電噴霧離子遷移譜檢測氨基酸及多肽的研究

孔景臨 劉衛衛 丁俊杰 張 琳 李寶強 秦墨林 陳 創 李海洋

1(防化研究院， 北京 102205) 2(中國科學院大連化學物理研究所， 大連 116023)

研 究 報 告

電噴霧離子遷移譜檢測氨基酸及多肽的研究

孔景臨*1劉衛衛1丁俊杰1張 琳1李寶強1秦墨林1陳 創2李海洋2

1(防化研究院， 北京 102205)2(中國科學院大連化學物理研究所， 大連 116023)

建立了氨基酸及多肽的電噴霧離子遷移譜檢測方法。采用自制的電噴霧離子遷移譜裝置，在室溫條件下以甲醇為溶劑，空氣為漂移氣體，流速為1000 mL/min，電噴液流速為2L/min，測試了甘氨酸、胱氨酸、組氨酸、精氨酸4種氨基酸及緩激肽片段 (1～7) 和P物質2種多肽的離子遷移譜，計算出上述化合物的約化遷移率。離子遷移譜圖反映出化合物的結構信息，具有指紋譜特征。此裝置在1 min的檢測時間內對P物質的檢測靈敏度達到855 ng/mL。結果表明，電噴霧離子遷移譜可用于氨基酸及多肽類化合物的現場快速鑒定。

電噴霧; 離子遷移譜; 氨基酸; 多肽; 約化遷移率

2017-06-30收稿；2017-09-08接受

* E-mail: jlkong@sina.com

1 引 言

多肽是一類由氨基酸脫水縮合而成的化合物。自然界中多肽種類繁多，參與了生物體的生長、發育、免疫、代謝等多個環節。抗菌肽、生物調節劑以及有毒動植物中的多肽毒素等具有顯著的生物活性，是藥物開發研究關注的對象。同時，某些多肽(如芋螺毒素、槲寄生毒素)因具有在生化恐怖活動中被使用的風險而被列入美國衛生與公共福利部選擇劑清單和澳大利亞集團核心清單[1]。目前，對于多肽類化合物的檢測方法主要有高效液相色譜(HPLC)、毛細管電泳(CE)、質譜(MS)以及一些聯用技術，如液相色譜-質譜聯用(LC-MS)、毛細管電泳-質譜聯用(CE-MS)等。這些方法準確可靠，但都依賴大型實驗室設備，不滿足方便部署、響應快速、使用便捷的現場檢測要求，對多肽的現場快速檢測是反化學生物恐怖活動中排查各類可疑物質亟需的方法。

離子遷移譜(Ion mobility spectrometry, IMS)因能夠在常壓條件下工作，且具有探測靈敏度高、分析速度快、能耗低、結構簡單、易于小型化等優點，成為偵檢化學戰劑、爆炸物、毒品等的常用分析手段[2]。目前離子遷移譜儀是軍事上部署使用最多的點源化學檢測裝備[3]。但現有裝備主要以放射源(如63Ni)為電離源，不僅存在著使用和處置放射性物質的風險，檢測對象也只限于揮發性化合物。受生物質譜的電噴霧電離源技術啟發，20世紀90年代初，Hill等[4]研究了電噴霧-離子遷移譜(Electrospray ionization-ion mobility spectrometry, ESI-IMS)的儀器設計及影響分辨率的因素。與質譜相比，除質量電荷信息外，IMS還可提供更加豐富的結構信息，能夠分離質荷比相同但空間構型不同的同分異構多肽[5,6]，還可由測得的遷移率數據計算氣相離子的平均碰撞截面積，推斷氣相離子的可能構型和電荷分布。目前, ESI-IMS與MS聯用成為蛋白質組學以及蛋白質和多肽的結構研究的新手段，用于復雜肽類組分的分離、轉譯后修飾等研究[7,8]。

ESI-IMS擴大了傳統IMS技術檢測對象的范圍，成為藥物[9,10]、毒素[11]、爆炸物[12]等現場快速檢測領域的研究熱點，國內一些單位使用自制裝置或商品化儀器，進行了食品安全、保健品違法添加等方面的研究[13,14]，但這些工作的檢測對象均為小分子化合物。本研究在自制ESI-IMS實驗裝置上[15]測試4種氨基酸和P物質、緩激肽片段(Bradykinin fragment(1-7))2種具有重要生理功能的生物調節劑的離子遷移譜行為，發現譜圖與化合物結構的相關性，具有指紋譜特征。P物質是被外軍系統進行威脅評估的生物調節劑，具有被濫用為軀體或精神失能劑的潛在威脅[16]。氨基酸是多肽的降解產物，對氨基酸的檢測可作為使用多肽的溯源性分析佐證。本方法為多肽的現場快速檢測提供了途徑，也為今后發展此類國產設備奠定了基礎。

2 實驗部分

2.1試劑

甘氨酸、胱氨酸、組氨酸、精氨酸及緩激肽片段(Bradykinin Fragment (1～7)，BF)均購自Sigma公司; 甲醇(色譜純，Fluka公司); P物質(Substance P， SP)通過Fmoc固相合成的方法制備，購自上海吉爾生化公司，經Agilent 1120高效液相色譜(HPLC)分析及Bruker ultraflex基質輔助激光解吸飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)測定為純品。

電噴液的配制：準確稱取4種氨基酸及2種多肽樣品，以甲醇-水(4∶1，V/V)溶解，并配制不同濃度的樣品溶液。Bradykinin Fragment (1～7) 及P物質以甲醇溶解，逐級稀釋為不同濃度的電噴液。

2.2實驗裝置與方法

2.2.1實驗裝置使用本研究組前期工作搭建的ESI-IMS實驗裝置[15]。實驗中電噴液經配有注射器的步進電機推出后，高電壓下形成帶電液滴，在去溶劑化腔體中形成離子，離子門脈沖作用下進入IMS遷移區進行分離，分離后的離子最終到達法拉第盤被檢測。

2.2.2氨基酸及多肽的離子遷移譜測定離子遷移管內氣壓為環境氣壓，使用Bradbury-Nielsen型離子門，離子門開門時間設置為200s，離子門關門電壓控制為150 V; 遷移管工作溫度0～120℃; 漂氣流速500～2000 mL/min; 遷移區長度 8.8 cm; 遷移區電場強度為368.75 V/cm; 電噴霧電壓3000 V; 噴霧針針尖與對電極之間的距離在0.5～2.0 cm可調。電噴液流速控制在2L/min。離子遷移譜圖的掃描時間為40 ms，平均次數為16次，單次檢測時間小于1 s。正離子檢測模式，采用Origin 8.0軟件處理數據。考慮現場使用的實際需要，實驗以空氣為漂氣，遷移管工作溫度為室溫25℃。參照前期工作中優化的參數[14]，設置漂氣流速為1000 mL/min，噴霧針針尖與對電極之間的距離為1.0 cm，測試4種氨基酸和2種多肽的離子遷移譜圖。

2.2.3約化遷移率的計算在獲得遷移時間td等參數的基礎上，可以計算化合物的離子遷移率。當一束離子群進入均勻弱電場(E/N2Td)中，通過公式(1)[17]求得離子的約化遷移率K0：

式中，L為遷移區長度，即一種離子群從離子柵門遷移到收集極這段距離(cm)、td為離子群的遷移時間(s)、P和T分別為實驗條件下的壓力(mm Hg)及溫度(K)。

圖1 甘氨酸在ESI-IMS中的響應Fig.1 Ion mobility spectra of glycine

3 結果與討論

3.14種氨基酸的離子遷移譜

3.1.1甘氨酸圖1是甘氨酸(Glycine)在自制ESI-IMS裝置上的測試結果，其中a，b分別對應50g/mL的甘氨酸溶液、甲醇-水溶劑的離子遷移譜圖。由空白對照譜線(圖1b)可見，遷移時間td在7.8～9.7 ms之間的峰簇為甲醇-水溶劑峰，即反應離子峰簇(RIP)。譜線a與b相比，溶劑峰強度降低，在10.045 ms處出現離子峰，由甘氨酸分子結構可知，其對應的是氨基被質子化的甘氨酸離子。

3.1.2胱氨酸圖2是胱氨酸(Cystine)的測試結果，其中a，b，c分別對應100 和150g/mL的胱氨酸溶液及甲醇-水溶劑的離子遷移譜。與圖1相同，圖2中的反應峰簇也在td為7.8～9.7 ms之間出現。以譜線c為空白對照，含有胱氨酸的溶液在td為10.76 ms處出現離子峰，此峰強度與濃度正相關，濃度高的樣品即譜線b此處的離子峰信號強。此外，在td為12.20 ms處，胱氨酸溶液出現了微弱的信號。由胱氨酸分子結構判斷,td為10.76 和12.20 ms的峰分別對應兩個氨基均被質子化的帶雙電荷的胱氨酸離子和一個氨基被質子化的離子。

3.1.3組氨酸圖3給出了組氨酸(Histidine)的測試結果，其中a，b，c分別對應320 和32g/mL的組氨酸溶液及甲醇-水溶劑經ESI-IMS測得的譜線。作為空白對照的譜線c同樣在遷移時間td為7.8～9.7 ms之間出現反應峰簇。譜線a和b則在td為11.17 ms處出現明顯信號，緊鄰此峰，td為11.58 ms處還有一個強度弱的離子峰。根據組氨酸結構分析,td為11.17和11.58 ms的峰分別對應氨基和含氮的咪唑環均被質子化的帶雙電荷組氨酸離子和僅咪唑環被質子化的單電荷組氨酸離子。比較譜線a和b信號峰強度可見，td為11.17 ms對應的離子峰與濃度正相關，濃度高的離子峰信號強。

圖2 不同濃度胱氨酸在ESI-IMS中的響應Fig.2 Ion mobility spectra of different concentrations of cystine

圖3 不同濃度組氨酸在ESI-IMS中的響應Fig.3 Ion mobility spectra of different concentrations of histidine

圖4 不同濃度精氨酸在ESI-IMS中的響應Fig.4 Ion mobility spectra of different concentrations of arginine

3.1.4精氨酸圖4給出了精氨酸(Arginine)的測試結果，其中譜線b、c、d、e和f分別對應100、150、200、250 和350g/mL的精氨酸溶液及甲醇-水溶劑的離子遷移譜。作為空白對照的譜線a在遷移時間td為7.8～9.7 ms之間出現反應峰簇。對比可見，精氨酸溶液經電噴霧離子化后，在10.92及11.68 ms處出現兩個離子峰，由其結構可知，這兩個峰分別對應的是氨基及胍基均被質子化的帶雙電荷的精氨酸離子和僅胍基被質子化的單電荷離子。由圖4可見，在精氨酸濃度100～350g/mL的范圍內增加時， 這兩個峰的信號強度隨之變強。

由圖1～圖4可知，結構簡單、分子量最小的甘氨酸遷移時間td最短，隨著氨基酸分子量的逐漸增加和分子結構的復雜化，td隨之變長。在正離子模式下，組氨酸、精氨酸兩種堿性氨基酸因其除含有氨基外，還有堿性的側鏈R，可以檢測到兩個離子峰，而由半胱氨酸縮合而成的胱氨酸含有兩個氨基，也檢測到了兩個峰。由此可見，離子遷移譜反映出化合物的結構信息，而這是定性鑒定的基礎。

3.2兩種多肽的離子遷移譜

圖5 不同濃度BF在ESI-IMS中的響應Fig.5 Ion mobility spectra of different concentrations of Bradykinin fragment (1-7) BF

3.2.1Bradykininfragment(1-7)(BF) BF為緩激肽Bradykinin的片段，為其N端的1～7個氨基酸， 序列為Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro，該7肽化合物的分子量為756.85 Da。圖5是不同濃度BF的離子遷移譜圖。譜線a為不含樣品的空白對照，譜線b、c、d、e、f和g分別對應濃度為0.8、4、8、40、80和400g/mL的BF溶液的離子遷移譜圖。在正離子檢測模式下， BF在遷移時間td為11.94和13.06 ms處有明顯的信號。由BF的分子中氨基酸組成可知，其N端1位精氨酸殘基的氨基和胍基均可帶上正電荷，相應在ESI-IMS譜圖上出現了兩個譜峰。寡肽BF的骨架剛性，多電荷引起的靜電斥力對碰撞截面積的影響不大。因遷移時間與離子帶電荷數成反比，根據峰的位置，可知td為11.94 ms的譜峰對應的是帶雙電荷的BF離子，而13.06 ms對應的則是單電荷離子。由圖5可見，雙電荷峰與單電荷峰強度之比隨著BF的濃度降低而增大直至基本保持不變。這是因為電噴霧過程中產生的反應離子數一定，當BF的濃度高時，電荷轉移反應主要生成單電荷離子，而當BF的濃度降低，反應離子數過量時，單電荷離子會進一步與反應離子作用生成雙電荷離子，直至反應達到平衡。根據40g/mL BF在13.06 ms處離子峰的強度(50 mV)，推測該物質的檢出限(LOD)約為3g/mL， 相當于0.004 mmol/L。

圖6 不同濃度P物質在ESI-IMS中的響應Fig.6 Ion mobility spectra of different concentrations of Substance P

3.2.2P物質P物質是一種廣泛分布于腦神經纖維內的神經肽，屬于速激肽家族，其氨基酸序列為Arg-Pro-Lys-Pro-Gln -Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met，分子量1347.63 Da。圖6給出了濃度從ng/mL到g/mL量級的P物質在自制ESI-IMS裝置上的響應情況。譜線g為空白對照， a、b、c、d、e、f譜線分別對應濃度為285、142.5、28.5、2.85、1.425和855 ng/mL的P物質甲醇溶液離子遷移譜。在正離子檢測模式下， P物質有2個信號峰，對應的遷移時間td分別為13.37和18.24 ms。經電噴霧質譜分析, 前者對應的是雙電荷離子峰，后者為單電荷峰。18.24 ms處單電荷峰的強度與P物質的濃度呈正相關，其與13.37 ms處雙電荷峰的強度變化與BF的離子遷移譜行為相似，即當P物質濃度高時，離子轉移反應以生成單電荷產物為主，濃度降低時，雙電荷產物的量高于單電荷。由圖6可見， P物質濃度為855 ng/mL時，仍可檢出3倍信噪比(S/N)的信號強度，推測該物質的LOD在855 ng/mL的水平，相當于0.63 μmol/L。

綜上可知，不同化合物因其分子量、結構、帶電荷狀態的差異, 反映在離子遷移譜圖特征的差異，這些具有指紋譜特征的數據可用于化合物的定性鑒定。同時，自制的離子遷移譜實驗裝置對不同電荷狀態的離子具有優良的分離能力，這對于研究生物大分子結構以及開發國產實驗設備具有重要意義。

3.3氨基酸及多肽的約化遷移率

將測得的遷移時間代入式(1)，計算4種氨基酸和2種多肽約化遷移率，結果見表1。采用約化遷移率，避免了溫度和壓力對離子遷移率的影響。在實際應用中，離子遷移譜圖中譜峰對應的遷移時間可轉化成離子遷移率，它是化合物的特征常數。根據實驗結果求出的約化遷移率與標準離子遷移譜數據庫對照，可進行化合物快速鑒定。

表1 4種氨基酸及2種多肽的約化遷移率

Table 1 Reduced ion mobility of 4 amino acids and 2 polypeptides

化合物Compoud分子量Molecularweight(Da)主要峰的遷移時間Drifttimeofeachpeak(ms)約化遷移率Reducedmobility(cm2/(Vs))甘氨酸Glycine75．0510．042．17胱氨酸Cystine240．310．762．03組氨酸Histidine155．111．171．96精氨酸Arginine174．211．681．87緩激肽片段Bradykininfragment(1～7)756．8511．94，13．061．83，1．67P物質PSubstanceP1347．6313．37，18．241．63，1．20

4 結 論

離子遷移譜與質譜相似，卻沒有昂貴的真空部件，經濟性好; 與HPLC相比，電噴霧離子遷移譜在測試過程中無有機溶劑消耗，也無需更換色譜柱，基于待測物遷移率差異實現的分離無需方法開發，適用于現場快速檢測領域。本實驗利用自制的電噴霧離子遷移譜裝置研究了6種氨基酸及多肽樣品的離子遷移譜行為。在通常條件下，以空氣為漂移氣體，在十幾毫秒時間內完成待測物離子的遷移和分離， 1 min內即可獲得檢測結果，分析速度快。待測物的遷移時間與其分子量、分子結構及帶電荷情況有關，約化遷移率反映的是其固有屬性，獲得的離子遷移譜具有指紋譜特征，這些可用于離子遷移譜數據庫建設，在可疑生物物質的快速篩查中發揮作用。在本研究的基礎上，下一步擬將該裝置發展為實用的現場快速檢測設備，并開展混合物檢測方法研究和創建生物大分子離子遷移譜數據庫的工作。

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DetectionofAminoAcidsandPolypeptidesbyElectrosprayIonization-IonMobilitySpectrometry

KONG Jing-Lin*1, LIU Wei-Wei1, DING Jun-Jie1, ZHANG Lin1, LI Bao-Qiang1, QIN Mo-Lin1, CHEN Chuang2, LI Hai-Yang2
1(InstituteofChemicalDefense,Beijing102205,China)2(DalianInstituteofChemicalPhysicsChineseAcademyofSciences,Dalian116023,China)

The electrospray ionization-ion mobility spectrometric (ESI-IMS) technique has the potential as an analytical separation tool in analyzing polypeptides and amino acids for fast screening unknown samples in anti-chemical and biological terror attacks. A method for detecting several polypeptides and amino acids was developed based on ESI-IMS using air as drift gas at room temperature. The ion mobility of four amino acids and two polypeptides dissolved in methanol was determined on the system at elution rate of 2L/min. The spectra of these compounds had characteristics of finger-printing maps. The limit of detection of this instrument for Substance P could reach 855 ng/mL in 1 min. The results showed that a small, self-contained ESI-IMS instrument with reservoirs of air could be used to quickly detect and accurately identify polypeptides and amino acids.

Electrospray; Ion mobility spectrometry; Amino acid; Polypeptide; Reduced mobility

30 June 2017; accepted 8 September 2017)

10.11895/j.issn.0253-3820.171052