能完全脫除懷玉山高山馬鈴薯PLRV、PVY、PVX、PVS、PVM和PVA 6種病毒。

莖尖培養與熱處理方法相結合脫除病毒已在許多植物上得到應用。Robert等[16]利用35～40 ℃熱處理結合莖尖培養，大蒜的洋蔥黃矮病毒脫除率可達90%以上。Tomassoli等[12]利用(38±1)℃，16 h·d-1熱處理結合莖尖培養，Capparisspinosa的Caper latent virus(CapLV)病毒脫除率為89%～93%。但Tan等[17]發現白天38 ℃/晚上 32 ℃的熱處理結合莖尖培養無法獲得梨脫毒苗，但利用白天42 ℃/晚上34 ℃的熱處理再結合莖尖培養能獲得較高的脫毒效果。因此，熱處理可以對病毒起到鈍化作用，如果先將莖尖再生苗進行熱處理后再次進行莖尖培養，可提高脫毒效果。本試驗對懷玉山高山馬鈴薯試管苗“莖尖培養→熱處理→莖尖培養”再生苗的病毒DAS-ELISA檢測結果表明，通過此方式仍然未能獲得懷玉山高山馬鈴薯試管苗脫除6種病毒的脫毒苗。但通過“莖尖培養→熱處理→莖尖培養→熱處理→莖尖培養”這種方式可獲得懷玉山高山馬鈴薯試管苗脫除6種病毒的脫毒苗。本試驗成功獲得了脫毒效果較好的編號為5-1-2和6-4-1以及脫毒效果最好的編號為5-3-2和6-2-2的懷玉山高山馬鈴薯莖尖再生脫毒苗。因此，對于懷玉山高山馬鈴薯帶毒種類較多的試管苗來說，只有通過2～3次重復切取莖尖結合1～2次重復熱處理方可完全清除其攜帶的6種病毒。

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DAS-ELISAdetectionandanalysisofsixkindsofvirusesinplantletsregeneratedfromHuaiyushanhighmountainpotatoshoot-tips

YIN Minghua， LIU Yan， YU Xueting， LI Yuanfang， ZHOU Rong， FAN Yahong， LUO Yujie， WAN Xiaoxia

(CollegeofLifeSciences，ShangraoNormalUniversity，Shangrao334001，China)

In order to determine the virus species and screen out its virus-free plantlets， 6 viruses (potato leafroll virus， potato virus Y， potato virus X， potato virus S， potato virus M and potato virus A) in plantlets regenerated from shoot-tips of Huaiyushan high mountain potato were detected and analyzed by DAS-ELISA， and the efficiency of different shoot tip detoxification methods were compared. The results showed that there were 6 viruses including potato leafroll virus， potato virus Y， potato virus X， potato virus S， potato virus M and potato virus A in Huaiyushan high mountain potato. Two methods such as “simple shoot tip culture” and “shoot tip culture→thermotherapy→shoot tip culture” can only remove parts of the viruses， while “shoot tip culture→thermotherapy→shoot tip culture→thermotherapy→shoot tip culture” could remove all 6 viruses. In this study， we successfully obtained the virus-free plantlets of Huaiyushan high mountain potato， of which No. 5-1-2 and No. 6-4-1 had better virus-free effect and No. 5-3-2 and No. 6-2-2 had the best virus-free effect. The results will help to provide technical support and theoretical basis for virus-free plantlet industrial production of Huaiyushan high mountain potato and its industrialization development under the background of the fourth major staple food.

Huaiyushan high mountain potato; plantlets regenerated from shoot-tips; virus; DAS-ELISA

S532

A

1004-1524(2017)10-1699-07

（責任編輯張 韻)