萘降解菌的分離鑒定、生長特性和降解途徑探究*

朱 星 王若宇 汪 銳 白 雪 任龍飛 邵嘉慧 張小凡

(上海交通大學環境科學與工程學院，上海 200240)

萘降解菌的分離鑒定、生長特性和降解途徑探究*

朱 星 王若宇 汪 銳 白 雪 任龍飛 邵嘉慧 張小凡#

(上海交通大學環境科學與工程學院，上海 200240)

從天津大港油田附近污染土壤中分離出1株萘降解菌株DGN9，經形態學和16SrDNA測序鑒定，該菌株屬于無色桿菌(Achromobactersp.)。其最適生長溫度為30 ℃，最適pH為7，最適萘初始質量濃度為1 000mg/L，在NaCl質量分數為1%、2%的條件下生長良好，具有一定的耐鹽性。其對萘的可能降解途徑為水楊酸降解途徑。同時，該菌株對蒽、菲、芘、聯苯、對苯二甲酸、鄰苯二酚、苯酚、苯甲酸鈉、水楊酸、鄰苯二甲酸等底物也有降解作用，具有底物生長廣譜性。

萘 無色桿菌屬 生長特性 降解途徑

多環芳烴(PAHs)是指兩個或兩個以上苯環以線狀、角狀或簇狀排列的稠環有機化合物[1-2]，由于疏水性和穩定性使其容易在人體內富集，具有致癌、致畸和致突變效應，是一類普遍存在于環境中的對生態環境和人體健康具有嚴重危害的難降解污染物[3]。1976年，美國環境保護署(USEPA)就已將16種PAHs列為優先控制的有機污染物[4]。隨著研究的進步，越來越多的PAHs被發現，因此尋求高效、經濟、環保的PAHs去除方法顯得越來越重要。

目前，去除污水中PAHs的方法有物理、化學和生物方法[5]。物理方法因不能徹底降解PAHs，已逐漸被研究人員放棄；化學方法雖然能有效降解PAHs，但同時存在二次污染和高能耗等問題。利用微生物降解PAHs的生物方法具有經濟、高效、二次污染少等優勢，因此成為了去除污水中PAHs的理想方法。大量研究發現并分離了能以PAHs為碳源進行降解的微生物[6]。萘是PAHs中結構最簡單、分子量最小的一種化合物，一直是研究PAHs降解的典型。已報道的萘降解菌很多，主要有反硝化產堿菌(Alcaligenesdenitrificans)、分支桿菌(Mycobacteriumsp.)、惡臭假單胞菌 (Pseudomonasputida)、泡馕假單胞菌(Pseudomonasvesicularis)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、紅球菌(Rhodococcussp.)和莫拉氏菌(Moraxellasp.)等[7-8]。這些萘降解菌株對鹽度要求比較苛刻，關于耐鹽性萘降解菌的分離研究還比較少。辛樹權等[9]篩選出了一株可在NaCl質量濃度為3 g/L的條件下良好生長的萘降解菌。饒麗[10]發現的萘降解菌可在2%(質量分數)NaCl下良好生長。

無色桿菌(Achromobactersp.)是已知的可用于降解多種難降解污染物的微生物，如石油、苯酚、氯酚和苯甲酸等。唐玉斌等[11]發現，木糖氧化無色桿菌可以降解蒽、菲、芘、4種PAHs，具有生長底物廣譜性。李妮等[12]從孔雀綠污染土壤中分離出1株無色桿菌，發現其還可高效脫除孔雀綠。目前，關于無色桿菌降解萘的研究不多。因此，探究無色菌株對萘的降解途徑及其廣譜性和耐鹽性對理解無色桿菌降解PAHs具有一定的指導意義。本研究從天津大港油田附近污染土壤中分離出1株萘降解菌，對其進行形態學觀察和16S rDNA測序分析，探究其最佳生長條件，并在最佳條件下對萘的降解途徑進行了研究，同時對其廣譜性和耐鹽性進行了討論。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 土 樣

土樣取自天津大港油田附近(38°43′48″N、117°30′36″E)，該處土壤長期受石油污染，采集深度為5～10 cm，采集到的土樣放入塑封袋中，密封，置于4 ℃冰箱保存。

1.1.2 培養基

無機鹽液體培養基[13]：Na2HPO42.2 g、KH2PO40.8 g、(NH4)2SO44.95 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、FeSO4·7H2O 10 mg、CaCl2·2H2O 10 mg、酵母粉 50 mg、礦物液10 mL，H2O 1 000 mL。其中，每100 mL礦物液中含ZnSO4·7H2O 50 mg、MnSO4·5H2O 50 mg、Na2MoO4·2H2O 10 mg、CuSO4·5H2O 5 mg、H2O 100 mL。

無機鹽固體培養基在無機鹽液體培養基的基礎上加2%(質量分數)瓊脂。

1.1.3 儀 器

安捷倫7890B/5977A氣相色譜質譜聯用儀(GC/MS)， HP-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；尼康E200光學顯微鏡；日立S-520掃描電子顯微鏡(SEM)；UV-1800紫外可見分光光度計；Thermo X1R高速離心機；MLS-3750高壓滅菌鍋。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的富集與純化

取0.5 g土樣置于30 mL的蒸餾水中，在30 ℃、180 r/min條件下培養24 h，取上清液3 mL轉接到30 mL無機鹽液體培養基中，30 ℃、180 r/min條件下培養7 d以富集萘降解菌，分別在萘初始質量濃度為100、300、500、500、500 mg/L時連續富集5次后，選擇菌落生長較好的樣品在無機鹽固體培養基上多次劃線分離純化，-80 ℃甘油保存，編號為DGN9。

1.2.2 菌種鑒定

在光學顯微鏡和SEM觀察的基礎上利用16S rDNA測序分析進行鑒定。聚合酶鏈式反應(PCR)體系：DNA模板0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，DNA聚合酶0.2 μL, 10 μmol/L引物(27F 5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’、1492R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)各 0.5 μL，加雙蒸水至25 μL；擴增條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環后72 ℃修復延伸10 min，4 ℃終止反應。擴增產物經測序后在美國國立生物技術信息中心(NCBI)進行blast 比對，通過MEGA 4.1計算遺傳距離，鄰接法構建系統發育樹。

1.2.3 菌株的生長特性測定

菌株的生長特性包括最適生長溫度、最適萘初始濃度、最適pH、耐鹽性及生長曲線。測定最適生長溫度時，設置20、25、30、35 ℃ 4種不同溫度，pH為7，萘初始質量濃度為500 mg/L；測定最適萘初始質量濃度時，設置300、500、700、1 000、1 200、1 400 mg/L 6個梯度，溫度為30 ℃，pH為7；測定最適pH時，設置pH為6、7、8、9、10，萘初始質量濃度為1 000 mg/L，溫度為30 ℃；測定菌株耐鹽性時，設置NaCl質量分數為1%、2%、4%、6%、8%，萘初始質量濃度為1 000 mg/L，溫度為30 ℃，pH為7。以上試驗均于250 mL的三角搖瓶(含90 mL無機鹽液體培養基)中進行，180 r/min搖床振蕩培養96 h，每隔12 h用紫外可見分光光度計在600 nm波長處測光密度(OD600)，每組試驗平行3次。生長曲線測定于250 mL三角搖瓶(含90 mL無機鹽液體培養基，萘初始質量濃度為1 000 mg/L)中進行，按10%(體積分數，下同)的接種量接種菌株DGN9到90 mL無機鹽液體培養基中，30 ℃、180 r/min、pH=7條件下振蕩培養96 h，每隔8 h測一次OD600，平行3次，以不接種菌液作為空白(CK)對照。

1.2.4 菌株的萘降解效率測定

將對數期菌株按10%接種量接種到100 mL無機鹽液體培養基中(萘初始質量濃度為1 000 mg/L)，30 ℃、180 r/min振蕩培養，每隔24 h取培養液3 mL，測OD600并用正己烷按1∶1(體積比)萃取，無水硫酸鈉脫水，待GC/MS分析。色譜條件:載氣為He；進樣量為1 μL；升溫程序為80 ℃保持2 min，以15 ℃/min升至190 ℃保持2 min，3 ℃/min升至300 ℃保持2 min；質譜條件：離子源溫度為230 ℃，檢測器溫度為315 ℃。

1.2.5 菌株的萘降解途徑

通過萘雙加氧酶的鐵硫蛋白質大亞基基因(nahAC)[14]、水楊醛脫氫酶基因(nahF)[15]、水楊酸羥基化酶基因(nahG)[16]和兒茶酚2,3-雙加氧酶基因(nahH)[17]考察菌株的萘降解途徑。4種關鍵酶基因的PCR體系參照1.2.2，相應的引物見表1。擴增條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，32個循環后72 ℃修復延伸7 min。

表1 關鍵酶基因引物

1.2.6 菌株的底物特異性測定

將對數期菌株按10%接種量分別接種到30 mL含蒽、菲、芘、聯苯、對苯二甲酸、鄰苯二酚、苯酚、苯甲酸鈉、水楊酸、鄰苯二甲酸的無機鹽液體培養基中(質量濃度均為500 mg/L)，在pH=7、30 ℃、180 r/min下振蕩培養7 d，測定OD600，平行3次。

2 結果與討論

2.1 菌株的鑒定

DGN9菌落呈圓形，表面輕微隆起，淡黃色，濕潤，半透明，邊緣整齊，光滑。革蘭氏染色為陰性，在光學顯微鏡下呈桿狀，SEM觀察如圖1所示。

16S rDNA的測序分析得到的系統發育樹表明，菌株DGN9與Achromobacterxylosoxidanssubsp. (GU0145)的同源性達到98.6%，與Achromobacterpulmonis(KT808881.1)的同源性為97.4%，可鑒定為無色桿菌。

圖1 DGN9的SEM圖Fig.1 SEM image of DGN9

2.2 菌株DGN9的生長特性

由圖2(a)可見，30 ℃的生長曲線OD600高于其他溫度，因此30 ℃為最適生長溫度；圖2(b)表明，萘初始質量濃度為1 000 mg/L時，生長曲線的OD600高于其他濃度，因此最適萘初始質量濃度為1 000 mg/L；圖2(c)表明，當pH為7～9時，菌株DGN9生長良好，最適pH為7；如圖2(d)所示，NaCl質量分數為1%、2%條件下DGN9生長良好，說明DGN9具有一定的耐鹽性，但當鹽濃度過高時菌株生長受到抑制。

DGN9在萘初始質量濃度為1 000 mg/L的無機鹽培養基中30 ℃、180 r/min、pH=7條件下培養96 h的生長曲線如圖3所示。前8 h為遲緩期，8～40 h為對數增長期，40～80 h為穩定期，80 h后進入衰亡期。

2.3 菌株DGN9的底物特異性

分別以蒽、菲、芘、聯苯、對苯二甲酸、鄰苯二酚、苯酚、苯甲酸鈉、水楊酸、鄰苯二甲酸為碳源，在pH=7、30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養7 d后，培養基由透明變混濁，OD600明顯升高，測定結果如表2所示。由此可見，菌株DGN9可以不同有機物為碳源，具有底物生長廣譜性。

表2 DGN9的底物特異性

2.4 菌株DGN9的萘降解途徑

4種萘降解途徑的關鍵酶基因PCR擴增結果如圖4所示。nahAC和nahG擴增產物條帶清晰可見，nahF條帶比較模糊，沒有觀察到nahH的擴增產物條帶。目前，已知的萘降解途徑主要有兩種：一種為水楊酸降解途徑；另一種為龍膽酸降解途徑，但龍膽酸降解途徑比較罕見[18-21]。由關鍵酶PCR擴增結果可以判斷，菌株DGN9對萘的降解可能為水楊酸降解途徑，但不排除存在其他未知的降解途徑，有待進一步深入研究。

圖2 菌株DGN9的生長特性Fig.2 Growth characteristics of DGN9

圖3 DGN9 的生長曲線Fig.3 Growth curve of DGN9

3 結 論

菌株DGN9鑒定為無色桿菌，其最佳生長條件為：最適生長溫度30 ℃、最適萘初始質量濃度1 000 mg/L、最適pH為7，在NaCl質量分數為1%、2%的條件下可以生長良好。此外，菌株DGN9具有底物生長廣譜性，對萘降解途徑可能為水楊酸降解途徑。

圖4 萘降解途徑的關鍵酶基因PCR擴增結果Fig.4 PCR amplification of key enzyme genes

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Isolation,identification,growthcharacteristicsanddegradationpathwayofnaphthalenedegradingbacteria

ZHUXing,WANGRuoyu,WANGRui,BAIXue,RENLongfei,SHAOJiahui,ZHANGXiaofan.

(SchoolofEnvironmentalScienceandEngineering,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240)

A naphthalene degrading bacteria DGN9 was isolated from Dagang Oil Field in Tianjin. Through morphological analysis and 16S rDNA sequence analysis,DGN9 was identified asAchromobactersp. Its optimum growth temperature was 30 ℃,optimum initial concentration of naphthalene was 1 000 mg/L,and optimum growth pH was 7. DGN9 could grow well when NaCl mass percentage was up to 1% or 2%. The possible degradation pathway might be salicylic acid pathway. The strain could also degrade anthracene,phenanthrene,pyrene,biphenyl,p-phthalic acid,catechol,phenol,sodium benzoate,salicylic acid and phthalic acid,covering a wide variety of substrates.

naphthalene;Achromobactersp.; growth characteristics; degradation pathway

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.04.007

2016-06-20)

朱 星，女，1992年生，碩士研究生，主要從事萃取生物膜反應器處理難降解有機物的研究。#

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*國家自然科學基金資助項目(No.21577089)；上海交通大學大學生創新項目(No.IPP12175)。