沼渣肥對藍莓土壤微生物多樣性的影響

王麗雪　董德武　劉宇

摘要：采用磷脂脂肪酸（PLFA）生物標記法分析研究了沼渣肥對藍莓（Vaccinium spp.）根際土壤微生物多樣性的影響。結果表明，用沼渣肥和草炭處理藍莓土壤PLFA標記含量存在差異，其中用沼肥處理的藍莓土壤的PLFA總量最大；與未做任何處理和用草炭處理的相比，用沼渣肥處理的藍莓土壤中多兩個細菌類群，分別是i15∶0（好氧細菌）和a16∶0（革蘭氏陽性細菌）；通過對不同處理的藍莓土壤養分含量進行分析發現，添加了沼渣肥的藍莓土壤有機質、速效鉀、有效磷、全氮的含量最高；通過相關性分析可知，藍莓土壤中微生物生長需要有效磷、有機質、速效鉀，特別是腐生真菌、AM真菌、18∶1ω7（假單胞桿菌）等對藍莓生長有益的微生物更需要有效磷。

關鍵詞：藍莓（Vaccinium spp.）；根際土壤；沼渣肥；微生物群落；磷脂脂肪酸標記（PLFA）

中圖分類號：S141.4；S666 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）19-3630-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.19.010

Abstract： The microbial diversity was analyzed in the rhizophere of blueberries（Vaccinium spp.） which treated with biogas residue fertilizer by using phospholipid fatty acid biomarkers（PLFA）. The results showed that there were obvious differences in the contents of PLFA in the rhizophere soils treated with biogas residue fertilizer and grass carbon，and the total amount of PLFA in blueberries soil treated with biogas residue fertilizer was the highest. Compared with the soil without any treatment and the soil with grass carbon treatment，the rhizosphere of blueberries soil treated with biogas residue fertilizer has another two bacteria groups：i15∶0（aerobic bacteria） and a16∶0（G+）. According to the nutrient content analysis of blueberries soils by different treatments，the study found that the blueberries soil added by biogas residue fertilizer had the highest contents of organic matter，available potassium， available phosphorus and total nitrogen. The results of correlation analysis indicated that microbial growth in blueberries soil required effective phosphorus， organic matter and available potassium，especially saprophytic fungi，AM fungi，18∶1ω7（pseudomonas） and other beneficial spices required more available potassium.

Key words： blueberries（Vaccinium spp.）； rhizosphere soil； biogas residue fertilizer； microbial community； phospholipid fatty acid marker （PLFA）

應用厭氧發酵生產沼氣的研究已近100年，在中國隨著沼氣建設事業的蓬勃發展，自20世紀80年代以來，沼肥的再利用已成為人們普遍關注的問題[1]。沼肥是將畜禽廢棄物、人畜糞便、有機生活垃圾和作物秸稈等按一定比例混合接種特定微生物經厭氧發酵后產生的沼氣利用后的剩余產物。它包括沼渣和沼液兩部分，統稱為沼氣肥料。其中沼液是厭氧發酵產生沼氣過程中添加的水分，含有多種植物生長需要的養分，如氮、磷、鉀、豐富的氨基酸和活力非常強的纖維素酶、蛋白酶等，占發酵原料總量的 85%～90%，是人們廣為熟知的一種速效性與長效性兼備的生物有機肥料；沼渣是沼氣發酵裝置下層經固液分離脫水干燥后的固態物質，富含有機質、腐殖質、微量營養元素、多種氨基酸、酶類和有益微生物[2]。沼肥的腐熟程度較高，在沼氣池中經過完全的厭氧發酵和復雜的生物化學反應可有效殺滅發酵原料中的蟲卵和致病菌，最大限度地保留營養成分。因此，沼肥不僅能做底肥、葉面肥，而且還可以取代化肥做追肥。在當前資源短缺、能源緊張、工業合成化肥價格攀高的背景下，在沼氣規模發展區推廣施用沼肥具有重要意義。有關沼肥在蔬菜和果樹上的施用技術和應用效果報道較多[3，4]，但在藍莓（Vaccinium spp.）上的應用研究較少。

藍莓具有較高的食用價值和藥用價值，可以預防多種疾病，如藍莓果實中的花青素是非常強的抗氧化劑，可以預防動脈內斑塊的形成和多種癌癥（預防子宮頸癌等），減低患癌的可能[5]，但藍莓根系吸收功能弱、耐旱抗澇能力差。土壤有機質是土壤肥力的主要組成部分之一，沼渣含有的腐殖質等有機質，疏松多孔，能吸持大量水分，提高土壤的保水能力。因此，對于根系功能弱、適應力差的藍莓，提高土壤有機質含量對于穩定根域土壤的水肥環境、保證植株正常生長有著更為重要的意義。大量研究表明，微生態劑和生物有機肥能夠提高土壤肥力和微生物數量及微生物活性[6，7]。因此，沼肥處理對藍莓土壤中微生物影響的研究具有重要的學術價值和應用價值。而關于藍莓土壤中微生物的研究，至今國內外文獻尚未見到使用沼肥處理的方法。endprint

關于植物土壤微生物的群落，國內外學者有過許多研究。利用平板計數、磷脂脂肪酸（PLFA）生物標記法、高通量測序等。但是平板計數方法只能得到微生物總量的1%[8]，微生物的群落信息量很少，不可避免會造成特殊菌種的缺失和改變微生物原有群落結構，不能客觀反映微生物多樣性[9]。核酸技術能夠克服傳統培養方法的缺點，但也存在造成大量信息丟失的缺點，如土壤細菌的難以裂解引起DNA提取差異，PCR過程中也容易丟失許多信息[10]。PLFA技術利用活體細胞的細胞膜中含有大量的磷脂脂肪酸，且不同種類的微生物磷脂組成成分有很大的差異，具有很高的生物學特異性和結構多樣性，適合作為生物標記物。通過觀察總PLFA圖譜可以直觀地了解細菌、真菌和放線菌組成關系[11]，在微生物群落結構研究中較為常用。Schmidt等[12]采用PLFA方法測定土壤施用真菌和細菌殺菌劑對土壤微生物的影響。Lei等[13]用PLFA方法檢測堆肥過程中接種微生物和調節pH對微生物群落結構的影響。Marin等[14]用PLFA方法觀察Swiss Jura山區草原有機質循環對生物多樣性的影響，表明PLFA可以作為生物多樣性的指示性標記。本研究主要采用磷脂脂肪酸生物標記法研究沼渣肥對藍莓根際土壤微生物多樣性的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與處理

試驗地設在安徽省蕪湖市南陵縣，該地年平均氣溫15.8 ℃。冬、春兩季都在3.5 ℃以下。年平均日照時間1 935.4 h。年平均降水量為1 402.6 mm，主要雨水集中在4-6月，冬季較少。

1.1.1 厭氧發酵產沼氣試驗樣品處理 以100 g水稻秸稈和新鮮藍藻100 g為底料，污泥1.5 L，加水調節樣品初始含水率約為65%，混合均勻后35 ℃堆置預處理7 d后，將材料置入5 L厭氧發酵罐中，用尿素調節發酵材料的碳氮比為27∶1，pH 7，迅速封蓋，37 ℃恒溫水浴條件下厭氧發酵100 d。

1.1.2 樣品采集 ①取南陵縣藍莓基地的非栽培區土（園土）若干以及1年生杰兔藍莓苗；②取適量園土自然風干、過100目篩，用于測定土壤理化性質；③取適量的鮮土在4 ℃下保存，用于測定土壤微生物總脂肪酸含量。④取上述以水稻秸稈和藍藻為主要材料的厭氧發酵罐中發酵100 d的沼渣，測定其理化性質及微生物總脂肪酸含量。⑤將從藍莓基地取回的藍莓苗進行栽培，分3種栽培方法，第一種將園土與沼渣以體積比為3∶1的比例混合在一起作為栽培土，第二種將園土與草炭以體積比為2∶1的比例混合在一起作為栽培土，第三種直接以園土作為栽培土，不作任何處理，作為對照組。在栽培3個月后，利用取樣器分別取3種不同處理的藍莓根際10 cm以內的土壤，迅速裝入塑料袋內。采集的土樣分為2份，一份自然風干、過100目篩，用于測定土壤化學性質，另一份用于測定土壤微生物總脂肪酸含量。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 土壤養分含量測定 有效磷含量采用NH4F-HCl法測定；速效鉀采用醋酸銨-火焰光度計法測定；有機質含量采用水合熱法測定；總氮含量采用凱氏定氮法（B18-DNYII全自動凱氏定氮儀）測定[15]。

1.2.2 土壤微生物總脂肪酸的提取及測定 取10 g樣品加入20 mL KOH-甲醇溶液，在37 ℃水浴振蕩2 h（振蕩頻率130次/min），再加入3 mL的1.0 mol/L乙酸。旋轉振蕩后，加入10 mL正己烷同時加入內標50 μL，37 ℃旋轉振蕩搖勻30 min后，4 000 r/min 離心后取上清5 mL，置于離心管中水浴氮吹（溫度31 ℃，壓力在0.01 MPa，15～20 min）吹干。向離心管中加入1 mL體積比1∶1的正己烷-甲基叔丁基醚溶液，充分溶解2 h，轉入GC小瓶，用于脂肪酸分析[12，16]。所有使用的試驗器材都用色譜級的甲醇45 ℃浸泡過夜，再用去離子水清洗烘干。

C19∶0內標配制：稱取0.100 g C19∶0樣品溶于1 000 mL的正己烷中，配成0.1 mg/L的溶液。

0.2 mol/L KOH-甲醇溶液：參照GB 601-2008中0.1 mol/L KOH-乙醇標準溶液的配制。

采用島津GC/MS2010 PLUS測定，分析柱RTX（30.0 m×0.25 mm×0.25 um）。取1 μL待測樣進行分析，GC條件：以氦氣為載體，柱內流量為2 mL/min，總流量為40.2 mL/min。進樣口溫度為250 ℃，分流比為30∶1，柱溫箱程序升溫為40 ℃起始，保持2 min，以15 ℃/min升溫至170 ℃，保持2 min，再以1.5 ℃升溫至200 ℃，保持3 min后，以2 ℃升溫至225 ℃，保留3 min，以1.5 ℃/min升到250 ℃，保留2 min；MS條件：離子原溫度250 ℃，溶劑切割時間為6 min，采用Scan掃描方式。

1.2.3 脂肪酸的命名法 脂肪酸常用的命名格式為 X∶YωZ（c/t），其中，X是總碳數，后面跟一個冒號；Y表示雙鍵數；ω表示甲基末端；Z是距離甲基端的距離；c表示順式，t表示反式。若有支鏈，反異構在X∶YωZ前加a表示，異構則加i。10 Me表示一個甲基團在距分子末端第10個碳原子上；環丙烷脂肪酸用cy表示[17]。不同的磷脂脂肪酸代表特定微生物[18-27]，如表1所示。

1.2.4 統計方法 測定數據的方差分析、數據差異性分析、相關性分析利用SPSS19.0和Excel軟件進行。

2 結果與分析

2.1 不同處理的藍莓土壤的理化性質

由表2可知，不同栽培處理的藍莓土壤理化指標有所不同，呈現出一定的差異，且速效鉀的變化最大。其中添加了沼渣的藍莓土壤有機質、速效鉀、有效磷、全氮的含量最高。土壤理化性質不相同，從而說明不同栽培處理的藍莓吸收土壤中各成分能力不同。沼渣中含有有機質、速效鉀、有效磷、全氮，且含量均比草炭中的含量高。土壤酶是參與許多土壤生物化學過程和物質循環的一類生物活性物質，其活性大小反映了土壤生物活性和土壤肥力[28]。沼肥能顯著改善土壤脲酶、多酚氧化酶、蔗糖酶、無機焦磷酸酶和磷酸脂酶的酶活力，提高土壤肥力[29]。本研究中施用沼肥顯著提高了藍莓土壤有機質、速效鉀、有效磷、全氮的含量，可能是由于施用沼肥改善了土壤脲酶、多酚氧化酶、蔗糖酶、無機焦磷酸酶和磷酸脂酶的酶活力，從而提高了藍莓土壤微生物活性和土壤肥力。endprint

2.2 不同栽培處理的藍莓土壤微生物群落PLFA標記分析

由表3可以看出，不同栽培處理的藍莓土壤中共檢測到20種PLFA，其中，細菌PLFA有14種，分別為13∶0、14∶0、15∶0、a15∶0、i15∶0、16∶1ω9、16∶0、a16∶0、17∶0、i17∶0、18∶1ω7、18∶0、a18∶0；真菌PLFA有3種，分別為16∶1ω5、18∶2ω6，9、18∶1ω9；放線菌PLFA有3種，分別為10Me16∶0、10Me18∶0、10Me19：0。不同栽培處理的藍莓土壤中微生物物種豐富度有所不同，但種類變化不是特別大，與加草炭和未做任何處理的對照藍莓土壤相比，加了沼渣的藍莓土壤中多了i15∶0（好氧菌）和a16∶0（革蘭氏陽性細菌）。徐鴻斌等[30]、祁建軍等[31]、劉波等[32]在分析紅花、地黃和水稻等植物根際土壤微生物多樣性時，也檢測出了a15∶0、i15∶0、16∶0、18∶2ω6，9、i17∶0，說明這幾種類群在植物根際土壤中普遍存在。

土壤微生物可促進土壤和植物健康，土壤微生物群落結構組成的變化可在一定程度上反映土壤質量的高低。本研究中施用沼渣肥的藍莓土壤中大部分細菌、真菌及微生物總量都有所提高，但是有極個別的菌群含量降低，可能的原因是施入沼渣肥影響了土壤微生物菌群多樣性。

由圖1所示，除了微生物種類有微弱變化，微生物總量也不同，表現為樣品A>B>C>D，樣品A與C相比，A的微生物總量以及細菌和真菌總量均比C多，說明加了沼肥的藍莓土壤微生物豐富度比未做處理的高，即沼肥能改變藍莓土壤中的微生物群落結構。樣品A與B相比，A的微生物總量以及細菌和真菌總量也均比B多，說明加沼渣肥的藍莓土壤微生物豐富度比加草炭的高。與細菌、真菌相比，放線菌在各個樣本中含量相對較少，說明藍莓土壤微生物群落主要由細菌、真菌構成。藍莓根際土壤中PLFA含量細菌>真菌>放線菌，劉波等[32]在分析水稻根際土壤微生物多樣性時測定的水稻根際土壤中PLFA含量也是細菌>真菌>放線菌，說明多數植物根際土壤中，細菌含量最多，真菌次之，放線菌最少。與非栽培區土壤相比，不同栽培處理的藍莓土壤中微生物的類型和總量都要高，說明土壤中微生物對藍莓生長具有重要影響。

從圖2可以看出，在3種不同栽培處理的藍莓土壤中，含量最高的前3個 PLFA生物標記相同，但是含量各不相同，各個成分變化比較明顯。在對不同栽培處理的藍莓土壤微生物分析時發現，除了類群的差別，各類群微生物在各個樣本中含量不同，占的比例也有所不同。總體上，樣品A的各類群微生物含量比B和C要高，只有極少數個別類群含量比B和C少，說明施用沼肥的藍莓土壤中微生物相對豐富度高于其他兩種。另外A相對B和C來說，藍莓土壤中多了 i15∶0和a16∶0兩個類群，這兩個類群都是細菌，在非栽培區土壤中以及B和C中沒有發現，可能是由于施用沼肥對土壤微生物數量有影響，能增加土壤細菌、酵母菌、真菌和放線菌的數量，使微生物的多樣性指數相對較高。

樣品中微生物菌群具有相似性，主要優勢群體在不同栽培處理的藍莓土壤中普遍存在，比較幾種不同栽培處理的藍莓土壤中的微生物類群，有些類群含量發生一些變化，但是優勢類群沒有明顯差異，說明在不同栽培處理的藍莓土壤中，構成土壤微生物群落的優勢菌群具有一定穩定性。在各個樣品中16∶0相對豐富度最高，其次是18∶2ω6，9和18∶1ω9，說明這3個類型是構成藍莓土壤微生物的主要類群。劉波等[32]在分析水稻根際土壤微生物多樣性時也測得16∶0是含量最高的PLFA，說明16∶0可能是多數植物根際土壤中普遍存在的微生物類群。

2.3 不同栽培處理的藍莓土壤中的微生物PLFA含量與養分因子間的相關性分析

土壤養分相關因子與不同栽培處理的藍莓土壤中的微生物總量、細菌、放線菌和真菌的PLFA的相關系數存在差異，如表4所示。細菌總PLFA與有機質呈顯著正相關，與全氮、有效磷、速效鉀呈正相關；真菌總PLFA與速效鉀呈負相關，與有效磷呈顯著正相關，而與全氮相關性較弱；放線菌總PLFA與有機質、全氮呈顯著負相關。在分析土壤不同微生物各類群總 PLFA與土壤養分相關因子相互關系時發現，微生物總量與土壤有機質、全氮、有效磷、速效鉀都呈正相關，表明土壤有機質、速效鉀、有效磷等含量不同會影響土壤微生物各個類群含量。

3 討論

土壤微生物是土壤中活的有機體，是最活躍的土壤肥力因子之一。細菌、放線菌、真菌和原生動物作為土壤微生物的4大類群，構成了土壤微生物的主要生物量，其組成和數量變化常能反映出土壤生物活性水平。大量研究表明，微生態劑和生物有機肥能夠提高土壤肥力和微生物數量及微生物活性[7-9]。研究表明，微生態制劑的優點是其包含有機磷細菌、蠟樣芽胞桿菌、光合菌等多種環境微生物，其中有些菌種來自與藍莓近緣的同屬越橘科植物根系，使用菌劑能顯著改善藍莓的根際環境，提高植株生長活性[33]。假單胞菌（18∶1ω7）能夠改善植物營養，促進植物生長，同時假單胞菌還能夠對土壤中的有毒物質進行降解[34]，可作為一種理想的植物微生態制劑生產菌種進行開發。假單胞菌對植物生長相當重要，通過對其與土壤理化指標的相關性分析，發現其含量與全氮、有效磷、有機質呈正相關，可以通過施加這些相關成分來提高假單胞菌含量，改善藍莓根際生長環境。

AM真菌不僅能改善植物的營養狀況，還可以促進植物生長，提高植物的抗病性[35]，與植物共生可以提高植物的抗逆性，促進宿主植物的生長[36]；腐生真菌可以分解有機質，具有改善土壤作用，為其他生物提供硫、磷、鉀、鈣、鐵等礦物質營養元素[37，38]，降解某些有毒物質，保護環境[39]，由此可知，AM真菌和腐生真菌對植物根際有著不可或缺的作用。在分析AM真菌、腐生真菌與土壤理化指標相關性時發現，其與有效磷具有較高的相關性，從而可以通過增加土壤有效磷來改變AM真菌和腐生真菌量，改善藍莓根系生長環境，提高藍莓產量。endprint

通過各微生物類群和土壤理化指標分析及其與土壤理化指標相關性分析可知， 藍莓土壤中微生物生長需要有效磷、有機質、速效鉀，特別是腐生真菌、AM、18∶1ω7等對生長有益的微生物更需要有效磷。結合對不同栽培處理的藍莓土壤的理化性質分析可知，沼渣含有相對比較多的有機質、有效磷、速效鉀及全氮，因此可以在藍莓栽培和種植過程中施加沼肥來改善土壤有益微生物生存環境，從而改善藍莓生長環境，提高藍莓產量和質量。

通過對不同栽培處理的藍莓土壤理化指標分析可知，添加了沼肥的藍莓土壤有機質、速效鉀、有效磷、全氮的含量最高。并且沼渣中含有的有機質、速效鉀、有效磷、全氮含量均比草炭中的含量高。說明施用沼肥能顯著改善土壤脲酶、多酚氧化酶、蔗糖酶、無機焦磷酸酶和磷酸脂酶的酶活力，提高土壤肥力。在對不同栽培處理的藍莓土壤微生物群落PLFA標記分析時發現，與樣品B、C、D相比，添加了沼渣的藍莓土壤樣品中多了i15∶0和a16∶0兩個類群；除了微生物種類有變化外，微生物總量也不同，表現為樣品A>B>C>D，說明加了沼肥的藍莓土壤微生物豐富度比未做處理的高，即沼肥能改變藍莓土壤中的微生物群落結構。說明施用沼肥對土壤微生物數量有影響，能增加土壤細菌、酵母菌、真菌和放線菌的數量，使微生物的多樣性指數相對較高。

以上研究表明，沼渣含有相對比較多的有機質、有效磷、速效鉀及全氮，因此可以在藍莓栽培和種植過程中施加沼肥，用來改善土壤有益微生物生存環境，從而改善藍莓生長環境，提高藍莓產量和質量。現代農業正在促使化肥品種結構發生變革，產生質的飛躍，各種新型肥料不斷被開發。以沼渣、沼液為主的綠色生物有機肥在中國處于萌芽階段，還沒能形成商品、進入市場，不能被廣泛地使用。隨著社會的進步，選擇有機和綠色食品已成必然，沼肥作為提高作物質量的重要原料，其利用價值將不斷提高，它是實現農業工業化、農村城鎮化、農業產業化的重要措施，更為重要的是滿足了中國農業持續發展和“兩高一優”的需要。

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