益氣活血組方對大鼠缺血心肌血管新生作用及對血管內皮生長因子和堿性成纖維生長因子的影響

胡國恒 朱榮華 肖 青 邊冠積

(1 湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙，410007； 2 湖南中醫藥大學研究生院，長沙，410208)

益氣活血組方對大鼠缺血心肌血管新生作用及對血管內皮生長因子和堿性成纖維生長因子的影響

胡國恒1朱榮華2肖 青2邊冠積2

(1 湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙，410007； 2 湖南中醫藥大學研究生院，長沙，410208)

目的：探討益氣活血組方對急性心肌梗死后大鼠缺血心肌組織血管新生作用和對血管內皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維生長因子(bFGF)表達的影響。方法：建立心梗模型后，將40只雄性SD大鼠，采用隨機數字表法分為4組：模型組、假手術組、麝香保心丸、益氣活血組方。運用免疫組化法檢測梗死心肌邊緣區微血管計數(MVC)和微血管密度(MVD)及VEGF和bFGF表達；同時應用Western blot技術檢測各組大鼠缺血心肌VEGF和bFGF蛋白質水平表達變化。結果：益氣活血組方和麝香保心丸組分別與模型組比較，梗死心肌邊緣區微血管計數和微血管密度都顯著高于后者(P<0.01)。益氣活血組方、麝香保心丸組中缺血心肌VEGF和bFGF表達以及其蛋白表達水平較其余組顯著升高(P<0.01)。結論：益氣活血組方能明顯促進心梗后大鼠缺血心肌血管新生，上調心肌VEGF和bFGF蛋白表達可能是其中一個重要的作用機制。

益氣活血；血管新生；血管內皮生長因子；堿性成纖維生長因子

本實驗通過對益氣活血組方對急性心肌梗死大鼠缺血心肌血管新生的影響的觀察，并且應用免疫組織化學法檢測大鼠缺血心肌微血管計數(MVC)和微血管密度(MVD)及血管內皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維生長因子(bFGF)表達，更進一步地解釋益氣活血組方保護缺血心肌細胞，恢復心肌細胞功能，以及促進血管新生的機制，為急性心肌梗死的中醫治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性SD大鼠，體重(230±20)g，所有實驗大鼠均由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。

1.1.2 藥物 益氣活血組方(湖南中醫藥大學第一附屬醫院研制)總共由4味藥組成：黃芪50 g、當歸10 g、川芎25 g、丹參25 g；麝香保心丸：批準文號為國藥準字Z31020068；由上海和黃藥業有限公司提供。

1.1.3 試劑與儀器 進口石蠟購于徠卡儀器有限公司(德國)；蘇木素-伊紅購于Sigma公司(美國)；兔抗鼠多克隆抗體CD34、VEGF、bFGF，山羊抗兔IgG均購于Proteintech三鷹(德國)；DAB顯色試劑盒購于博士德生物公司(武漢)；紅細胞裂解液購于Solarbio公司(上海)；DH-140小動物呼吸機購于奧爾特生物科技公司(上海)；Nihon Kohden型心電圖機購于光電醫用電子儀器公司(上海)；低溫高速臺式離心機購于賀利氏公司(德國)；石蠟切片機、石蠟包埋機及冷凍臺購于Leica公司(德國)；流式細胞計數儀購于BD公司(美國)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將40只雄性SD大鼠采用完全隨機的原則，共等分成假手術組、模型組、麝香保心丸組、益氣活血組方組，每組10只大鼠。大鼠飼養1周后開始造模，心肌梗死模型參照文獻[1-2]復制。首先用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g比例，經腹腔麻醉動物,然后氣管切開，插管，連接小動物呼吸機，在第3～4肋間逐層打開胸腔，剪開心包膜、徹底暴露心臟，最后用1根零號醫用縫合線結扎左前降支，以心電圖出現QRS波群增高、增寬、ST段抬高為結扎成功標志，逐層關胸。假手術組只穿線不結扎，余步驟基本相同。

1.2.2 給藥方法 假手術組：每日用等體積蒸餾水灌胃。模型組：每日用等體積蒸餾水灌胃。麝香保心丸組：正常60 kg體重的成人，每日所需劑量為135 mg，大鼠給藥劑量的換算按成人與大鼠劑量的體表面積系數來計算，大鼠每日所需劑量為3.10 mg，將其溶于等體積蒸餾水中灌胃。益氣活血組方：正常60 kg體重成人，每日劑量為原方粉碎后100 g，計算方法同上，換算成大鼠的劑量為2.29 g，同樣溶于等體積蒸餾水中灌胃。手術后24 h開始進行灌胃，每天只灌胃1次，持續2周。

1.2.3 標本留取 最后1次灌胃后，所有大鼠禁止喂食24 h，只給水，予以頸髓離斷法處死后，立即開胸，留心臟標本。因造模手術后大鼠死亡及取材時心臟標本篩選，最后從4個組里面選取了6個心臟標本用于指標檢測。在約為心臟乳頭肌平面將心臟橫切為上下兩份,近心尖部梗死區用10%甲醛液固定，4 ℃冰箱保存,用于免疫組織化學染色及心肌微血管數及微血管密度等檢測；近心底部迅速凍存于-80 ℃冰箱。

1.2.4 大鼠梗死心肌邊緣區MVC和MVD指標和檢測方法 血管內皮細胞被CD34標記后，采用免疫組織化學染色的方法，通常會被染成棕黃色。至于判斷微血管的標準以及微血管計數的方法則完全按照參考文獻[3-4]進行。每張切片采用隨機的原則，選取5個視野，分別測定MVC、MVD的數值，取它們的平均數作為最后的數據。

1.2.5 大鼠梗死心肌邊緣區VEGF和bFGF表達的檢測(免疫組織化學法) 在光鏡下面觀察，VEGF和bFGF的陽性表達以細胞內出現棕黃色或黃色顆粒沉著。最后使用病理圖像分析系統，計算梗死邊緣區心肌每視野(×400)中平均吸光度。每張切片隨機選取5個視野，取其平均值作為本例大鼠的吸光度(A)值。

1.2.6 大鼠梗死心肌邊緣區VEGF和bFGF蛋白水平檢測(Western blot) 首先將心肌勻漿蛋白從-80 ℃冰箱中取出后，然后對漿液進行復溫處理，取蛋白上清，按照SDS-PAGE凝膠配置試劑盒說明書的要求，進行電泳，轉膜，封閉，然后加入一抗(1∶1 000)(兔抗鼠VEGF、bFGF)，將其放置在室溫環境下，孵育2 h，洗滌后加入二抗，同樣在室溫條件下再孵育2 h，再洗滌，放置ECL發光劑中，顯影，定影，蒸餾水沖洗終止，再使用凝膠圖像處理系統分析結果。內參使用β-actin，以VEGF/β-actin和bFGF/β-actin灰度比值作為統計量。

2 結果

2.1 大鼠梗死心肌邊緣區MVC和MVD比較 益氣活血組方分別與模型組和假手術組比較，麝香保心丸與模型組和假手術比較，益氣活血組方與麝香保心丸組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 大鼠梗死心肌邊緣區VEGF和bFGF的表達 在光鏡下，4組大鼠心肌組織都可見棕黃色或黃色陽性表達。益氣活血組方分別與假手術組和模型組比較，麝香保心丸分別與假手術和模型組比較，益氣活血組方與麝香保心丸組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 4組大鼠梗死心肌邊緣區微血管計數(MVC)和微血管密度(MVD)比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與麝香保心丸組比較，▲P<0.05

表2 4組大鼠梗死心肌邊緣區血管內皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維生長因子(bFGF)的表達

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與麝香保心丸組比較，▲P<0.05

2.3 VEGF和bFGF的免疫組織化學染色結果 鏡下觀察(×400)，在假手術組中，可見少許散在的棕黃色淡染細胞；模型組可見梗死周邊陽性細胞有少量片狀分布；麝香保心丸組見梗死周邊區有較多VEGF陽性表達；益氣活血方組見梗死周邊有大量VEGF陽性表達。bFGF與VEGF陽性表達結果相近，益氣活血方組稍高于麝香保心丸組，兩者陽性表達顯著高于假手術組和模型組(圖1，圖2)。

圖1 4組心肌VEGF免疫組織化學染色(×400)

圖2 4組心肌bFGF免疫組織化學染色(×400)

2.4 4組大鼠的梗死心肌的邊緣區域VEGF，bFGF蛋白的表達 益氣活血組方分別與假手術組和模型組比較，麝香保心丸組與假手術組和模型組比較；模型組和假手術組比較，差異均統計學意義(P<0.05)(圖3，圖4)。

3 討論

急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)是心肌的急性缺血性壞死，它是在冠狀動脈病變的基礎上，出現冠狀動脈供血急劇減少或者中斷[5]。目前治療AMI的方法主要有以下4種：藥物治療；經皮冠狀動脈介入治療(PCI)；經冠狀動脈旁路銜移植術(CABG)；骨髓間充質干細胞(BMSCS)移植術。由于受多種因素應用的限制，目前臨床常應用前3種治療方案進行治療[6]。藥物治療是最基本的治療措施，西藥治療有許多不良反應，且單用西藥療效不是很好，在這方面，中醫藥對AMI的治療具有良好的療效。

圖3 4組Western blot結果條帶

注：A為假手術組,B為模型組(B)，C為益氣活血組方組，D為麝香保心丸組

圖4 4組大鼠梗死心肌的邊緣區域VEGF，bFGF蛋白表達比較

AMI在中醫屬于為“胸痹”“心痛”范疇，張仲景就曾在《金匱要略》中寫道：“夫脈當取太過不及，陽微陰弦，即胸痹而痛”[7]。陽微即是本虛，陰弦即是標實，而氣虛血瘀是AMI最常見的發病機制。一切疾病的發生都離不開邪盛與正虛2個方面，因此治療上應祛邪與扶正相結合。益氣活血組方正是基于此病機而創立的，全方由黃芪、當歸、丹參、川芎四藥組成。全方共奏益氣活血通絡。本方中黃芪[8-9]、當歸[10-11]、川芎[12]等藥物，能夠增加側支循環，增加血流灌注量，保護缺血心肌。并且既往實驗研究表明[13]，益氣活血組方可以通過防治和逆轉心肌缺血這一機制得以防止心梗癥狀的加重,且其改善心肌缺血與促進缺血心肌血管新生具有相關性，提示益氣活血中藥治療冠心病的重要機制之一可能就是促血管新生。

VEGF和bFGF是促血管新生因子中最主要的2個。在血管新生中，VEGF是最為關鍵的一個因子，它可以調節內皮細胞胞外基質溶解、內皮細胞遷移、增生和管腔形成。bFGF是當前研究最多、生物效應最強、作用最廣泛的成纖維細胞生長因子(FGF)之一[14]，在體內和體外均能明顯促進新生血管形成[15]。近來有研究證實，兩者在促進血管新生方面有著十分緊密的聯系。

本實驗結果顯示：益氣活血組方與模型組比較，微血管計數與微血管密度顯著增加(P<0.01)；益氣活血組方稍高于麝香保心丸組(P<0.05)；表明益氣活血組方確實能夠促進血管新生。通過對各組大鼠梗死邊緣區心肌VEGF和bFGF表達的檢測，結果顯示：益氣活血組方與模型組比較，心梗邊緣區域VEGF和bFGF陽性表達顯著增加(P<0.01)；益氣活血組方與麝香保心丸比較陽性表達稍高(P<0.05)；表明益氣活血組方促進血管新生，可能與促進VEGF和bFGF的表達有關。同時通過運用Western blot技術，檢測各組大鼠梗死心肌邊緣區域中的VEGF，bFGF的蛋白水平，結果顯示:益氣活血組方大鼠梗死心肌邊緣區域VEGF和bFGF蛋白水平顯著提升，明顯高于模型組(P<0.01)，稍高于麝香保心丸組(P<0.05)。通過對本實驗數據進行整理，分析，不難得出MVC、MVD與VEGF和bFGF蛋白表達呈正相關這一結論，這一結果表明益氣活血組方促進缺血心肌血管新生的機制與促進VEGF和bFGF蛋白的表達相關。但具體作用機制，還有待進一步研究。

[1]李鑫輝，張炳填，喻嶸.栝蔞薤白半夏湯對急性心肌缺血大鼠保護作用的研究[J].湖南中醫藥大學學報,2009,29(1):19-21,25.

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[3]胡國恒，胡哲，盛望，等.益氣活血方對大鼠缺血心肌血管新生及HGF影響的研究[J].中國中醫急癥,2013,22(9):1478-1479,1484.

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EffectofYiqihuoxueDecoctiononAngiogenesisandExpressionofVEGFandbFGFintheIschemicMyocardiumofRats

Hu Guoheng1,Zhu Ronghua2,Xiao Qing2,Bian Guanji2

(1TheFirstAffiliatedHospitalofHunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410007,China;2HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China)

Objective:To investigate the effects of Yiqi Huoxue Decoction on the angiogenesis and the protein expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor(bFGF) in the ischemic myocardium of rats with acute myocardial infarction.MethodsAfter the animal model of acute myocardial infarction (AMI) in rats is established,40 males SD rats were divided into 4 groups by random number table:model group,sham operation group,Shexiangbaoxin group and Yiqi Huoxue Formula group. The microvessel count(MVC),microvessel density (MVD) and expression of VEGF and bFGF in the ischemic myocardium were detected by immunohistochemistry.The change levels of VEGF and bFGF protein in the ischemic myocardium were detected by Western blot.ResultsYiqi Huoxue Formula group and Shexiangbaoxin group were compared with the model group,the infarcted myocardium edge area of microvessel count and microvessel density were significantly higher than that of the latter(P<0.01).The expression of VEGF and bFGF about Yiqi Huoxue Formula group and Shexiangbaoxin group and its protein expression level was significantly increased compared with the other groups(P<0.01).ConclusionYiqi Huoxue Formula group can significantly promote local angiogenesis in ischemic myocardium of rats after myocardial infarction, upregulation of myocardial VEGF and bFGF protein may be one of important mechanisms.

Yiqi Huoxue;Angiogenesis;VEGF;bFGF

湖南省科技廳計劃項目(2015SK20161;2015SK2016)

胡國恒(1961.09—)，男，博士，二級教授，博士研究生導師，心腦血管疾病的中醫藥防治研究，E-mail: hugh9198@163.com

R289.9；R364

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.10.036

(2016-12-22收稿 責任編輯：楊覺雄)