青霉素菌渣堆肥中β-內(nèi)酰胺酶基因豐度變化

段會英,趙 娟,張振華,余 冉*,章嫡妮,劉 燕*,王長永

?

青霉素菌渣堆肥中β-內(nèi)酰胺酶基因豐度變化

段會英1,趙 娟1,張振華2,余 冉1*,章嫡妮2,劉 燕2*,王長永2

(1.東南大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院,江蘇南京 210096；2.環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所,江蘇南京 210042)

為了解抗生素菌渣堆肥中抗生素殘留對抗生素抗性基因(ARGs)環(huán)境行為的影響,以青霉素菌渣堆肥為對象,采用實時定量 PCR方法分析了8種典型β-內(nèi)酰胺酶基因,-TEM、-CTX-M-1、-CTX-M-9、-IMP-1、-VIM-2、-CMY、-OXA-23、-NDM-1在整個堆肥過程中的豐度變化.結(jié)果表明,高溫堆肥處理大大縮短了青霉素的降解時間;-NDM-1在所有樣品中均未檢出.通過比較β-內(nèi)酰胺酶基因在不同處理中第1d和30d的絕對數(shù)量變化,在處理組中除-IMP-1、-VIM-2基因絕對數(shù)量有所增加外;其他基因都明顯減少.從相對豐度看,在堆肥前期,青霉素殘留對-TEM、-CTX-M-1、-CTX-M-9、-CMY、-OXA-23、-VIM-2基因有一定誘導(dǎo)富集效應(yīng).隨著堆肥進(jìn)程及菌渣堆肥中抗生素濃度的降低,到了堆肥末期,各處理組及對照組-TEM、-CTX-M-1、-CTX-M-9、-CMY的相對豐度較堆肥前期顯著降低;而處理組中-IMP-1、-VIM-2的相對豐度較堆肥前期顯著增加.

青霉素菌渣；高溫堆肥；β-內(nèi)酰胺酶基因；相對豐度

由于抗生素抗性基因(ARGs)環(huán)境污染問題的隱蔽性、滯后性、累積性,及其對人類健康的潛在風(fēng)險而廣受關(guān)注.各國學(xué)者針對ARGs這種新型環(huán)境污染物迅速開展相關(guān)基礎(chǔ)研究.研究發(fā)現(xiàn)[1-2]ARGs在環(huán)境中的散播主要以細(xì)菌介導(dǎo)的質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子、染色體水平轉(zhuǎn)移以及噬菌體轉(zhuǎn)染的方式.而環(huán)境介質(zhì)中的抗生素濃度和活性是誘導(dǎo)ARGs在環(huán)境微生物菌群中富集的主要因素.近年來,隨著抗生素在醫(yī)療和養(yǎng)殖業(yè)中的大量使用,導(dǎo)致環(huán)境中抗性基因的相對豐度和多樣性增加.已有研究表明,在不同環(huán)境介質(zhì)如污水處理廠[1]、畜禽糞便[3]、養(yǎng)殖水域[4]、河流[5]、土壤[6]、凍土[7-8]等中都檢測到不同種類和豐度的ARGs.

抗生素菌渣是我國抗生素發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中的主要廢料,由于其含有抗生素殘留及代謝中間產(chǎn)物,于2008年被列入《國家危險廢物名錄》.其不恰當(dāng)?shù)奶幹梅绞娇赡軙?dǎo)致殘留抗生素進(jìn)入環(huán)境介質(zhì)中構(gòu)成潛在的生態(tài)風(fēng)險和資源浪費.前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[9],青霉素菌渣與豬糞的好氧高溫堆肥不僅能快速降解青霉素殘留,同時青霉素菌渣中大量蛋白和微量元素促進(jìn)了微生物活性,加速堆肥過程.然而菌渣堆肥中的初始青霉素殘留較高,是否會誘導(dǎo)ARGs在微生物群菌中富集,是評價抗生素菌渣堆肥資源化利用技術(shù)環(huán)境安全風(fēng)險的主要問題.已有研究表明高溫好氧堆肥在一定程度上可以削減禽畜糞便中存在的抗生素耐藥菌數(shù)量,控制ARGs傳播和擴(kuò)散[10-11].但有關(guān)青霉素菌渣堆肥中ARGs的豐度變化研究卻鮮有報道.本實驗以青霉素菌渣堆肥為對象,基于實時熒光定量PCR(qPCR)技術(shù),研究β-內(nèi)酰胺酶的8個典型ARGs,-TEM、-CTX-M-1、-CTX-M-9、-IMP-1、-VIM-2、-NDM-1、-CMY、-OXA-23在好氧堆肥不同階段的豐度變化.初步揭示青霉素菌渣堆肥過程中β-內(nèi)酰胺酶基因型菌群的變化規(guī)律,以期為青霉素菌渣堆肥化的環(huán)境安全性評價提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 堆肥材料

以青霉素濕菌渣和豬糞為主要原料,以碎木屑為調(diào)節(jié)劑進(jìn)行高溫好氧堆肥.表1為堆肥原料碳氮比例表(干)及成分比.

表1 堆肥原料碳氮比例表(干)及成分比

堆肥過程和樣品采集方式如趙娟[12]所述,堆制地點選在南京市蔬菜科技園,堆制時間30d.堆肥前期(升溫期)人工翻堆1d 1次,之后每隔2d翻堆1次,每次翻堆時間相同.每次翻堆完成后用“5點法”進(jìn)行樣品采集,然后將采集的5個樣品混勻,以保證樣品的代表性.最終選取第1、6、15、24、30d的樣品進(jìn)行前期處理,用于后續(xù)實驗分析.表2為所用初始堆肥物料理化性質(zhì)及組成.

表2 堆肥物料初始理化性質(zhì)

1.2 青霉素的提取及痕量檢測

堆肥樣品中青霉素的提取及痕量檢測方法:參考馬珊珊等[13]方法,經(jīng)過ASE萃取和SPE凈化過程得到的洗脫液過0.22μm尼龍濾膜,然后用外標(biāo)法及超高效液相色譜方法進(jìn)行青霉素含量檢測.

1.3 堆肥樣品DNA的提取

堆肥樣品DNA按照FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒說明書進(jìn)行,用核酸蛋白質(zhì)分析儀 NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington. DE)測定DNA濃度,-20℃保存待測.

1.4 β-內(nèi)酰胺酶基因及細(xì)菌數(shù)量的定量PCR (qPCR)的分析

β-內(nèi)酰胺酶按照Ambler分類法,可分為A、B、C、D 4大類.本次實驗從4大類中分別選取了典型的基因分型-TEM、-CTX-M-1、-CTX-M-9、-IMP-1、-VIM-2、-NDM-1、-OXA-23開展其在青霉素菌渣堆肥過程中豐度的變化特征研究. 8種不同基因序列在National Center for Biotechnology Information(簡稱NCBI)中通過GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genbank/) 查找獲得合成,具體見表3.本文中所用到引物及探針序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

表3 β-內(nèi)酰胺酶基因序列

實驗中標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)2值為0.990~1.000,擴(kuò)增效率范圍為95.4%~102%.詳細(xì)操作方法如下:將合成的質(zhì)粒進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、提取,作為定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)模板. β-內(nèi)酰胺酶基因采用特異性Taqman水解探針法來制作 qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線.反應(yīng)用20μL體系,包括Taqman PCR Mix 10μL,上下游引物(= 8000nmol/L)各1.0μL,探針(=4000nmol/L) 0.5μL,超純水6.5μL,質(zhì)粒模版1.0μL.同時對細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行定量,方法是SYBR Green染料法. 20μL擴(kuò)增體系為SYBR Green Mix 10μL,上下游引物(=100μmol/L)各0.2μL,超純水8.6μL,質(zhì)粒模版1.0μL.

將克隆測序得到的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒稀釋105~109倍,作為模板構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線.樣品作為定量PCR模板時,稀釋10倍,并以無菌水作為陰性對照.所有樣品均3個平行,最終計算平均值.表4是實驗過程中所用引物和探針以及擴(kuò)增反應(yīng)條件.

表4 目的基因引物、探針序列及擴(kuò)增反應(yīng)條件

續(xù)表4

1.5 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010進(jìn)行處理,采用Origin8.5進(jìn)行作圖并用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析.按照公式[19]:相對豐度=β-內(nèi)酰胺酶基因的拷貝數(shù)/16S rRNA基因的拷貝數(shù),計算抗性基因的相對豐度,進(jìn)行分析討論.

2 結(jié)果討論

2.1 青霉素殘留降解

如圖1所示,高溫混合堆肥能快速降解堆體中的青霉素殘留.處理組1、2、3中青霉素濃度分別從初始的(305.1±16.8)、(208.6±4.2)和(74.9± 3.0)mg/kg降至濃度低于UPLC方法檢測限,所用時間分別為9、9、6d.在青霉素菌渣和豬糞的堆肥研究中,有研究稱降解99%的青霉素在堆肥前7d內(nèi)完成[9].青霉素的降解符合一級反應(yīng)動力學(xué)模型[12],處理組1、2、3青霉素鈉的降解半衰期(1/2)分別為1.9、2.4、2.3d.

2.2 β-內(nèi)酰胺酶基因的絕對數(shù)量

β-內(nèi)酰胺酶基因在不同處理中第1d和30d的數(shù)量變化如表5所示,堆肥第1d,-TEM、-CTX-M-1、-CTX-M-9、-CMY、-OXA-23、-VIM-2、-IMP-1基因的絕對數(shù)量顯著高于對照組.一方面,可能由于青霉素菌渣中有機質(zhì)含量較高且易降解,加速了細(xì)菌在堆體內(nèi)的繁殖數(shù)量,同時也促進(jìn)了攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因的微生物菌群數(shù)量.另一方面,由于青霉素水溶性強,菌渣菌絲體中的青霉素殘留快速釋放到堆體內(nèi),促進(jìn)了誘導(dǎo)性抗性基因的表達(dá)豐度.

圖1 堆肥過程中的青霉素殘留濃度

表5 不同處理組中β-內(nèi)酰胺酶基因在第1d和30d的絕對數(shù)量(copies/g DW)

注:#表示同日樣品,與對照組存在顯著性差異(<0.05):*表示同一處理,與其余天樣品存在顯著性差異(<0.05).

好氧高溫堆肥過程能有效消除β-內(nèi)酰胺酶基因的數(shù)量.處理組中除-IMP-1、-VIM-2基因的絕對數(shù)量呈上升趨勢,其他基因的絕對數(shù)量均顯著降低;對照組中的β-內(nèi)酰胺酶基因除-CMY-OXA-23外均能通過高溫好氧堆肥方式得到一定的去除.-NDM-1基因經(jīng)PCR和qPCR檢測結(jié)果均顯示陰性,表明整個堆肥過程中不存在-NDM-1基因型菌群.

2.3 β-內(nèi)酰胺酶基因的相對豐度

圖2 堆肥過程中細(xì)菌16S rRNA基因數(shù)量變化

#表示同天樣品,與對照組存在顯著性差異(<0.05):*表示同一處理,與其余天樣品存在顯著性差異(<0.05)

為了降低堆肥樣品DNA提取效率和細(xì)菌數(shù)量背景值造成的影響.用β-內(nèi)酰胺酶基因的絕對數(shù)量與16S rRNA基因絕對數(shù)量的比值(即相對豐度)來分析攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因型菌群在總細(xì)菌群落中所占的平均比例.如圖2所示,在堆肥初期和腐熟期處理組的中細(xì)菌16S rRNA基因的絕對數(shù)量顯著高于對照組,說明青霉素菌渣的添加顯著提高了堆體中細(xì)菌的數(shù)量.

2.3.1-TEM基因相對豐度-TEM屬于典型的A類超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因(ESBLs),于1965年首次在質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)[20].至2014年已發(fā)現(xiàn)了216種亞型[21].主要分布于....和等宿主的質(zhì)粒中[22].堆肥過程中-TEM基因相對豐度變化如圖3所示,在堆肥初期各個處理組中抗性基因-TEM相對豐度在0.4%~3%之間,顯著高于其他各個堆肥時期.堆肥高溫階段各處理組的-TEM相對豐度最低.在堆肥腐熟階段,各個處理組的-TEM相對豐度有所上升(0.05%~0.11%,24d),且無顯著差異.堆肥結(jié)束后處理1、2、3-TEM基因的相對豐度分別下降了83.6%、42.3%、26.9%.高溫堆肥過程雖然在一定程度能消除-TEM基因的相對豐度,但堆肥結(jié)束后各處理組的-TEM相對豐度還維持在2×10-3~4×10-3之間.這可能由于-TEM廣泛的存在于sp.、sp.、sp.中,而這些菌群又是豬糞堆肥后期的優(yōu)勢菌群[23-24].

圖3 堆肥過程中bla-TEM基因的相對豐度

#表示同天樣品,與對照組存在顯著性差異(<0.05):*表示同一處理,與其余天樣品存在顯著性差異(<0.05)

2.3.2-CTX-M基因相對豐度-CTX-M屬于A類異源分子結(jié)構(gòu)的β-內(nèi)酰胺酶基因,目前已發(fā)現(xiàn)6種亞型(CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9、CTX-M-25和KLUC),-CTX-M-1和-CTX-M-9是其主要亞型.-CTX-M最初發(fā)現(xiàn)于.sp的染色體上[25],隨后研究發(fā)現(xiàn),質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是-CTX-M在不同宿主間轉(zhuǎn)移的主要方式,而禽畜糞便中的.和是其主要攜帶者[26].大量研究表明,糞便中攜帶-CTX-M的宿主豐度占到了細(xì)菌總豐度的5%~12%[27].如圖4所示,不同處理組和對照組中-CTX-M-1和-CTX-M-9基因相對豐度在第1d較高,分別在0.008%~0.1%和0.1%~3%.隨著堆肥化過程,-CTX-M基因豐度顯著降低.堆肥結(jié)束后處理1、2、3和對照組的-CTX-M-1和-CTX-M-9基因相對豐度分別下降了99.7%、96.9%、97.5%、96.1%和99.8%、99.7%、99.8%、99.9%.說明了堆肥化過程能有效消減堆肥原料中的-CTX-M基因豐度.不同處理組及對照組在第1d的-CTX-M基因相對豐度有顯著差別,處理1組顯著大于其他處理組及對照組,表明在堆肥初期青霉素菌渣中的殘留青霉素能夠誘導(dǎo)豬糞中的微生物產(chǎn)生青霉素耐藥性,進(jìn)而誘導(dǎo)-CTX-M基因富集.堆肥結(jié)束后,不同處理組及對照組的-CTX-M-1基因相對豐度無顯著差異,而-CTX-M-9在3個處理組中顯著大于對照組.

#表示同天樣品,與對照組存在顯著性差異(<0.05):*表示同一處理,與其余天樣品存在顯著性差異(<0.05)

2.3.3-IMP-1基因的相對豐度-IMP屬于B類金屬酶類β-內(nèi)酰胺酶基因(MBLs),最早在1994年發(fā)現(xiàn)于染色體上.至今已發(fā)現(xiàn)了42種亞型,其中30多種亞型是在醫(yī)學(xué)臨床中的病原菌中發(fā)現(xiàn)的[28-29].前期相關(guān)研究主要集中于醫(yī)學(xué)臨床分離的病原菌中-IMP基因多樣性及抗性特征,近年在禽畜糞便堆肥和抗生素廣泛使用的近海漁場沉積物中也發(fā)現(xiàn)-IMP大量富集.說明了環(huán)境介質(zhì)中的抗生素殘留也能誘導(dǎo)-IMP基因在環(huán)境微生物中的轉(zhuǎn)移與富集[30-31].如圖5所示,堆肥初始1d處理1、2、3中-IMP-1相對豐度分別為4.39×10-6、2.09× 10-6、5.15×10-6顯著低于對照組的3.65×10-5.可能是由于堆肥初期-IMP-1主要來源于.sp.,sp.,sp.等熱敏性較低的革蘭氏陰性病原菌中.青霉素菌渣堆肥較對照組能快速進(jìn)入高溫期,從而有效抑制了-IMP-1宿主的數(shù)量.隨著堆肥過程,各處理組的-IMP-1基因相對豐度變化的趨勢為先減少后增加,至堆肥結(jié)束30d,各處理組的-IMP-1相對豐度維持在2×10-5~4×10-4之間.

2.3.4-VIM-2基因的相對豐度-VIM也屬于典型的B類金屬酶類β-內(nèi)酰胺酶基因(MBLs),于1997年首次在意大利醫(yī)院分離的染色體中發(fā)現(xiàn)[32].近年來,有研究報道了從飼養(yǎng)豬和家禽農(nóng)場中分離出攜帶-VIM基因的和sp.且主要通過IncHI2型質(zhì)粒在不同宿主中進(jìn)行基因水平轉(zhuǎn)移[33].如圖5所示,青霉素菌渣中的青霉素殘留可能對-VIM-2基因在堆肥微生物中的富集產(chǎn)生一定誘導(dǎo)作用.各個堆肥時期,處理1、2、3中-基因相對豐度顯著高于對照組.各處理組和對照組中bla-VIM-2基因相對豐度在堆肥前后發(fā)生明顯變化(>0.05). 堆肥結(jié)束后處理1、2、3和對照組分別增加了5.8、2.7、10.4和2.5倍,由于IncHI2型質(zhì)粒中含有編碼抗銅、銀、汞、鋅等重金屬基因,因此禽畜糞便中重金屬殘留也是誘導(dǎo)-基因在堆肥微生物菌群中富集的機制之一[34].

圖5 堆肥過程中β-內(nèi)酰胺酶基因的相對豐度變化

#表示同天樣品,與其他組存在顯著性差異(<0.05):同一處理,*表示與其他天樣品存在顯著性差異(<0.05)

2.3.5-CMY基因的相對豐度-CMY屬于典型的C類AmpC型β-內(nèi)酰胺酶基因,最早于1989年在的質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn),至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)43種亞型[35].

近年來,隨著抗生素在禽畜養(yǎng)殖業(yè)中的廣泛使用,從禽畜食品、糞便中分離的、sp.等病原菌中檢測出較高豐度的-CMY-2亞型質(zhì)粒編碼基因[36-37].如圖5所示,堆肥初始1d處理1、2、3中-CMY相對豐度顯著高于對照組.這可能是由于-CMY中部分亞型如-CMY-13、-CMY-11屬于底物誘導(dǎo)型,而菌渣堆肥前期中的青霉素殘留誘導(dǎo)了相關(guān)基因的表達(dá)[38].在堆肥高溫階段,各處理組的-CMY基因豐度降到了最低值.隨著堆肥進(jìn)入腐熟期,各處理組的-CMY基因豐度又逐漸上升且無顯著差異.至堆肥末期,處理1、2、3中-CMY基因的相對豐度分別下降了86.1%、66.7%、63.5%.

2.3.6-OXA-23基因的相對豐度-OXA屬于典型的D類β-內(nèi)酰胺酶基因,于1993年首次在中發(fā)現(xiàn),目前主要分為4組類群:-OXA-23(OXA-23,-27,-49);-OXA-24(OXA-24,-25,-46,-72);-OXA-58(OXA-58,-96)和-OXA-51,而sp.是其主要的宿主來源[39].如圖5所示,處理組和對照組1d中-OXA-23基因的相對豐度分別為2.70×10-5、6.54×10-6、4.52×10-6,顯著高于對照組的2.35×10-7.至堆肥結(jié)束30d,處理組1、2中-OXA-23基因幾乎全部去除,處理3中-OXA-23基因去除55.0%,而對照組增加了3.1倍.

3 結(jié)論

3.1 高溫堆肥處理大大縮短了青霉素的降解時間,堆肥結(jié)束后,處理組中青霉素殘留濃度均低于UPLC方法檢測限.

3.2 堆肥期間,各處理樣品中均未檢測到-NDM-1基因.絕對數(shù)量上,純豬糞堆肥對-TEM、-CTX-M-1、-CTX-M-9、-IMP-1有消減作用,青霉素菌渣堆肥對-IMP-1有誘導(dǎo)富集作用對-CMY產(chǎn)生有效削減.

3.3 相對豐度上,在堆肥前期,青霉素殘留對-TEM、-CTX-M-1、-CTX-M-9、-OXA-23、-CMY、-VIM-2基因有一定誘導(dǎo)富集效應(yīng).至堆肥末期,4個堆體中-TEM、-CTX-M-1、-CTX-M-9、-CMY的相對豐度較堆肥前期顯著降低;而處理1、2、3中-IMP-1、-VIM-2的相對豐度較堆肥前期顯著增加.

[1] Baquero F, Martínez J L, Cantón R. Antibiotics and antibiotic resistance in water environments [J]. Current Opinion in Biotechnology, 2008,19(3):260-265.

[2] Levy S B, Marshall B. Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses [J]. Nature Medicine, 2004,10(12): 122-129.

[3] Colomerlluch M, Imamovic L, Jofre J, et al. Bacteriophages carrying antibiotic resistance genes in fecal waste from cattle, pigs, and poultry [J]. Antimicrobial Agents & Chemotherapy, 2011,55(10):4908-4911.

[4] Hsu J T, Chen C Y, Young C W, et al.Prevalence of sulfonamide- resistant bacteria, resistance genes and integron-associated horizontal gene transfer in natural water bodies and soils adjacent to a swine feedlot in northern Taiwan [J]. J. Hazard Mater., 2014,277(4):34-43.

[5] Li D, Yu T, Zhang Y, et al.Antibiotic resistance characteristics of environmental bacteria from an oxytetracycline production wastewater treatment plant and the receiving river [J].Applied & Environmental Microbiology, 2010,76(11):3444-3451.

[6] Udikovickolic N, Wichmann F, Broderick N A, et al. Bloom of resident antibiotic-resistant bacteria in soil following manure fertilization [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014,111(42):1-6.

[7] D'Costa V M, King C E, Kalan L, et al. Antibiotic resistance is ancient [J]. Nature, 2011,477(7365):457-461.

[8] Lang K S, Anderson J M, Schwarz S, et al.Novel florfenicol and chloramphenicol resistance gene discovered in Alaskan soil by using functional metagenomics [J]. Applied & Environmental Microbiology Aem., 2010,76(15):5321–5326.

[9] Zhang Z, Zhao J, Yu C, et al.Evaluation of aerobic co-composting of penicillin fermentation fungi residue with pig manure on penicillin degradation, microbial population dynamics and composting maturity [J]. Bioresource Technology, 2015,198(8): 403-409.

[10] 田 哲,張 昱,楊 敏.堆肥化處理對畜禽糞便中四環(huán)素類抗生素及抗性基因控制的研究進(jìn)展 [J]. 微生物學(xué)通報, 2015, 42(5):936?943.

[11] Wang L, Gutek A, Grewal S, et al. Changes in diversity of cultured bacteria resistant to erythromycin and tetracycline in swine manure during simulated composting and lagoon storage [J]. Letters in Applied Microbiology, 2015,61(3):245-251.

[12] 趙 娟,張振華,段會英,等.青霉素菌渣堆肥過程中青霉素鈉降解菌的分離與鑒定 [J]. 環(huán)境科學(xué)研究, 2016,29(2):271-278.

[13] Ma S, Liu Y, Yu R, et al. Determination of sodium penicillin in soil through accelerated solvent extraction and solid phase extration followed by high performance liquid chromatography [J]. Environmental Chemistry, 2014(11):1978-1985.

[14] Colomerlluch M, Jofre J , Muniesa M. Antibiotic resistance genes in the bacteriophage DNA fraction of environmental samples [J]. PLoS One, 2011,6(3):17549.

[15] Wendel A F, Brodner A H B, Wydra S, et al. Genetic characterization and emergence of the metallo-β-lactamase GIM-1 inspp. and Enterobacteriaceae during a Long-Term outbreak [J]. Antimicrobial Agents & Chemotherapy, 2013,57(10):5162-5165.

[16] Krüttgen A, Razavi S, Im?hl M, et al.Real-time PCR assay and a synthetic positive control for the rapid and sensitive detection of the emerging resistance gene New Delhi Metallo-β-lactamase-1 (bla(NDM-1)) [J]. Medical Microbiology & Immunology, 2011,200(2):137-141.

[17] Geyer C N, Reisbig M D, Hanson N D. Development of a TaqMan multiplex PCR assay for detection of plasmid-mediated amp C β-lactamase genes [J]. J. Clin. Microbiol., 2012,50(11): 3722-3725.

[18] Huang X Z, Cash D M, Chahine M A, et al. Development and validation of a multiplex TaqMan real-time PCR for rapid detection of genes encoding four types of class D carbapenemase in Acinetobacter baumannii [J]. Journal of Medical Microbiology, 2012,61(11):1532-1537.

[19] 任 佳,姚 宏,劉苗苗,等.厭氧和好氧處理過程中四環(huán)素抗藥基因的豐度 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2016,36(1):268-275.

[20] Datta N, Kontomichalou P. Penicillinase synthesis controlled by infectious R factors in Enterobacteriaceae [J]. Nature, 1965, 208(208):239-241.

[21] 底麗娜,南海辰,夏利寧.TEM型β-內(nèi)酰胺酶 [J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2014,35(7):107-110.

[22] Paterson D L, Bonomo R A. Extended-spectrum beta-lactamases: a clinical update [J]. Clinical Microbiology Reviews, 2005, 18(4):657-686.

[23] Zhou S, Nikolausz M, Zhang J, et al. Variation of the microbial community in thermophilic anaerobic digestion of pig manure mixed with different ratios of rice straw [J]. Journal of Bioscience & Bioengineering, 2016,122(3):334-340.

[24] Song C, Li M, Jia X, et al. Comparison of bacterial community structure and dynamics during the thermophilic composting of different types of solid wastes: anaerobic digestion residue, pig manure and chicken manure [J]. Microb. Biotechnol., 2014, 7(5):424–433.

[25] Sarria J C. Infections caused by kluyvera species in humans [J]. Clinical Infectious Diseases, 2001,33(7):69-74.

[26] Zhao W H, Hu Z Q. Epidemiology and genetics of CTX-M extended-spectrum β-lactamases in Gram-negative bacteria [J]. Critical Reviews in Microbiology, 2013,39(1):71-72.

[27] D'Andrea M M, Arena F, Pallecchi L, et al. CTX-M-type β-lactamases: a successful story of antibiotic resistance [J]. International Journal of Medical Microbiology Ijmm, 2013, 303(6/7):305-317.

[28] Osano E, Arakawa Y, Wacharotayankun R, et al. Molecular characterization of an enterobacterial metallo beta-lactamase found in a clinical isolate of Serratia marcescens that shows imipenem resistance [J]. Antimicrobial Agents & Chemotherapy, 1994,38(1):71-78.

[29] Widmann M , Pleiss J.Protein variants form a system of networks: Microdiversity of IMP metallo-beta-lactamases [J]. PLoS One, 2014,9(7):101813.

[30] Zhao Z, Wang J, Han Y, et al.Nutrients, heavy metals and microbial communities co-driven distribution of antibiotic resistance genes in adjacent environment of mariculture [J]. Environmental Pollution, 2016,220:909-918.

[31] Su J Q, Wei B, Ouyang W Y, et al. Antibiotic resistome and its association with bacterial communities during sewage sludge composting [J]. Environmental Science & Technology, 2015,49(12):7356-7363.

[32] Lauretti L, Riccio M L, Mazzariol A, et al. Cloning and characterization of blaVIM, a new integron-borne metallo-beta- lactamase gene from aclinical isolate [J]. Antimicrobial Agents & Chemotherapy, 1999,43(7):1584- 1590.

[33] Fischer J, San J M, Roschanski N, et al. Spread and persistence of VIM-1 Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in three German swine farms in 2011 and 2012 [J]. Veterinary Microbiology, 2016,200:118-123.

[34] Falgenhauer L, Ghosh H, Guerra B, et al. Comparative genome analysis of IncHI2VIM-1carbapenemase-encoding plasmids of Escherichia coli andisolated from a livestock farm in Germany [J]. Veterinary Microbiology, 2015,45(5):609-624.

[35] Jacoby G A. AmpC beta-lactamases [J]. Clinical Microbiology Reviews, 2009,22(1):161-182.

[36] Endimiani A, Hilty M, Perreten V. CMY-2-producingin the nose of pigs [J]. Antimicrobial Agents & Chemotherapy, 2012,56(8):4556-4557.

[37] Mataseje L F, Baudry PJZhanel G G, Morck D W, et al. Comparison of CMY-2plasmids isolated from human, animal, and environmentalandspp. from Canada [J]. Diagnostic Microbiology & Infectious Disease, 2010,67(4):387-391.

[38] Avison M B, Bennett P M, Walsh T R. Beta-lactamase expression in[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2000,45(6):877-880.

[39] Poirel L, Nordmann P. Carbapenem resistance in: Mechanisms and epidemiology [J]. Clinical Microbiology and Infection, 2006,12(9):826-836.

Abundance dynamics of β-lactamase genes in penicillin biomass-residue composting.

DUAN Hui-ying1, ZHAO Juan1, ZHANG Zhen-hua2, YU Ran1*, ZHANG Di-ni2, LIU Yan2*, WANG Chang-yong2

(1.Department of Energy and Environment Southeast University, Nanjing 210096, China；2.Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Nanjing 210042, China)., 2017,37(10)：3873~3881

In order to reveal the environmental impacts of antibiotic resistance genes (ARGs) during penicillin biomass-residue composting because of the possible antibiotic residues, the relative abundances and distributions of eight typical β-lactamase genes (-TEM、-CTX-M-1、-CTX-M-9、-IMP-1、-VIM-2、-CMY、-OXA-23、-NDM-1) were investigated with quantitative PCR technique. The results indicated that high temperature composting greatly shortened the degradation time of penicillin. No-NDM-1gene was detected in any sample. The abundances of all studied genes were significantly reduced from day 1 to day 30 in the different penicillin biomass-residue composting experiments except those of the-IMP-1and-VIM-2genes which slight increased. The penicillin residue induced the increases of relative abundance of-TEM,-CTX-M-1.-CTX-M-9,-CMY,-OXA-23, and-VIM-2genes during the early composting stage. With the elongation of the composting process, penicillin residue gradually degraded. At the end of composting, the relative abundances of-TEM、-CTX-M-1、-CTX-M-9、-CMYsignificantly decreased in all treated samples and the control in comparison with those of-IMP-1、-VIM-2, which greatly increased.

Penicillin biomass-residue；composting；β-lactamase genes；relative abundance

X172

A

1000-6923(2017)10-3873-09

段會英(1990-),女,山東臨沂人,東南大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院碩士研究生,主要從事污水處理及環(huán)境微生物研究.

2017-03-10

國家自然青年科學(xué)基金資助項目(41401363,41301278);江蘇省自然青年基金資助項目(BK20130102);環(huán)境保護(hù)部環(huán)保公益性行業(yè)科研專項(201209024);2016年公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費項目

* 責(zé)任作者, 余 冉, 副教授, yuran@seu.edu.cn;劉 燕, 副研究員, liuyan@nies.org