中藥醫院制劑活血益氣方對裸鼠抑瘤作用及小鼠急性毒性的實驗研究

陳 菲 馮英楠 莊 偉 張 鵬 林曉蘭

(首都醫科大學宣武醫院藥劑科，北京，100053)

中藥醫院制劑活血益氣方對裸鼠抑瘤作用及小鼠急性毒性的實驗研究

陳 菲 馮英楠 莊 偉 張 鵬 林曉蘭

(首都醫科大學宣武醫院藥劑科，北京，100053)

目的：測試首都醫科大學宣武醫院藥劑科制劑活血益氣方抗瘤丸的抑瘤作用及對小鼠的急性毒性。方法：將足夠量的大鼠神經膠質瘤C6細胞注射至裸鼠右側腋窩，建立裸鼠荷瘤模型，按瘤塊體積隨機分組，分別灌胃給予KLW的高、低劑量組，以替莫唑胺為陽性對照，以溶媒為陰性對照，期間測量裸鼠體重、瘤體積并觀察給藥前后動物癥狀；連續給藥15 d后，處死全部小鼠，稱量裸鼠瘤重量；剝離瘤塊，采用Western Blot法檢測腫瘤組織Bcl-2，Bax蛋白。選用ICR(Institute of Cancer Research，ICR)小鼠1 d內2次灌胃給藥KLW，肉眼觀察給藥前、每次給藥后連續4 h及14 d內小鼠的一般情況，中毒反應及死亡情況，結束觀察后解剖，肉眼觀察各組織臟器的變化。結果：裸鼠給藥期間全部存活，體重正常增長，一般行為學觀察未見明顯異常。給藥15 d后，KLW低、高劑量組，瘤體積、瘤重量較模型對照組顯著減小；Bcl-2/Bax的比例較模型對照組顯著增加。急性毒性試驗中所有給藥組小鼠在觀察期內全部存活，一般行為學觀察未見明顯異常。供試品組2個性別的小鼠體重與陰性對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。剖檢各組小鼠，肉眼觀察各組織臟器未見病理改變。結論：KLW低、高劑量組對C6細胞移植瘤的生長具有明顯的抑制作用，該作用與誘導膠質瘤細胞凋亡相關，與陰性對照組比較，差異有統計學意義(P>0.05)。KLW小鼠灌胃40 mL/kg BW，最大給藥濃度(0.50 g/mL)，相當于臨床人用劑量的107倍，未見明顯毒性反應，使用安全性高。

抗瘤丸；神經膠質瘤；裸鼠；凋亡；小鼠；急性毒性

膠質瘤是中樞神經系統最常見的，惡性程度極高的一類腫瘤[1]。放、化療不良反應嚴重，有一定的局限性，且療效均不理想。中藥治療腫瘤具有一定的有效性，且安全性高，因此受到人們越來越多的重視[2]。醫療機構制劑活血益氣方抗瘤丸(簡稱KLW)是針對神經膠質瘤的純中藥復方制劑。臨床使用30余年，經驗證明安全有效，價格低廉。然而作為醫院制劑，缺乏系統的實驗研究數據支持其抑瘤療效及抑瘤機理，嚴重影響了該藥的進一步開發與使用。故本文通過裸鼠抑瘤實驗，研究KLW在裸鼠荷瘤模型中的抑瘤作用，以及與誘導膠質瘤細胞凋亡的關系，并通過小鼠急性毒性試驗考察KLW的安全性，為KLW的進一步應用、研究、開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 ICR小鼠，雌雄各半，18～22 g；裸小鼠BALB/c，雄性，18～22 g(北京維通利華實驗動物技術有限公司購買)。

1.1.2 藥物 供試品醫療機構制劑活血益氣方抗瘤丸，陽性藥替莫唑胺膠囊(泰道)，簡稱TMZ(購于北京宣武醫院)。

1.1.3 試劑與儀器 試劑：試劑胎牛血清(FBS)，DMEM培養基，胰蛋白酶，水合氯醛。儀器：CO2培養箱(NAPCO 6500型)，生物安全柜(CLASS TYPE B2型)，臺式離心機(Eppendorf centrifuge 5430R)，電子數顯卡尺(SF2000型)，倒置顯微鏡(Leica DM3000)，電子d平(PB602-N，TE2101-L)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 按瘤塊大小分組，使每組裸鼠的瘤塊體積和體重平均值相似。制備模型：1)細胞培養：C6細胞培養在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基中，置37 ℃、5%CO2的培養箱中，常規培養。2)裸鼠荷瘤模型建立：將對數生長期的C6細胞懸液注射于裸鼠右側腋下，5×106個細胞/只。小鼠急性毒性試驗分組：將ICR小鼠按體重隨機分組，每組雌雄各半。

1.2.2 給藥方法 1)裸鼠抑瘤實驗：分別灌胃給予不同濃度KLW：低劑量組0.85 g生藥/kg，高劑量組3.4 g生藥/kg，陽性對照組給予替莫唑胺43 mg/kg，模型對照組給予同體積溶媒(蒸餾水)。1次/d，連續給藥15 d。2)小鼠急性毒性試驗：分組后1 d內給藥2次，給藥間隔4 h。給藥前禁食12～16 h，按分組時體重計算給藥量，口服灌胃給藥按40 mL/kg BW計算。實驗組給予抗瘤丸最大給藥濃度(0.50 g/mL)，陰性對照組灌胃給予等體積溶媒(蒸餾水)。

1.2.3 檢測指標與方法 裸鼠抑瘤實驗:1)腫瘤體積及瘤重：測量分別在給藥第0、3、6、9、12、15 d測量裸鼠體重、腫瘤最大直徑L(cm)和最小直徑D(cm)，計算腫瘤體積V(cm3)的大小(腫瘤體積=1/2×L2×D)，觀察裸鼠一般狀態。并于給藥15 d后處死，剝離瘤塊稱重。2)腫瘤組織Bcl-2，Bax蛋白Western Blot檢測：每組隨機取5個瘤塊，剪碎組織，加入蛋白裂解液和PMSF，離心，所得上清液使用BCA法檢測總蛋白濃度，調平。加入上樣緩沖液，取等量蛋白上樣，10%的電泳分離膠和5%的電泳濃縮膠中電泳。200 mA電流下轉膜約2 h，0.1%脫脂奶粉-TBST封閉1 h，加Bcl-2或Bax一抗(1∶200稀釋)，4 ℃過夜孵育后，漂洗6次，5 min/次，加入二抗(辣根酶標記山羊抗兔IgG，1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h后漂洗,在暗室用顯色液顯影，成像。3)一般狀態觀察：分別于給藥前、每次給藥后連續4 h、給藥1次/d后連續觀察14 d。觀察給藥當日對動物外觀體征、行為活動、腺體分泌、呼吸、糞便及死亡等進行觀察[3]。分別于給藥當日給藥前稱體重，給藥后第1、4、7、11、14 d稱體重(以給藥當d為D0d)。飼料加入量每次為150 g/籠，D0d首次給藥后7～29 min內每籠加入約50 g飼料。分別于給藥后第1、7、14 d收集飼料盒內的剩余飼料，用d平稱重。

24 h攝食量=[(飼料給予量-飼料剩余量)/籠內動物體重的總和]×10 g

每日平均攝食量(g/10 gBW)=[(飼料給予量-飼料剩余量)/(d數×籠內動物體重的總和)]×10 g

4)剖檢及觀察：腹腔注射4%水合氯醛將小鼠麻醉，對動物進行外觀檢查，并對小鼠主要臟器，包括心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸、氣管、腎上腺、睪丸及附睪(雄性)、子宮及卵巢(雌性)、胸腺，進行剖檢，肉眼觀察有無明顯的組織器官異常。對肉眼觀察異常器官進行病理學檢查。

表1 給藥后各組裸鼠瘤體積

注：與模型組比較*P<0.05

2 結果

2.1 裸鼠抑瘤實驗

2.1.1 行為學觀察 裸鼠給藥期間全部存活，一般狀態未見明顯異常，且組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.1.2 瘤體積 給藥15 d后，動物試驗結果顯示，KLW低、高劑量組，TMZ組能顯著抑制C6細胞移植瘤的生長，與模型對照組比較具有統計學意義。見表1。

2.1.3 瘤體重量 給藥15 d處死動物后，剝取各組動物瘤塊稱重進行比較，KLW-1低、高劑量組，陽性藥對照組移植瘤的重量明顯<模型對照組，差異具有顯著性意義。見表2。

表2 給藥15 d各組裸鼠瘤重量比較

注：與模型組比較*P<0.05

2.1.4 腫瘤組織Bcl-2，Bax蛋白 Western Blot檢測結果顯示，模型對照組能明顯下調Bax的表達，KLW低、高劑量組和TMZ組，能明顯上調Bax的表達，各組的Bcl-2都低表達，因此模型對照組Bcl-2/Bax的比例降低，各給藥組Bcl-2/Bax的比例升高，各給藥組都具有促進細胞的凋亡。見圖1。

圖1 C6裸鼠移植瘤中Bax，Bcl-2的表達

注：1.模型對照組；2.KLW低劑量組；3.KLW高劑量組；4.陽性對照組

2.2 小鼠急性毒性試驗

2.2.1 小鼠一般狀態 小鼠灌胃給藥2次/d，在每次給藥后4 h內，狀態觀察未見明顯異常反應。給藥后連續觀察14 d，小鼠全部存活一般狀態未見明顯異常。KLW組與陰性對照組小鼠攝食量相近。見表3。

表3 抗瘤丸小鼠口服給藥急性毒性試驗攝食量結果統計表

圖2 抗瘤丸對雄性小鼠體重的影響

圖3 抗瘤丸對雌性小鼠體重的影響

2.2.2 體重測定 KLW組2個性別的小鼠在14 d觀察期內體重均正常增長，與陰性對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。體重統計結果與體重增長見圖2、3。

2.2.3 剖檢結果 對陰性對照組和KLW組小鼠進行剖檢，主要器官均未見異常。由于在剖檢過程中，肉眼觀察未見有病變的組織，器官，故未進行組織病理學檢查。在本實驗中，給予小鼠抗瘤丸0.50 g/mL，40 mL/kg BW時，相當于臨床劑量的107倍，未見毒副反應。

3 討論

膠質瘤是起源于腦部神經膠質細胞，臨床常表現為頭痛、惡心、嘔吐、視力減退、復視、癲癇發作和精神癥狀等。本病屬中醫學“頭痛”“真頭痛”等疾病范疇。中醫認為腫瘤的發生病理機制多由于人體正氣不足,感受毒邪所致。膠質瘤毒邪內侵，痰瘀互阻證，日久化熱，痰瘀熱毒隨風流注，善行數變，因此膠質瘤呈浸潤性生長，手術難以切除干凈，容易復發，因此藥物治療在抗膠質瘤中十分重要。

抗瘤丸清熱解毒,活血化瘀,化痰散結，為治療神經膠質瘤的中藥復方制劑，國家“六五”重點科技攻關項目，獲北京科技進步一等獎。北京軍區總醫院、天津醫學院附屬醫院、北京大學第一附屬醫院等多中心臨床試驗結果顯示，153例腦膠質瘤的平均有效率為64.7%[4]。回顧性研究表明，院內制劑KLW可以延長惡性神經膠質瘤的生存時間，具有肯定療效[5]。然而，作為醫院制劑缺乏有效性及安全性實驗數據，限制其使用與發展。

惡性腫瘤細胞表現的增殖異常、凋亡抑制等特性在腫瘤的形成與轉移中起著重要的作用。大量研究證明，KLW主要抗瘤成分包括三七、白花蛇舌草、半枝蓮、白英、山楂、何首烏等抑瘤機理與誘導細胞凋亡相關[6-14]。前期裸鼠荷瘤預實驗結果顯示，KLW具有良好的抑瘤作用。經細胞學實驗證明KLW的作用與抑制膠質瘤細胞C6、U87、U251的增殖作用有關[15-17]。

荷瘤裸鼠模型是經典模型，在腫瘤的前瞻性研究、抗癌藥藥理研究和抗癌藥早期療效評估中占據十分重要的地位。膠質瘤裸鼠異位移植模型水平的研究，比腫瘤細胞培養水平的研究，更能模擬人體內的腫瘤生長情況及藥物吸收代謝情況，故在該模型中驗證KLW的抑瘤效果能夠很好的模擬臨床治療，結果可靠。研究結果顯示，KLW高、低2個劑量組均能顯著減小膠質瘤體積、降低瘤重量，與模型對照組比較具有統計學差異，證明KLW可在一定程度上抑制膠質瘤的生長，從而起到治療作用。

正常情況下，細胞增殖與凋亡保持動態平衡，而惡性腫瘤細胞表現的增殖異常、凋亡抑制等特性在腫瘤的形成與轉移中起著重要的作用。誘導腫瘤細胞凋亡是腫瘤抑制機理的重要方向[18]，在眾多的凋亡調控基因中，Bcl-2蛋白家族備受關注，其中Bcl-2、Bax發揮重要作用，尤其是Bcl-2/Bax比率是啟動細胞凋亡的“分子開關”[19]。研究結果顯示，KLW能明顯上調Bax的表達，導致Bcl-2/Bax的比例增加，促進細胞的凋亡。研究證明，KLW的抑瘤作用與促進膠質瘤凋亡相關。

本實驗結果顯示KLW具有一定的抑制膠質瘤作用，該作用與促進膠質瘤細胞凋亡相關。為進一步研究抗瘤丸作用機理指明方向。急性毒性試驗結果顯示KLW具有較高的安全性，小鼠在臨床劑量107倍時未能檢測到毒性。同時，與膠質瘤指南推薦藥替莫唑胺比較，醫療機構制劑抗瘤丸作用較為緩慢，單日服藥劑量較大，體現中藥需較大劑量、長期服用，但安全性高的特點，為今后臨床使用提供依據，為該藥的進一步研發奠定基礎。

[1]中國腦膠質瘤協作組.中國腦膠質瘤分子診療指南[J].中華神經外科雜志,2014,30(5):435.

[2]馮英楠,陳菲,莊偉,等.中醫藥治療膠質瘤的研究進展[J].北京中醫藥,2014,33(2):154-157.

[3]吳虓飛,呂晶,金鑫,等.流感病毒H7N9型裂解疫苗動物安全性評價[J].藥物評價研究,2014,6(37):531-533.

[4]宋慕玲,徐慶中,冷守忠,等.中藥復方抗瘤丸粉治療腦膠質瘤療效的初步觀察[J].中西醫結合雜志,1984，4(1):10-12.

[5]莊偉,林曉蘭,姜德春,等.中藥KLW-1治療惡性神經膠質瘤的臨床研究[J].中國新藥雜志,2011，20(19):1894-1897.

[6]詹合琴,張文熙,閆福林,等.三七皂苷Rg1對腦缺血損傷后大鼠腦組織凋亡因子表達的影響[J].廣東醫學,2014,35(10):1478-1481.

[7]鄧海進,肖曉山,馬松梅.三七對胃缺血-再灌注損傷大鼠Bcl-2及Bax的影響[J].廣東醫學,2014,35(13);2007-2010.

[8]周進,趙朋.白花蛇舌草對Renca腎癌細胞模型小鼠凋亡相關蛋白Fas、caspase3及caspase7表達影響[J].中國生化藥物雜志,2016,36(12):37-45.

[9]趙曉芳,李中華,付蕾,等.半枝蓮含藥血清對肝星狀細胞凋亡相關蛋白Bax,Bcl-2的影響[J].臨床醫藥實踐,2013,22(2):112-113.

[10]孟兆珂.非甾體類抗炎藥的抗腫瘤作用及機制研究進展[J].中國醫藥，2012,7(5)：654-656.

[11]董賀,張太平.山楂中谷甾醇抑制腫瘤細胞的研究[J].中國生化藥物雜志,2009,30(4):270-272.

[12]譚永華.基于薯蕷皂苷元的抗腫瘤活性衍生物設計與合成研究[M].貴陽:貴州大學,2016:20-22.

[13]詹奇,胡韶山,鄭永日,等.中藥治療膠質瘤作用機制的研究現狀[J].哈爾濱醫科大學學報,2007,41(5):519-520.

[14]楊瑩.天然中藥抗腫瘤機制的研究進展[J].醫學綜述,2010,16(3):363-365.

[15]林曉蘭,陳菲,連增林.活血益氣方KLW對神經膠質瘤細胞抑制作用的實驗研究[J].北京中醫藥,2011,30(5):396-397.

[16]陳菲,林曉蘭,連增林,等.MTT法測定中藥益氣活血方KLW_1對神經膠質瘤細胞U87-MG細胞增殖的抑制作用[J].北京中醫藥,2012,6(9):466-467.

[17]張鵬,馮英楠,王海征,等.中藥復方抗瘤丸治療神經膠質瘤作用機制的實驗研究[J].北京中醫藥,2017，36(2):135-1387.

[18]《中國中樞神經系統膠質瘤診斷與治療指南》編寫組.中國中樞神經系統膠質瘤診斷與治療指南(2015)[J].中華醫學雜志,2016,96(7):485.

[19]王衛東.Bcl-2/Bax比率與細胞“命運”[J].中國腫瘤生物治療雜志,2007,14(4):393-396.

ExperimentalStudyonEffectsofHuoxueYiqiFangPreparedbyTCMHospitalinTumorInhibitedEffectsofNudeMiceandAcuteToxicityofMice

Chen Fei，Feng Yingnan，Zhuang Wei，Zhang Peng，Lin Xiaolan

(DepartmentofPharmacy，XuanwuHospitalofCapitalMedicalUniversity，Beijing100053，China)

Objective:To investigate the tumor inhibited effect and acute toxicity to mice by Huoxue Yiqi Fang Kangliu Wan (KLW) prepared by hospital.MethodsA plenty of glioma C6 cells were injected into right side of nude mice to establish nude mice model of bearing cancer.According to tumor volume，the nude mice were randomly divided into two groups，and separately to irrigate mice with high or low dose KLW.The temozolomide was as positive group and solvents (pure water) was as negative group.The weight and tumor volume of mice were investigated and symptoms were observed before and after medication.After continuous administration for 15 days，the mice were killed and tumors were weighted，and Western blot was used to detect Bcl-2，Bax.ICR mice were irrigated with KLW twice a day，then the general conditions，toxic reaction and death condition before administration and after administration 4 h and 14 days was reviewed with naked eyes.At last the mice were anatomized and organ changes of mice were observed.ResultsAll nude mice were alive in medication session with weight added，and there was no significant abnormality in general behavioral observation.After administration for 15 days，the tumor volume and weight were significantly declined in both high and low dose group.The scale model of Bcl-2/Bax of control group significantly grew.All administration group mice were alive and there was no significant abnormality in general behavioral observation in the period under observation.There was no significant difference between the two sexes of mice and the negative control group (P<0.05).Anatomical observation on each mice′s organ found no abnormality.ConclusionBoth high and low dose KLW have significant inhibiting effect on the growth of xenograft of C6 cells，and this effect was related to induced glioma apoptosis.It also has statistical significance compared with negative control group.KLW dose is 40 mL/kg BW and maximum dose is 0.50 g/mL，which are 107 times of human clinical dose.There is no significant toxicity effect，so it is safe.

Kangliu Wan; Glioma; Nude Mouse; Apoptosis; Mouse; Acute Toxicity

北京市科委十病十藥研發專項(Z20141100002214016)；首都中醫藥研究專項(17Z13)

陳菲(1984.11—)，女，碩士，主管藥師，研究方向：中藥學中藥新藥研發方向，E-mail：chenfeijill@163.com

林曉蘭(1963.08—)，女，學士，主任藥師，行政副主任，研究方向：中藥學中藥制劑研發與醫院藥學管理方向，E-mail：xllin83@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.10.037

(2016-06-13收稿 責任編輯：張文婷)