基于原子轉移自由基聚合反應的高靈敏度ELISA方法研究

常向前,王得順,張愛紅,徐力紅,林虹君

1.武警天津市總隊醫院 檢驗科，天津 300171；2.防化學院，北京 102205；3.空軍防化大隊，北京 102206

基于原子轉移自由基聚合反應的高靈敏度ELISA方法研究

常向前1,王得順1,張愛紅2,徐力紅3,林虹君3

1.武警天津市總隊醫院 檢驗科，天津 300171；2.防化學院，北京 102205；3.空軍防化大隊，北京 102206

目的：對傳統酶聯免疫吸附測定法（ELISA）進行優化改進，以提高其檢測靈敏度，拓展應用范圍。方法：通過在傳統ELISA方法中引入原子轉移自由基聚合反應（ATRP）和納米金顆粒（GNPs），并將大量辣根過氧化物酶（HRP）與二抗結合，提高了HRP與抗原的結合比例，進而實現了對待檢測物的信號放大。結果：優化后的ELISA方法在對β淀粉樣蛋白的檢測中，檢測限（LOD）降低為原來的1/81。結論：改進后的ELISA方法性能穩定，靈敏度大幅提高，能夠用于對痕量目標檢測物的檢測。

原子轉移自由基聚合反應；納米金；酶聯免疫檢測

1971年瑞典學者[1]和荷蘭學者[2]分別報道了將免疫技術發展為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法，即酶聯免疫吸附測定法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）。ELISA方法是利用抗原、抗體兩者在化學結構和空間構型上呈現的互補關系對待測物進行檢測，因此該方法具有高度的特異性。此外，該方法還可實現在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上進行定量。因此，酶聯免疫法是目前在痕量生物標志物、目標蛋白質檢測中使用最廣的方法之一[3-5]。

盡管ELISA方法具有靈敏度高、重復性好、使用方便等優點，但隨著科研和實際應用要求的不斷提高，其在疾病早期預防、超痕量目標物檢測中仍不能滿足要求[6-10]。鑒于目前ELISA方法存在的局限性，我們通過引入原子轉移自由基聚合（atom transfer radical polymer，ATRP）反應和納米金顆粒（gold nanoparticles，GNPs）載體對其進行改進，建立了一種自組裝的信號放大方法。即，通過ATRP反應在納米金表面引入大量活性支鏈，再將大量辣根過氧化物酶（horseradish peroxi?dase，HRP）連接到支鏈上，進而提高了HRP和待測抗原的比例，明顯放大了檢測信號，大大提高了檢測靈敏度，降低了檢測限，拓展了該方法的應用范圍和領域。

1 材料與方法

1.1 材料

血清（含β淀粉樣蛋白）來自北京大學腫瘤醫院）；β淀粉樣蛋白一抗（Aβ-Ab1）、HRP標記的二抗（HRP-Ab2）均購自Abcam公司；牛血清白蛋白（BSA）購自Sigma-Aldrich公司；氯金酸（HAuCl4·4H2O）購自南京市威圣化工貿易有限公司；檸檬酸鈉購自上海創順化工有限公司；KH2PO4、Na2HPO4、KCl、Tween-20 均購自北京化學試劑公司；實驗用水為二次蒸餾水。

Tecnai G2 20型透射電鏡（FEI香港有限公司）；85-2數顯型恒溫攪拌器（國瑞試驗儀器廠）；Milli-Q型純水儀（≥18 MΩ，Millipore公司）；Sor?vall Legend Micro 17 Centrifuge（Thermo公司）。

1.2 引發劑的制備

將0.3g 11-巰基-1-十一烷醇溶于6mL四氫呋喃（提供反應的液體環境）中，再加入108μL吡啶（催化劑），混合后通入氮氣除氧，同時冰浴30min，之后緩慢滴加164μL 2-溴異丁酰溴，并持續攪拌4h（持續通氮氣），最后將反應后的溶液用濾紙過濾，用氮氣吹干至略黏稠，得到引發劑，充氮氣后密閉于4℃保存。

1.3 ATRP修飾反應

將制備的納米金置于含500μL反應液（引發劑）的EP管中，將EP管置于旋轉混合儀上過夜反應，用甲醇清洗掉剩余引發劑后，加入ATRP反應液（2 mol/L GMA，0.02 mol/L CuCl，0.03 mol/L N,N,N',N'',N''-五甲基二乙烯三胺，0.001 mol/L CuCl2，環己醇），再加入0.03 mol/L葡萄糖，常溫振搖反應24h。

1.3.1 環氧基團的開環反應 配制體積分數為50％的異丙醇水溶液，并以其為溶劑配制體積分數為60％的乙二胺溶液。將修飾有高密度環氧基團的納米金置于上述乙二胺溶液中（80℃）反應4h，使氨基暴露。

1.3.2 修飾醛基官能團 稱量67.84g磷酸氫二鈉和1.65g磷酸二氫鈉，溶于2 L去離子水中，配制成PBS溶液。以PBS溶液為溶劑，配制體積分數為40％的戊二醛溶液。將1.3.1中獲得的暴露氨基的納米金置于戊二醛溶液中（10～30℃）反應12h，即在納米金表面修飾上了醛基。

1.3.3 在納米金表面進行抗體和HRP的固定用PBS溶液配制終濃度為2 mg/mL的一抗和HRP溶液（pH8.0），并加入氰基硼氫化鈉使其終濃度為5 mg/mL，混合均勻后作為反應液。將1.3.2中獲得的表面修飾上醛基的納米金置于該反應液中，4℃反應24h后用50mmol/L Tris-HCl緩沖液（50mmol/L Tris溶液用HCl調至pH8）清洗。

1.3.4 聚合物側鏈剩余醛基的封閉 向PBS溶液中加入氨基乙醇至其體積分數為1％，將1.3.3中的納米金放入其中，4℃反應4～12h。反應完成后用50mmol/L Tris-HCl緩沖液（配方同1.3.3中所述）清洗3次，于4℃保存，即獲得上述基于ATRP修飾的納米金-抗體結合物。

1.4 納米金的制備

將1mL 1％的氯金酸溶液加入100mL雙蒸水中，用力攪拌并加熱至沸騰，迅速加入4.5mL 1％的檸檬酸鈉溶液，充分攪拌，保持沸騰10min。這期間溶液顏色由灰變藍再變紫，最后為酒紅色。移去熱源，再攪拌15min，自然冷卻至室溫，即制得平均粒徑為16nm的納米金膠體，4℃保存備用。其透射電鏡圖見圖1。

為了得到分散均勻、大小勻稱的納米金顆粒，首先將所用器皿用王水（濃HCl∶濃HNO3=3∶1）充分浸泡，然后用雙蒸水沖洗，烘干待用。因為此步驟需要絕對清潔的器皿，任何雜質都會使制備的納米金顆粒團聚。

2 結果與討論

2.1 將納米金、抗體結合物用于ELISA檢測

對新建立的方法進行性能測試，具體步驟如下：①將GST蛋白包被在96孔板上，于4℃過夜，次日棄去孔內溶液，用洗滌液沖洗3次，每次3min；②加入按一定比例稀釋的制備一抗于上述已包被的反應孔中，37℃孵育1h，然后洗滌；同時以正常一抗做對照，并用空白孔做假陽性對照；③于各反應孔中加入臨時配置的TMB底物溶液 0.1mL，37℃孵育 10～30min；④用 2 mol/L 硫酸終止反應；⑤用酶標儀檢測D450nm值。

2.2 改進后的ELISA方法評價

以β淀粉樣蛋白為樣品，對改進的ELISA方法進行性能評價。β淀粉樣蛋白不僅與神經元的退行性病變有關，而且還可以激活一系列病例事件，包括星型膠質細胞和小膠質細胞的激活、血腦屏障的破壞和微循環的變化等，是阿爾茨海默病患者腦內老年斑周圍神經元變性和死亡的主要原因。

改進的ELISA法檢測β淀粉樣蛋白的具體步驟如下：①將β淀粉樣蛋白抗原固定在96孔板上；②用BSA進行封閉；③加入一抗，讓其與抗原充分結合；④洗去未結合的多余一抗；⑤加入制備好的二抗；⑥加入酶底物，檢測讀數。

在傳統ELISA方法中，每一個抗原蛋白質只能結合一個對應一抗，而每個一抗也只能結合一個二抗和一個HRP；而在改進的ELISA方法中，通過結合在ATRP支鏈上的納米金載體的放大作用，最終可與多個HRP結合，能夠將較小的檢測信號放大，提高了檢測的靈敏度。其原理見圖2。

為了進一步考察新方法的性能，設計了如下實驗。如圖3，將配置好的待測樣品平均分成2份，從左至右依次按1/3的比例稀釋。a行采用改進的方法進行檢測，b行采用傳統ELISA法。從結果來看，改進的方法可以對前8個點（a行中A～H）進行有效檢測，而改進前則只能對前4個點（b行中A～D）進行有效檢測，即改進的方法檢測限降低為原來的1/81。多次重復實驗結果表明，改進的方法性能穩定，重復性好，可用于對樣本中低濃度蛋白質進行靈敏檢測。

2.3 結論

通過ATRP反應將納米金引入傳統ELISA方法，大大提高了HRP與抗原的結合比例，對檢測信號進行了放大，提高了方法的靈敏度，檢測限降低為傳統方法的1/81，進一步拓展了該檢測方法的應用領域。而且改進的ELISA方法重復性好，性能穩定。可以預見，新方法將會在蛋白質檢測和診斷學研究中發揮重要作用。

圖2 改進的ELISA方法信號放大示意圖

圖3 改進后（a）和改進前（b）的ELISA方法對β淀粉樣蛋白的檢測結果

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High Sensitivity ELISA Method Research Based on Atom Radical Polymerization Reaction

CHANG Xiang-Qian1,WANG De-Shun1,ZHANG Ai-Hong2*,XU Li-Hong3,LIN Hong-Jun3
1.Department of Clinical Laboratory,Tianjin General Hospital of Chinese People's Armed Police Forces,Tian?jin 300171;2.Institute of Chemical Defense,Beijing 102205;3.Air Force Defense Union,Beijing 102206;China
*Corresponding author,E-mail:hjlhappy7858@163.com

Objective:To improve the traditional enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） strategy for increas?ing its sensitivity and extending the application.Methods:A large amount of horseradish peroxidase（HRP） was in?troduced to secondary antibody by introducing atom transfer radical polymer（ATRP） reaction and gold nanoparticles（GNPs）.The modification improved the binding ratio of HRP to secondary antibody,achieved the object of detec?tion signal amplification,and improved the traditional detection sensitivity greatly.Results:Limit of detection（LOD） after improvement decreased to 1/81 of that in traditional ELISA method.Conclusion:The newly built ELISA method had good stability,excellent sensitivity,and was able to detect ultralow-abundancy analytes.

atom transfer radical polymer;gold nanoparticles;enzyme-linked immunosorbent assay

R392.1

A

1009-0002（2017）04-0534-04

更正聲明

應第一作者張傳朋要求，本刊2016年第27卷第6期804～807頁刊發的論文《腸出血性大腸桿菌O157∶H7前噬菌體CP-933Y缺失突變株的構建》，通信作者應為王慧（E-mail：geno0109@vip.sina.com）。

《生物技術通訊》雜志社

2017-01-24

天津市科技計劃（14ZCDZSY00033）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃（14JCQNJC12600）；武警后勤學院附屬醫院種子基金（FYM201514）

常向前（1982- ），男，研究生學歷，（E-mail）changxq13820668062@163.com

通信作者：張愛紅，（E-mail）hjlhappy7858@163.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.026

特此聲明。