銅綠微囊藻水華聚集對黑麥草生理生態的影響

邱穎　張瓊　張雪　李石晶　孫靖

摘要：指出了藍藻水華聚集引起水體環境惡化，人們可利用生物浮床來凈化此類水體，黑麥草是供選擇的浮床生物之一。在實驗室中模擬生態浮床，探索了5種不同初始濃度的銅綠微囊藻接種后，生長于浮床上的黑麥草的生長情況及其生理響應，并比較了水體凈化效果。結果表明：接種處理組的黑麥草的根長、鮮重與空白相比，都呈現增加趨勢，但當藍藻初始接種量達0.278 g/L時，生長情況較其他接種組變差；黑麥草葉片可溶性蛋白、MDA含量在大部分接種組都增加。此外，不接種藍藻時，黑麥草能十分有效吸收水中的磷；初始接種量低于0.248 g/L時，隨著接種量的增加，水體的TP 降低了78%～92%，CODCr卻不斷升高；超過0.248 g/L的接種處理組中，實驗期間TP 減少率超過90%，但CODCr達到最大值。因此，在利用黑麥草凈化富營養水體時，為更好地發揮其水體凈化功能，應將種植時間提前，避免藍藻水華的嚴重聚集。

關鍵詞：水華聚集；銅綠微囊藻；黑麥草；丙二醛（MDA）；總磷（TP）

中圖分類號：X524

文獻標識碼：A文章編號：16749944（2017）20002904

1引言

由于工農業的快速發展，城鎮人口的增加，生活污水和工業廢水未經處理而大量排放，水體中過量累積氮磷等營養鹽而導致水體富營養化[1]。湖泊等水體富營養化最顯著的外在特征之一就是浮游藻類的大量繁殖和藍綠藻水華的頻發。當前，世界范圍內有30%～40% 的湖泊和水庫，正遭受不同程度的富營養化影響；在我國，湖泊、水庫富營養化及藍藻爆發現象也愈加明顯[2]。一項調查發現：我國處于富營養狀態的水庫個數、庫容個數分別占所調查水庫的30.8% 和11.2%[3]。

由于藍藻爆發對水體及水中各類生物都會產生危害，人們一直在不斷的探索對富營養水體的治理辦法，植物修復是重要的治理方法之一。國外用于廢水凈化的植物較多，如常見的蘆葦、香蒲和燈芯草等，鳳眼蓮、黑三棱、水蔥等植物也有所使用[4]。我國凈水植物品種的運用，大多參照國外的方式[5]。近年來，國內學者通過對沉水草本、漂浮草本、浮水草本、挺水草本、濕生草本、中生草本植物的大量研究，為廢水凈化選取了高性能的植物品種[6]。因此，利用生物浮床凈化富營養水體這一研究領域有著較好的發展前景。在浮床生物的選擇中，黑麥草因其產地廣泛，培養簡單方便，漸漸受到人們的重視并展開了一些污染水體修復方面的探索[7]。然而，針對富營養水體，黑麥草是否也具有凈化效果？水華大量聚集后，將對黑麥草生長產生何種影響？藍綠藻細胞死亡分解后對水體水質、營養鹽釋放以及黑麥草生長將產生何種影響？目前相關的報道尚不多見。

本實驗將在室溫下，以接種了不同濃度銅綠微囊藻的培養基作為培養介質，選用黑麥草作為浮床生物，探索藍藻對黑麥草生理生化的影響，并分析培養介質中總磷（TP）和COD等凈水指標的變化。本研究將為減輕藍藻水華聚集，減少藍藻對凈水的浮床植物的不良影響，提高水體凈化效果提供理論依據。

2實驗方法

2.1銅綠微囊藻的培養與黑麥草的種植

本實驗所用銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）購自中國科學研究院水生生態所淡水藻種庫（湖北，武漢，FACHB-905），所用培養基為現配并滅菌的BG11藍藻培養基（pH值為8.0）。藻種需經過幾次轉接來適應新環境，具體做法為：訂購的藻種搖勻后，在無菌操作下直接轉入小三角瓶內，用四層滅菌紗布把瓶口封好，防止污染并保持氣體流通，然后放置在培養箱中培養2～3 d（培養箱光暗周期為14 h∶10 h，溫度26±1 ℃，光照強度為2000 lx）；接著，在無菌操作下取5～10 mL藻樣轉入10～20 mL新鮮培養基中擴大培養；當銅綠微囊藻生物量明顯增多時，再次轉接，轉接比例1∶5（藻液∶培養基），每天搖瓶3次。實驗時選用的Microcystis aeruginosa為重新接種后生長3～4 d的新鮮藻樣。

北方生黑麥草（Lolium perenne），購自巨豐種業（江蘇，南京）。將黑麥草種子浸泡后，選出籽實飽滿的種子，均勻撒入備好的含育苗土壤的培養盒中，待黑麥草種子發芽后，取莖長3 cm左右的幼苗，均勻移入含有不同銅綠微囊藻濃度的浮床上，水培培養。

本實驗設定5個處理組（其中包括一個不接種藍藻的空白對照組），每組設3個平行。所用培養介質均為新鮮的BG11培養液，初始磷濃度為40 mg/L（以K2HPO4計）。接種組一次性接入如上所述的新鮮藻樣，接種量分別為每L培養基質添加0 mL、10 mL、30 mL、50 mL和70 mL的藻樣。利用血細胞計數法測定，五個處理組所含M. aeruginosa的初始生物量分別為0 g/L、0.121 g/L、0.164 g/L、0.248 g/L和0.278 g/L。

2.2黑麥草生長情況的觀察

本次實驗周期為浮床接種后的三周。每隔一周，取生長在不同處理組中的黑麥草，對其根長、鮮重這樣的外觀形態指標進行觀察和記錄。所用工具為剪刀，直尺，所用儀器為分析天平（FA1004N）。

2.3黑麥草葉片蛋白含量與丙二醛含量的測定

本次試驗中，黑麥草葉片所含蛋白質含量的測定用小牛血清蛋白法（BCA）。樣本的前處理步驟如下：收集不同生長時間（一周，兩周，三周）的不同處理組的黑麥草各 10 株，研磨稱重，然后按照各自不同的重量（g）∶體積（mL）=1∶9 的比例，在離心管中加入 9 倍體積的生理鹽水，-20 ℃冰箱凍融3～4次破細胞壁后，按照 3500 轉/min，在高速冷凍離心機中離心10 min，取上清液。再用生理鹽水按1∶9 稀釋成 1% 組織勻漿備用。后續測定和計算方法按照市售的試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國南京）說明書進行。

丙二醛（MDA）含量的測定也包括樣本前處理和測試兩個階段，前處理的流程如下：收集不同處理組及不同生長階段的黑麥草，稱重，研磨，然后按照各自不同的重量（g）∶體積（mL）=1∶9 的比例，加入9倍體積的應用提取液（試劑盒自帶），放在冰箱內凍融3～4次，以4000 r/min在離心機中離心10 min，取上清液待測。具體測定和計算方法也參照了南京建成的丙二醛測定試劑盒說明書（南京建成生物工程研究所，中國南京）。所有測定都在96孔板中進行，所用儀器為多功能酶標儀（Tecan Infinite 200 Pro，瑞士）。endprint

2.4培養基質中總磷和生化需氧量的測定

在測定黑麥草生理生化數據的同時，收集培養了一周、兩周和三周的水培基質，測定其中 TP 和重鉻酸鉀生化需氧量（CODCr）。總磷的測定采用過硫酸鉀消解-鉬銻抗比色法，CODCr 的測定采用國標方法[8]。

3結果與分析

3.1藍藻水華聚集對黑麥草生長情況的影響

為了探索不同接種量的藍藻對黑麥草生長的影響，我們收集了不同生長階段的黑麥草植株，對其根長和鮮重進行了測量，結果如表1和表2所示。從表1中可以看出，實驗周期內黑麥草在不同處理組均不停生長。與空白對照相比，培養基質中有水華藍藻的處理組中，黑麥草的根長被刺激，在初始接種量為10～50 mL范圍內，這種刺激作用隨藍藻濃度的增加而變得越發明顯，但當接種量達到70 mL時，盡管仍表現為刺激，但與其他接種濃度相比，根長明顯變短。黑麥草鮮重的變化趨勢與根長類似，需要特別指出的是，在70 mL藻液接種組，這種鮮重的刺激現象已經非常微弱，甚至在第三周時與空白對照組幾乎相當（表2）。

*平均值 ± 標準誤差，單位：cm

從表2中數據可以得知，在水體中存在微囊藻水華時，黑麥草的生長在外觀上表現為刺激現象；但當水華聚集嚴重時，刺激現象有可能減弱或消失。利用水葫蘆凈化富營養水體的相關報道也發現：各處理中水葫蘆的根長、總長、鮮重與實驗開始相比都呈增加的趨勢，并且隨藍藻濃度的增加，根長、總長增加的幅度減小[9]，這與該研究結果類似。因此，今后在利用黑麥草凈化富營養水體時，為了讓黑麥草長勢更好，應考慮在春末或夏初進行移植。

*平均值 ± 標準誤差，單位：g/10株

3.2藍藻水華聚集對黑麥草葉片中蛋白含量和丙二醛含量的影響

為了從更深層面了解水華藍藻對黑麥草生長的影響，對黑麥草葉片的蛋白含量和丙二醛（MDA）含量進行了進一步的分析。在本次實驗周期內，與空白相比，黑麥草葉片的蛋白含量在大多數接種了微囊藻的處理組都有所升高，只有50 mL接種量處理組在第三周時，蛋白含量比空白組下降。在70 mL處理組，葉片蛋白含量與空白很接近，在第三周時也低于空白組（圖1）。這個結果這與前面所述的生長情況的結果是非常相似的。

此外，有趣的是，空白組和10 mL處理組，在這三周內葉片的蛋白含量都是一直增加的，而在其他處理組，葉片蛋白含量的變化趨勢是先增加后減少（圖1）。這說明：盡管在外觀上，黑麥草在含有水華藍藻的培養基質中仍然持續生長，但其葉片蛋白的合成已經受到了藍藻的影響而放慢了。在水華藍藻濃度較高的處理組甚至低于了空白的合成水平。

另外，對黑麥草葉片中MDA含量的分析更是證明了上述論斷。如圖2所示，與空白組相比，在所有的接種了微囊藻的處理組，葉片中MDA的含量都大大提升了，且隨著藍藻初始接種量的增加，MDA含量也不斷增加。在植物的抗氧化防御系統中，MDA含量反映的是植物遇到外界不利影響（如干旱、寒冷、紫外線、水澇、外源污染物等）時的脂質過氧化水平，它的含量越高，說明受到的氧化損傷也越強[10～12]。本次實驗結果表明，微囊藻的存在確實使得黑麥草受到一定程度的氧化損傷，且這種損傷存在濃度相關性。

3.3不同處理組培養液中的總磷濃度和重鉻酸鉀需氧量

最后，對各處理組培養基質中的總磷（TP）濃度和重鉻酸鉀需氧量（CODCr）進行了測定。結果發現：雖然培養基質中初始磷濃度較高，達到40 mg/L，但生物對磷的利用能力很強。在空白對照組，由于培養液中沒有藍藻，水中磷濃度的降低主要由于黑麥草吸收磷的作用，計算發現它對磷的吸收率超過99%。而在接種藍藻的處理組，首先，水體中TP濃度隨時間的變化規律比較統一，都是逐漸減少（圖3）。這說明無論是藍藻還是黑麥草，隨著生物量的增加，對水中磷的吸收都不斷增加。其次，若對所有接種組進行比較則發現：培養基質中TP的變化與接種量之間沒有一定的規律可尋，但與黑麥草生長情況有一定的關聯。如初始接種量在30mL和50 mL時，黑麥草生長較好，水中TP濃度也較高；而在70 mL時，黑麥草生長最差，水中TP濃度也最少。通過計算還發現，10～50 mL接種量時，基質中TP的減少率在78.3%～92.3% 之間；但初始接種量為70 mL時，基質中TP的減少率在90.6%～97.6% 之間（圖3）。一方面，藍藻的新陳代謝過程中，一直存在著新生細胞吸取磷元素，死亡細胞釋放磷元素的過程。另一方面，黑麥草與藍藻之間的相互作用，也會影響黑麥草根部對磷的吸收和釋放。因此，其深層原因較為復雜，值得進一步深入研究。

對于培養基質中CODCr的變化規律，從圖4中可以看出：初始接種量越多的組，水體的生化需氧量也越大。空白組和10～50mL接種組隨著時間的變化，CODCr不斷減少或者先增加后降低，而70 mL接種組在第三周時CODCr達到最大值。眾所周知，富營養化水體的一個較大的危害就是水中溶解氧的下降，而造成這種現象的原因正是藻類的大量繁殖，本次實驗結果也證明了藻類有大量消耗溶解氧的潛能。

然而，藍藻的世代周期較短。在第二周時，藍藻死亡分解耗氧量也最大，因藻類的聚集CODCr達到最高值。第三周時分解基本完成，CODCr回落。另外，黑麥草的存在，也加速了藻細胞的分解。需要特別指出的是：70 mL接種處理組在第三周時水中CODCr達到最高峰，可能因為藻類聚集太多，使得分解過程變長。此外，如前所述，第三周時黑麥草在該處理組的長勢也較差，可能是由于此時水華聚集過于嚴重，導致了黑麥草根部缺氧，從而生物量遠不如其他處理組。

4結論和展望

本次實驗可以得到如下結論：①在3周的實驗周期內，當藍藻初始接種量為10～50 mL時，黑麥草的生長受到刺激，葉片蛋白含量在大多數情況下也高于空白組。而在70 mL接種處理組，黑麥草的生長和葉片蛋白含量都被輕微的抑制；②在所有的接種了微囊藻的處理組，葉片中MDA的含量都大大提升了，且隨著初始接種量的增加，MDA含量也不斷增加，說明黑麥草受到藍藻誘發的氧化損傷；③黑麥草能夠大量吸收培養基質中的磷，但在水華藍藻存在時，由于存在競爭和死亡藻體的釋放，培養液中TP濃度有所增加，且與接種濃度沒有相關性；④初始接種量越多的組，水體的CODCr也越大。若水華聚集過于嚴重，如初始接種量達到70 mL時，有可能導致黑麥草根部缺氧，嚴重影響黑麥草的正常生長。endprint

在利用黑麥草凈化富營養化水體時，為了黑麥草正常生長并發揮凈水功能，應當在水華爆發前就接種進行培養，嚴重的水華聚集會抑制其功能的發揮。此外，黑麥草與藍藻共存時對水中營養鹽如TP的利用情況比較復雜，值得深入去探索。在此基礎上，對浮床植物的進一步篩選和實驗研究也需要投入更多的精力。

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