城市污水中高效COD去除菌對微藻生長的促進作用研究*

陳洪一 郭仕達 金文標 涂仁杰 韓松芳

(哈爾濱工業大學深圳研究生院，廣東 深圳 518055)

城市污水中高效COD去除菌對微藻生長的促進作用研究*

陳洪一 郭仕達 金文標#涂仁杰 韓松芳

(哈爾濱工業大學深圳研究生院，廣東 深圳 518055)

利用城市污水培養微藻生產柴油既有助于去除污染物，又可回收能源，是解決環境污染與能源危機的研究熱點之一。從城市污水處理系統中篩選有利于微藻生長的高效COD去除菌，并考察其對微藻生長的促進作用。研究結果表明：在篩選的38株菌中有5株為高效COD去除菌，分別命名為L2、L8、L11、W2、W5，5個菌株對COD的去除率均達到80%左右。在原污水培養條件下，菌株L11對微藻的生長具有顯著的促進作用，與空白組相比，穩定期微藻產量提高了97.7%，微藻平均生長速率提高了12.7%，油脂產量提高了75.8%。菌株L11與微藻共培養不僅可以提高微藻產量，同時有利于使污水中的COD維持在較低水平。

COD去除菌 微藻 菌藻共培養 城市污水

Abstract: The cultivation of microalgae using municipal wastewater for bio-diesel production is becoming a hotspot research to solve the problems of water pollution and energy crisis. The COD degrading strains were selected from the municipal wastewater treatment systems and its’ influence on the growth of microalgae in municipal wastewater was investigated. The results showed that five strains，which were named L2，L8，L11，W2 and W5，were good at removing COD，the COD removal efficiencies were about 80%. Under the cultivation with municipal wastewater，the strain L11 had a significant effect on the growth of microalgae. Compared with the control group，the production，growth rate and oil yield of microalgae in stable phase were increased 97.7%，12.7% and 75.8%，respectively. The co-culture of L11 and microalgae not only promote the yield of microalgae，but also kept the concentration of COD in wastewater at a low level.

Keywords: COD removal bacteria; microalgae; microalgae and bacteria co-culture; municipal wastewater

隨著全球能源危機和水環境污染的加劇，利用城市污水培養微藻生產生物柴油工藝逐漸成為解決環境污染和能源危機的新興研究熱點[1]。微藻培養過程中會釋放大量氧氣，可作為好氧異養菌代謝過程的電子受體，有利于污水中有機污染物的去除。此外，微藻生長過程還需要吸收大量的氮、磷元素，有利于降低污水中的氮、磷含量。采用城市污水培養微藻既可獲得能源，還可改善水質，符合我國對環境治理和節能減排的需求。

目前，制約城市污水培養微藻系統的關鍵問題是污水中含有較多的雜質和細菌，使微藻生長不夠穩定，出現微藻產量低和出水水質差的問題。一般認為，微藻培養過程中細菌的存在對微藻生長具有不利影響，但近年來的研究發現，部分細菌對微藻的生長和絮凝沉淀都有積極作用[2]。細菌與微藻之間存在著互利共生、偏利共生等多種關系[3-7]。本研究從微藻與細菌互利共生的角度出發，從城市污水處理系統中篩選有利于微藻生長的高效COD去除菌，考察其對微藻生長的作用，以提高微藻產量和污水處理效果。

1 材料與方法

1.1 菌種的篩選、效果考察及鑒定

菌種分別來源于深圳市某污水處理廠A2/O工藝的二沉池回流段污泥、深圳市某污水處理廠改進型開普敦大學脫氮除磷(MUCT)工藝的二沉池回流段污泥以及利用城市污水培養微藻的藻液，本研究采用梯度稀釋涂布平板分離污泥和藻液中的菌種。

以滅菌后的生活污水為基質，考察分離菌種的COD去除能力，具體方法如下：將150 mL滅菌生活污水加入到250 mL錐形瓶中，按5%(質量分數)的投加量投加菌液(菌密度108個/mL)。隨后將錐形瓶置于30 ℃，120 r/min的恒溫搖床培養箱內培養24 h，然后于7 000 r/min下離心5 min，取上清液測定COD。比較投加不同菌液后COD的降解效率，確定高效COD去除菌株。

對須鑒定的菌株基因組DNA進行提取，將得到的菌株基因組DNA利用16S通用引物27F/1492R進行擴增測序。得到的16S rDNA序列錄入GenBank數據庫，用Blast程序與數據庫中所有序列進行比對分析，所得結果用Mega 5.0軟件構建系統發育樹分析。

1.2 實驗藻種

本研究使用的微藻藻種為蛋白核小球藻，購買于中科院(武漢)水生生物研究所淡水藻種庫，在中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)的藻種保藏號為No.1448，前期經課題組離子注入法誘變篩選得到具有高油脂含量的藻種，適用于城市生活污水培養。

1.3 微藻培養

微藻培養在光照培養箱內，溫度為(25.0±0.5) ℃，由40 W日光燈提供光照，強度約為10 000 lx，每天手動搖晃1～3次。微藻與細菌的共培養采用柱形反應器，反應器直徑為5 cm，長度為50 cm，底端設有曝氣口。菌藻培養過程中曝氣量為50 mL/min，溫度為(25.0±2.0) ℃，曝氣口處接空氣濾頭，內含0.22 μm濾膜，可濾除空氣中的細菌。向柱形反應器中加入600 mL微藻培養基，接入藻種液使反應器內藻液在680 nm的光密度(OD680)約為0.1，然后按特定比例投加藻密度為108個/mL的菌液與藻液共培養，每天測定微藻生物量和OD680，測定微藻生長穩定期的油脂含量。

1.4 測定方法

微藻生物量測定：取0.45 μm濾膜，置于105 ℃的烘箱內干燥24 h后轉移至干燥器內冷卻至室溫，取出稱重，重復上述過程直至濾膜兩次稱量的質量差<0.5 mg；取10 mL藻液樣品于真空泵上0.45 μm濾膜抽濾，將濾膜放入錫紙盤內，置于105 ℃的烘箱4 h，轉移至干燥器內冷卻至室溫，得到干燥濾膜與微藻的總質量。微藻生物量、微藻平均生長速率的計算分別見式(1)、式(2)：

c=(m2-m1)/V

(1)

v=(c1-c0)/t

(2)

式中：c為單位體積藻液內所含微藻的生物量，g/L；m2為干燥濾膜與微藻總質量，mg；m1為干燥濾膜的質量，mg；V為藻液樣品體積，mL；v為微藻平均生長速率，g/(L·d)；c1為穩定期單位體積藻液所含的生物量，g/L；c0為實驗初期單位體積藻液所含的生物量，g/L；t為微藻生長達到穩定期的時間，d。

微藻油脂提取測定：取適量藻液于離心管中，在7 000 r/min下離心10 min，棄去上清液；加入氯仿/甲醇(體積比為2∶1)混合溶液30 mL于離心管中，再加入300 μL的HCl(1 mol/L)，將離心管橫置于150 r/min搖床上振蕩6 h，將振蕩后的藻液加入10 mL NaCl(質量分數0.9%)溶液，旋渦振蕩2 min使其混合均勻，然后在7 000 r/min下離心5 min，離心后用玻璃針筒將下層有機相轉移至已干燥至恒質量的錫紙盤內，將錫紙盤放置至通風櫥，待有機溶劑完全揮發后余下微藻油脂，再將錫紙盤轉移至60 ℃烘箱內干燥到恒質量，微藻油脂產量及含油率分別由式(3)、式(4)計算：

y=(m4-m3)/V

(3)

l=y/c×100%

(4)

式中：y為單位體積藻液內微藻的油脂產量，g/L；m4為干燥錫紙盤與微藻油脂的總質量，mg；m3為干燥錫紙盤的質量，mg；l為微藻的含油率，%。

2 結果與分析

2.1 菌株的COD去除效果

選取城市污水處理廠二沉池回流段污泥和微藻培養系統的藻液，利用梯度稀釋法分離其中的細菌，經過多次純化后得到38株菌種，其中有6株菌無法在液體培養基中生長，對余下的32株菌進行COD去除效果考察實驗，結果如表1所示。由表1可見，菌株L2、L8、L11、W2、W5對COD的去除效果較好，為高效COD去除菌，其對COD去除率均達到80%左右，其中W5的COD去除率最高，為84.3%。

2.2 高效COD去除菌對微藻生長的影響

為考察高效COD去除菌對微藻生長的影響，應首先排除微藻培養系統中存在的雜菌。為此，本研究采用組合抗生素處理藻液中的雜菌，然后利用SYBR green I核酸熒光染料對藻液染色，制作玻片后置于熒光倒置顯微鏡下觀察，由于染色后核酸在熒光下顯綠色，且微藻細胞核酸遠大于細菌核酸，因此在熒光顯微鏡下可以明顯觀察到藻液中是否含有細菌。藻液滅菌處理前后的核酸染色鏡檢對比結果見圖1，由圖1可以看出，組合抗生素的滅菌效果良好，處理后的藻液中幾乎不含雜菌。

表1 不同菌株的COD去除效果考察

圖1 滅菌處理前后核酸染色鏡檢對比Fig.1 The comparison of nucleic acid staining microscopy before and after sterilization

圖2 高效COD去除菌對微藻生長的影響Fig.2 The effect of COD removal bacteria on microalgae growth

分別以滅菌污水與原污水為菌藻共培養的培養基，考察5株高效COD去除菌對微藻生長的影響，結果如圖2所示。由圖2可見，在滅菌污水培養下，菌株W2對微藻生長有明顯的促進作用，接種3 d后W2組微藻生物量明顯高于不添加菌株的空白組，7 d后微藻生物量達到0.957 g/L；L11組、L2組在培養第4天后微藻增長速度開始加快，培養7 d后微藻生物量分別達到了0.798、0.635 g/L，說明菌株L11、L2對微藻生長的調整期較長，使微藻在第4天后才開始對數生長；總體看來，L8組、W5組在整個培養周期內微藻生物量增長始終低于空白組，說明這兩種菌株對微藻的生長沒有促進作用。在原污水培養條件下，菌株L11、W2對微藻生長表現出一定的促進作用，L11組、W2組在培養第7天的微藻生物量分別達0.586、0.509 g/L。對比可知，菌株W2在原污水培養條件下對微藻生長的促進沒有滅菌污水培養時顯著，說明W2菌在原污水中的生長受到一定程度的抑制，在與其他細菌的競爭中處于劣勢；而菌株L11在原污水中對微藻的生長仍有顯著的促進效果，說明菌株L11在原污水中可以生長為優勢菌。此外，L11組中微藻的穩定期更長，有利于后期微藻的收獲。

考察不同菌株對穩定期微藻生物量以及微藻平均生長速率的影響，結果如圖3所示。由圖3可見，在滅菌污水培養下，W2組穩定期微藻生物量最高，為0.940 g/L，比空白組高出近120.0%，W2組微藻平均生長速率為0.137 g/(L·d)，比空白組高25.7%；L11組微藻生物量稍低，為0.802 g/L，比空白組高出83.0%，W2組微藻平均生長速率0.114 g/(L·d)，與空白組相比提高了4.7%。在原污水培養條件下，L2組與L8組的微藻平均增長速率最高，但其生長周期短，穩定期生物量不高，不利于后期微藻收獲；L11組微藻平均增長速率較L2組與L8組略低，為0.090 g/(L·d)，但其微藻生長周期長，穩定期時的微藻生物量可達0.629 g/L，比空白組高97.7%，平均生長速率比空白組高12.7%。

圖3 不同菌株對微藻生物量與平均增長速率的影響Fig.3 The effect of different strains on production and growth rate of microalgae

研究中還考察了不同菌種對穩定期微藻油脂產量和微藻含油率的影響，結果見圖4。在原污水培養下，空白組微藻含油率23.9%，L11組微藻含油率為21.8%，雖比空白組稍低，但油脂產量提高了67.3%。在滅菌污水培養下，空白組微藻含油率為28.5%，L11組微藻含油率為23.0%，也較空白組低，但油脂產量提高75.8%。綜上所述，在5株高效COD去除菌中，菌株L11最適合用于促進原污水中的微藻生長。

圖4 不同菌株對微藻油脂產量和油脂含率的影響Fig.4 The effect of different strains on the fat yield and fat ratio of microalgae

2.3 菌種鑒定及作用機制分析

對菌株L11進行菌種鑒定，將菌株L11的16S rDNA序列上傳到GenBank，經比較分析后發現該菌的16S rDNA序列與Paracoccus(副球菌屬)的多株細菌相似性達到97%以上，其中與Paracoccushuijuniaestrain FLN-7、Paracoccusbengalensisstrain JJJ及Paracoccusmarinusstrain KKL-A5的相似性分別為98%、97%、97%，因此將菌株L11歸類于Paracoccus屬的置信度較高，基本可以確定為Paracoccus屬。

Paracoccus屬在自然界分布廣泛，具有較多功能。SUN等[8]從污水生物處理系統分離篩選出細菌Paracoccushuijuniaesp.，其對酰胺類化合物具有良好的降解作用，這與本研究中菌株L11對于污水中COD具有高效降解能力相符。COD去除菌大多屬于好氧異養菌，微藻生長過程中會不斷分泌多糖及蛋白[9]等物質并通過光合作用釋放氧氣，COD去除菌可有效利用這些有機物和氧氣進行生長，并釋放出CO2供微藻進行光合作用，進而提高微藻的生長速率；TSAVKELOVA等[10]對蘭科植物根系的細菌功能性進行分析，發現Paracoccus屬細菌可以分泌植物激素吲哚-3-乙酸，這種植物激素對微藻的生長具有顯著的促進作用，且植物激素濃度在細菌生長穩定期達到最高；FARIDHA等[11]利用氣質聯用色譜在Paracoccus屬細菌胞外分泌物中發現了8種具有抗菌性能的化合物，說明Paracoccus屬細菌可以在復雜的生長環境中具備較強的競爭能力。綜合上述分析，菌株L11可能通過以下兩種途徑促進微藻的生長：一是釋放CO2供微藻進行光合作用；二是分泌某種植物激素促進微藻生長。

2.4 菌藻共培養實驗驗證

將微藻與菌株L11同時接種到原污水中，考察共培養條件下微藻的生物量及污水COD的去除效果，結果如圖5所示。由圖5可見，與空白組相比，L11組對COD具有較快的降解速率，培養1 d污水COD即可迅速降至50 mg/L以下，說明加入菌株L11在培養初期對COD的降解起到顯著的促進作用；培養第3～8天后，微藻處于快速生長期，空白組中COD濃度出現上升趨勢，可能是由于微藻衰亡期細胞裂解導致微藻細胞內含物(如糖類、蛋白質、核酸等)釋放到生長環境中，而L11組中COD的質量濃度始終維持在50 mg/L左右，說明L11菌對維持微藻培養系統中COD的穩定性具有一定作用，但培養9 d后，L11組COD的質量濃度也開始上升，說明菌株L11和微藻共培養的周期應控制在7～8 d。此外，L11組穩定期微藻生物量可達0.6 g/L以上，而空白組穩定期微藻生物量僅為0.3 g/L左右。綜上，菌株L11有利于使污水COD維持在較低水平，并且提高微藻產量。

圖5 菌藻共培養過程中微藻生物量與COD的變化規律Fig.5 The variation of microalgae biomass and COD concentration during the co-culture process

3 結 論

從城市污水處理廠的回流段污泥和微藻培養系統的藻液中篩選出38株細菌，其中5株對COD的去除效果較好，COD去除率可達80.0%左右；5株高效COD去除菌中，菌株L11最適合用于促進污水中的微藻生長，在原污水培養下，穩定期微藻生物量比空白組增加了97.7%，微藻平均生長速率提高了12.7%，油脂產量提高了75.8%；經鑒定，L11屬于副球菌屬，菌藻共培養過程中，菌株L11的投加有利于使污水中的COD維持在較低水平，并提高微藻產量。

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ThefacilitationofCODremovalbacteriaonmicroalgaegrowthinmunicipalwastewater

CHENHongyi，GUOShida，JINWenbiao，TURenjie，HANSongfang.

(ShenzhenGraduateSchool，HarbinInstituteofTechnology，ShenzhenGuangdong518055)

2016-12-28)

陳洪一，女，1987年生，博士，主要從事污水處理研究工作。#

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*深圳市環境科研計劃《特種微生物菌劑在城市污水處理系統升級改造中的應用》；深圳市科技計劃項目(No.JCYJ20150529114024234)。

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.08.017