用高基元微衛星標記分析中國糜子遺傳多樣性

王瑞云，劉笑瑜，王海崗，陸平，劉敏軒，陳凌，喬治軍

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用高基元微衛星標記分析中國糜子遺傳多樣性

王瑞云1,2，劉笑瑜1，王海崗2，陸平3，劉敏軒3，陳凌2，喬治軍2

（1山西農業大學農學院，山西太谷030801；2山西省農業科學院農作物品種資源研究所/農業部黃土高原作物基因資源與種質創制重點實驗室/雜糧種質資源發掘與遺傳改良山西省重點實驗室，太原030031；3中國農業科學院作物科學研究所，北京100081）

開發高基元（4—6）堿基重復微衛星標記，分析種質資源遺傳多樣性，為糜子遺傳和進化研究提供理論基礎。用隸屬函數、主成分分析和聚類分析綜合評價糜子資源表型多樣性，用前期糜子轉錄組測序獲得高基元SSR引物對地理來源差異大的糜子材料進行PCR擴增檢測其多態性，用PowerMarker 3.25計算遺傳多樣性參數，用PopGen 1.32計算Nei’s遺傳距離，用MEGA 5.0進行聚類分析，用Structure 2.2鑒定遺傳類群。96份糜子資源株高和穗長變異最豐富，多樣性指數分別為2.08和1.91。PCR擴增發現，占56.29%的85對引物具多態性，其中四、五和六堿基重復引物分別為71對（83.53%）、10對（11.76%）和4對（4.7%）。85個標記擴增產物大小分布為100—450 bp，PIC值平均為0.51，Rp值為1.00—5.75，平均為3.15。四、五和六堿基重復SSR的平均Rp值分別為3.15、2.8和4.0。基于Rp值分析SSR的分布頻次，發現85個標記分布區間為0—1、1—2、2—3、3—4、4—5和5—6，分別包含1（1.18%）、15（17.65%）、31（36.47%）、20（23.53%）、12（14.12%）和6（7.06%）個標記，60%（51個）的標記分布在區間2—3和3—4。用85個SSR擴增96份糜子資源，共檢測到232個等位變異，每個位點檢測到等位變異2—3個，平均2.7294個；62個位點產生3個變異，23個位點產生2個變異；多樣性指數為0.2842—1.0633，平均為0.7708；PIC值為0.0400—0.7281，平均為0.4723。不同生態區糜子種質間的遺傳距離為0.0093—0.5052（平均為0.1798），遺傳一致度為0.6034—0.9907（平均為0.8485）。基于UPGMA將96個糜子基因型聚為4個群組，第一群組主要屬于北方春糜子區；第二群主要屬于東北春糜子區；第三群組主要屬于華北夏糜子區；第四群組主要屬于黃土高原春夏糜子區。遺傳結構分析將96份試材劃分為4個類群，分別代表黃土高原、華北、東北和北方基因庫。UPGMA聚類分析和遺傳結構分析結果基本一致，均與地理起源相關。在糜子中構建了85個四、五和六堿基重復微衛星標記，這些高基元SSR的引物分辨率（Rp）高，對不同基因型分辨能力強，PCR擴增多態性好；用其評估中國糜子資源的遺傳差異發現，黃土高原春夏糜子區和北方春糜子區資源遺傳多樣性最豐富。

糜子；高基元SSR；遺傳多樣性；聚類分析；遺傳結構

0 引言

【研究意義】糜子（L.）又叫黍稷，為旱地農業重要經濟作物。糜子在亞洲中部和東部、印度、非洲、中東、東歐（俄羅斯和烏克蘭）和北美均有分布[1]。糜子脫殼后稱黃米，糯質黃米可用于蒸糕、炸油糕、包粽子和釀酒，粳質黃米多用于制作涼粉、煎餅、黃米酸飯和炒米[2]。糜子在歐美主要用于飼鳥和禽畜育肥。糜子作為C4植物，蒸騰速率低，在干旱、高溫等惡劣條件下快速成熟，是干旱、半干旱地區的穩產作物。中國是糜子起源地，資源豐富，明確不同種質的遺傳背景，準確評估糜子遺傳多樣性，有利于糜子作物的合理開發和高效利用。【前人研究進展】分子標記是評估作物遺傳差異和鑒定群體間親緣關系遠近的有效手段。由于糜子是異源四倍體，基因組復雜，序列信息缺乏，分子標記的開發相對欠缺。1994—2006年相繼開發的適用于糜子多樣性分析的分子標記（RAPD、AFLP、RFLP、ISSR等）非常有限[3-6]，尤其是變異豐富、多態性高、重復性好、檢測能力強[7]的SSR標記更少。2008—2014年，HU等[8]和RAJPUT等[9]分別開發了46個和254個來自小麥、水稻、燕麥和柳枝稷的糜子非特異性微衛星標記，然而種間差異的存在影響遺傳多樣性評估準確性。2010年，CHO等[10]首次開發了糜子特異性微衛星標記25個，隨后利用上述標記評估糜子遺傳資源差異的研究漸次進行。2011年，HUNT等[11]利用其中16對引物分析了歐亞大陸的98份糜子資源，檢測到78個等位基因，每個位點檢測到等位變異為2—15個（平均4.9個），基因多樣性指數和多態性信息含量（polymorphism information content，PIC）分別為0.391和0.360；2015年，連帥等[12]利用5對SSR引物分析來源于5個糜子生態區的40份資源的多樣性，檢測到15個等位變異，平均為3個，遺傳多樣性指數和PIC值分別為0.76和0.48；董俊麗等[13]利用其中19對引物檢測96份糜子種質，發現112個等位變異，基因多樣性指數和PIC值分別為0.4097和0.392。2016年，劉笑瑜等[14]選用其中6對SSR引物分析中國不同省份的40份糜子資源，發現20個等位變異，遺傳多樣性指數和PIC值分別為0.5426和0.3403；2017年，王瑞云等[15]用15對引物，評估不同生態區132份糜子的遺傳多樣性，共檢測到107個等位變異，每個位點鑒定到的2—14個（平均7個），基因多樣性指數和PIC值分別為0.5298和0.4864。近年來，隨著高通量測序技術的廣泛運用，全基因組SSR標記批量挖掘取得長足進展。2016年，RAJPUT等[16]用100個SSR（80個來自柳枝稷、7個來自水稻、6個為糜子、5個來自小麥、2個來自燕麥）評估了歐亞和北美等25個國家的90份糜子資源，檢測到1 287個等位變異（長度為40—1 500 bp），每個位點檢測到等位變異1—29個（平均4.9個），每份材料檢測到等位變異41—317。同年，LIU等[17]和連帥等[18]用糜子高通量測序開發的130條SSR引物分析了280份國內外的糜子栽培品種和野生資源。【本研究切入點】糜子基因組序列未知，可供遺傳分析的SSR標記數量有限，且以往研究所用標記多為低基元（二、三核苷酸）序列重復。【擬解決的關鍵問題】基于RNA-Seq手段篩選到一批高基元（四、五、六核苷酸）序列重復SSR，并用以評估糜子遺傳多樣性，以期為糜子連鎖圖譜構建及進化研究提供更多分子檢測工具，批量篩選高基元微衛星標記，明確引物分辨率特征。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料包括96份種質資源，來源于國家資源庫的地方品種（有國家種質資源庫統一編號）76份、筆者實驗室征集的地方品種（標注為農家種，無國家種質資源庫統一編號）18份和育成品種2份（附表1），分布于6個糜子生態栽培區（表1）。

表1 糜子資源生態區分布

1.2 表型性狀測量

96份糜子資源分別于2015年5月12日和2016年5月14日種植在山西農業大學農作站，分5行點播，每行10株，株距5 cm，行距8 cm，小區間距50 cm。參照王星玉等[19]的方法，成熟期測量表型性狀（株高、穗長、分蘗數、主莖節數、千粒重、葉長、葉寬）。

1.3 基因組DNA提取

取15—20 d糜子幼苗（1株）葉片約0.3 g，用改良CTAB法[20]提取基因組DNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，用紫外微量核酸儀（NanoDropND-1000，Eppendorf）測定DNA純度和濃度。

1.4 SSR分析

用地理來源差異顯著的8份糜子材料對前期抗旱和抗鹽相關轉錄組測序獲得的151個高基元SSR引物進行初步篩選（附表2和附表3）。85個標記可以擴增出清晰度高且重復性好的多態性片段（附表4，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成），用于評估96份糜子資源遺傳多樣性。

PCR反應體系（20 μL）包括10×buffer（Mg2+含量25 mmol·L-1）2 μL、10 mmol·L-1dNTP 1.8 μL，5 U·L-1Taq聚合酶0.4 μL、1 mmol·L-1前后引物各0.6 μL、ddH2O 13.6 μL和30 ng·μL-1DNA模板1 μL。PCR擴增在LifeEco基因擴增儀（TC-96/G/H(b)c，杭州博日科技有限公司）上進行，程序為94℃5 min；94℃45 s，不同Tm退火50 s，72℃1 min，38個循環；72℃10 min。用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產物，硝酸銀染色顯影。等位變異長度用50 bp DNA Marker（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）比對條帶。

1.5 數據分析

用SAS軟件對各性狀進行主成分和相關性分析。利用模糊隸屬函數法計算各性狀的隸屬函數值以進行綜合評價及Shannon-wiener遺傳多樣性指數評價，方法參考董俊麗等[13]。

凝膠條帶表示標記（>50 bp）大小，相鄰條帶大小相差25 bp。SSR標記如果在至少2份材料擴增出不同的DNA條帶，則具有多態性。DNA條帶代表等位變異，相同條帶表示相同等位變異。引物分辨率（resolving power，Rp）計算按照Prevost等[21]方法，Rp = ∑，其中，1-(2×︱0.5 -︱)，為某個等位基因信息量，為某個等位基因在6份材料中出現的頻率。用PowerMarker 3.25[22]計算每對引物的多樣性參數，包括等位基因數（Na）、等位基因頻率、基因多樣性指數（H）、多態性信息含量指數（PIC）等。用PopGen1.32[23]進行群體間聚類分析。用MEGA 5.0[24]構建Neighbour-Joining聚類圖。用Structure 2.2[25]分析群體遺傳結構。

2 結果

2.1 糜子表型遺傳多樣性分析

對96份糜子資源的7個表型性狀進行了表型多樣性分析（表2），7項指標變異系數為18.21%—42.19%，分蘗數最大，主莖節數和株高次之，葉長最小，說明糜子不同種質分蘗數相差較大。糜子7項指標遺傳多樣性指數為1.78—2.08，株高最大，說明株高變異豐富。

表2 糜子表型性狀多樣性分析

2.2 糜子表型性狀綜合分析

對96份糜子資源的表型性狀進行相關性分析（表3）。21對相關性中，13對（61.9%）呈正相關，8對呈負相關，7對（33.3%）極顯著相關，1對（千粒重和分蘗數）顯著相關。其中，株高與主莖節數相關系數最大（0.601），其次為葉長與葉寬（0.561），說明株高越高，主莖節數越多，葉長越長，葉寬也越大。分蘗數和主莖節數極顯著負相關（-0.216），說明主莖節數越少，分蘗數越多。

對96份糜子資源進行主成分分析（表4）。結果表明，前5個主成分累積貢獻率為91.51%，包含表型特征多數信息，可用以綜合分析糜子資源。其中，第一主成分貢獻率33.29%，株高載荷值最大，第一主成分值大的資源，株高較高。第二主成分和第五主成分均為分蘗數載荷值最大，累積貢獻率29.36%，說明第二和第五主成分值大的資源分蘗數多；同時第五主成分穗長和千粒重均為負值，且絕對值較大，育種中選擇第五主成分小的種質，分蘗數少，穗長和千粒重大。第三主成分千粒重、株高和穗長載荷值均較大，為產量相關性狀，在育種中可選擇第三主成分值大的種質。第四主成分千粒重、葉長和葉寬貢獻率均較大，株高、穗長為負值，絕對值較大，說明第四主成分值高的種質，千粒重大、葉片長而寬，但植株低、穗短，可用于矮桿、高產育種的選育。

分析糜子資源表型性狀隸屬值分布（圖1）。株高主要集中在4—9級，占材料的84.38%；穗長主要集中在5—8級，占材料的77.08%；分蘗數主要集中在2—4級，占材料的84.38%；主莖節數主要集中在3—8級，占材料的82.29%；千粒重主要集中在5、6、8和10級，占材料的68.75%，葉長主要集中在6—10級，占材料的80.12%，葉寬主要集中在4—8級，占材料的76.04%。綜合評價各試驗材料隸屬函數平均值，發現甘肅省的榆中黃糜（00002787）的值最高（0.738），綜合評價最好；山西孝義黃糜子值最低（0.231），綜合評價最低。

表3 糜子表型性狀間的相關性分析

*和** 分別表示在0.05和0.01水平差異顯著

* and ** indicate significant difference at the probability level of 0.05 and 0.01, respectively

表4 表型性狀5個主成分的特征向量、主成分特征值、貢獻率及累積貢獻率

2.3 高基元SSR引物篩選

山西農業大學農學院糜子分子育種課題組前期基于RNA-Seq篩選到151對高基元SSR引物，用這些引物擴增6份糜子材料。發現25對擴增不出DNA條帶，126對（83.4%）有擴增條帶。126對引物中，41對擴增的條帶呈單態性，85對（附表4）呈多態性，占151對引物的56.3%。其中四、五和六堿基重復引物分別為71對（83.5%）、10對（11.8%）和4對（4.7%）。

圖1 糜子資源表型性狀隸屬值分布

引物分辨率（Rp值）是衡量引物對不同基因型辨別能力的指標。85對高基元SSR的引物特征（等位基因大小和Rp值）見附表5和圖2。從附表5可以看出，85個SSR的等位基因為100—450 bp；85個SSR的Rp值為1.00—5.75（平均3.15），標記RYW42的Rp值最小，標記RYW47的Rp值最大；四、五和六堿基重復SSR的平均Rp值分別為3.15、2.8和4.0，六堿基重復SSR數量最少（4個），但Rp值較高，可能與其重復單元差異較大有關。基于Rp值分析85個SSR的分布頻次（圖2），發現頻次分布區間為0—1、1—2、2—3、3—4、4—5和5—6，分別包含1（1.18%）、15（17.65%）、31（36.47%）、20（23.53%）、12（14.12%）和6（7.06%）個標記，60%（51個）的標記分布在區間2—3和3—4。

圖2 85個糜子多態性SSR標記的Rp值

2.4 基于高基元SSR分析糜子資源遺傳多樣性

用85對SSR引物擴增96份試材，分析糜子資源遺傳多樣性（附表6）。從附表6可以看出，85個標記在96份試材中共檢出232個等位變異，每個位點檢測到等位變異2—3個，平均為2.7294個；62個位點產生3個變異，23個SSR位點產生和2個變異。85個位點多樣性指數為0.2842（RYW75）—1.0633（RYW37），平均為0.7708。85個位點PIC值為0.1133（RYW46）—0.7281（RYW8），平均為0.4723。

分析不同生態區糜子資源的遺傳多樣性（表5），結果發現，北方春糜子區PIC值、多樣性指數及觀測等位基因數等遺傳多樣性衡量指標最高，黃土高原春夏糜子區次之，南方秋冬糜子區均最低，說明北方春糜子區和黃土高原春夏糜子區遺傳多樣性比較豐富。

2.5 不同生態區糜子種質間遺傳相似性分析

利用PopGen 1.32計算不同生態區糜子種質間的遺傳相似性（表6）。結果表明，遺傳距離為0.0093—0.5052（平均0.1798）。遺傳一致度為0.6034—0.9907（平均0.8485）。南方秋冬糜子區與西北春夏糜子區遺傳距離最大，遺傳一致度最低，這與2個生態區地理分布較遠、氣候環境差別大、親緣關系較遠有關；北方春糜子區和黃土高原春夏糜子區遺傳距離最小，遺傳一致度最高，這與2個生態區相鄰、氣候差異小、親緣關系較近有關。說明遺傳距離越大，親緣關系越遠，遺傳相似性越低。

表5 不同生態區糜子的遺傳多樣性分析

表6 不同生態區糜子資源的遺傳距離與遺傳一致度

Nei氏遺傳一致度（對角線以上）和遺傳距離（對角線以下）Nei’s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal)

2.6 基于UPGMA的糜子資源聚類分析

基于UPGMA對不同生態區糜子進行聚類（圖3），發現6個生態區資源在遺傳距離0.1827處劃分為4個類群（類群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ）。類群Ⅰ將南方秋冬糜子區歸為一類，試材來自海南。類群Ⅱ將西北春夏糜子區歸為一類，試材來自新疆。類群Ⅲ將北方春糜子區和黃土高原春夏糜子區歸為一類，試材來自青海、甘肅、內蒙古、山西、陜西和寧夏。類群Ⅳ將東北春糜子區和華北夏糜子區歸為一類，試材來自黑龍江、吉林、遼寧、河北、山東、江蘇和河南。

基于UPGMA對96個糜子基因型進行聚類（圖4），發現96份試材歸為4個群組，第一群組30份，包括山西2份、陜西3份、寧夏4份、內蒙古3份、青海7份，甘肅9份、新疆2份，大部分基因型屬于北方春糜子區和黃土高原春夏糜子區；第二群組20份，其中內蒙古3份、山西6份、黑龍江5份、吉林3份及陜西、遼寧和江蘇各1份，主要屬于東北春糜子區；第三群組11份，包括河北9份、山東2份，屬于華北夏糜子區；第四群組35份，包括青海6份、甘肅1份、內蒙古4份、山西12份、陜西4份、寧夏6份、海南和河南各1份，主要屬于黃土高原春夏糜子區和北方春糜子區。各群組分布與地理來源基本相符。

圖3 基于遺傳距離的不同生態區糜子資源聚類圖

圖4 基于遺傳距離的96份糜子種質資源聚類圖

2.7 基于模型的群體結構分析

對96份試材進行基于模型的群體結構分析（圖5）。從圖5可以看出，等位變異頻率特征數（遺傳群體數）在=2、=4和=9處峰值明顯，基于=4和=9峰值基本相同，且越大且值越小模擬結果越可靠，僅對=2和=4進行分析，分別將試材劃分為2和4個群組（圖6）。由圖6可知，=2時，劃分為2個類群，類群Ⅰ為紅色（60份），主要來自于北方春糜子區和黃土高原春夏糜子區；類群Ⅱ為綠色（36份），主要來自于北方春糜子區和黃土高原春夏糜子區；=4時，劃分為4個類群，類群Ⅰ為紅色（19份），代表黃土高原基因庫，多樣性指數和PIC值均最高；類群Ⅱ為綠色（22份），代表東北和華北基因庫；類群Ⅲ為藍色（20份），代表黃土高原基因庫和北方基因庫；類群Ⅳ為黃色（35份），代表黃土高原基因庫和北方基因庫。

Delta K根據Evanno等[26]的方法計算得到，針對基因庫數目（K）建模

橫坐標的數字代表糜子材料序號 Numbers in the horizontal axis represent serial number of accession

=2紅色類群分化為紅、綠、藍和黃色（=4），14份山西糜子中1份（7.14%）為紅色，藍色和黃色分別為10份（71.43%）和3份（21.43%）。10份青海糜子中1份（10%）屬于藍色，9份（90%）屬于黃色。

=2綠色類群半數以上材料沒分化，其余分化為紅色和藍色（=4），6份山西材料為紅色，8份河北材料中，綠色和紅色分別為7份（87.5%）和1份（12.5%）。

分析=2和=4遺傳結構圖各分類群的遺傳多樣性參數（表7），結果發現，=2時，紅色類群和綠色類群分別占62.5%和37.5%；就多樣性指數和PIC值而言，綠色類群（分別為0.7726和0.4845）高于紅色類群（分別為0.7499和0.4379）。綠色類群資源主要來自于河北、寧夏和山西，地區間相距較遠，氣候條件差異大，資源間遺傳多樣性豐富；紅色類群糜子主要來自于山西、甘肅和內蒙古，這些地區彼此接壤，氣候相似，資源間親緣關系近，遺傳一致性程度高。=4時，黃色類群資源最多（53.03%）；紅色類群的PIC值和多樣性指數均為最大（分別為0.4868和0.7627）。

3 討論

3.1 高基元糜子特異性SSR是分析糜子遺傳多樣性的有效標記

基于SSR引物初步篩選，983個種間SSR中，209個（38%）擴增不出條帶[9]；本研究用PCR擴增151個標記，發現25個（16.56%）無結果，這些SSR可能受到基序插入、缺失、點突變、側翼重復缺失等因素影響，引起DNA電泳條帶不出現[27]。

用983個水稻等種間SSR擴增118份糜子資源，46個標記（4.7%）擴增出多態性片段[8]。用548個柳枝稷SSR擴增8份糜子材料，254個標記（46.4%）擴增片段具多態性[9]。本研究用151個SSR擴增6份糜子材料，85個標記（56.3%）擴增出多態性片段，明顯高于上述研究結果，這可能與引物來自糜子基因組有關，糜子特異性標記篩選效果優于種間標記。

表7 遺傳結構圖中各分類群的多樣性統計

轉錄組測序是開發SSR標記的有效手段，用糜子高通量測序獲得的500對SSR引物擴增8份糜子材料，162個標記（32.4%）擴增出多態性片段[17]，低于本研究結果，可能與本研究引物為高基元有關。本研究首次利用RNA-Seq開發了一批高基元糜子微衛星引物，為糜子育種提供了有效分子檢測工具。

Rp值（引物分辨率）反映SSR多態性，直接關聯標記信息[21]，Rp值越高，遺傳多樣性越豐富。以往研究發現254和100個糜子非特異性SSR（6個為糜子細菌人工染色體克隆除外）的Rp值分別為2.71和5.43[9,16]，與本研究結果（3.15）基本一致；同時發現，糜子分子標記的Rp值和苧麻[28]的研究結果（3.22）類似，低于密花石斛（6.15）、檉麻（6.59）和穿心蓮（10.8）[29-31]。Rp值與糜子種特異性/非特異性引物的相關性大小有待于進一步研究。本研究首次構建的一批高基元SSR，不僅豐富了糜子作物DNA標記，而且也為糜子連鎖圖譜構建和基因組功能研究提供了理論依據。

高基元SSR多態性低于低基元多態性，小麥中已有報道[32]，糜子中也檢測到類似結果。用低基元微衛星標記分析糜子遺傳多樣性，192、132和118份資源的PIC值分別為0.4855[18]、0.5298[15]和0.793[8]，本研究高基元SSR檢測結果為0.4723，明顯低于上述結果。

迄今，糜子中可用的高級基元SSR極少，僅包括1個糜子種特異性SSR[10,13]和3個種間SSR[9]。其中，糜子特異性標記EF117731由CHO等[10]開發，為四堿基重復“（AGTC）4”。CHO等[10]用該標記檢測50份糜子材料，發現期望雜合度為0.04，PIC值為0.04；董俊麗等[13]用該標記檢測評估96份糜子的遺傳差異，發現基因多樣性指數為0.2112，PIC值為0.2035；與上述研究類似，本研究也篩選到一個四堿基重復引物“（AGTT）6”，遺傳多樣性分析發現期望雜合度（0.4575）、基因多樣性指數（0.6500）和PIC值（0.3226）均高于上述研究結果，這可能與本研究所選試材地理來源差異大、資源豐富有關。

3.2 中國糜子資源的遺傳多樣性和群體結構

用RAPD標記分析5個黍屬植物遺傳多樣性，發現糜子多態性高，且劃分類群與地理來源一致[3]。用RFLP標記比較12份栽培和野生糜子資源，發現UPGMA聚類結果與地理來源無關[5]。上述相互沖突的結果可能與材料來源及檢測標記不同有關。本研究用85個高基元SSR擴增96份試材，發現多樣性指數（0.7708）和PIC值（0.4723）均高于RAPD和低基元SSR的標記鑒定結果（最高分別為0.725和0.3920）[3,10-15,17-18]，這可能與本研究試材來源廣泛（6個生態區）、多樣性豐富有關，也可能與高基元引物有關。

基于遺傳結構歐亞大陸糜子資源劃分群組與地理來源相符[11]，基于遺傳距離美國糜子資源劃分群組與地理來源、系譜發生及農藝特征相符[16]，基于遺傳結構和遺傳距離中國糜子資源聚類群組與地理來源相關[13,15]。本研究基于UPGMA將6個生態區及96個基因型均劃分為4個主要類群，分別屬于北方、黃土高原、東北和華北糜子區；遺傳結構分析將96個基因型劃歸4個主要的基因庫：北方、黃土高原、東北和華北基因庫。遺傳距離和遺傳結構聚類結果基本一致，均與地理起源相關，表明不同生態區內遺傳變異廣泛，糜子不同群體間遺傳關系復雜[17]。本研究西北基因庫和南方基因庫資源選材偏少、青藏高原基因庫資源缺乏，未來研究需豐富材料來源，有利于準確評價中國糜子資源的遺傳多樣性。

4 結論

在糜子中開發了85個四、五和六堿基重復微衛星標記，分析這些SSR的引物分辨率（Rp），發現信息量大、多態性高。運用該高基元分子檢測系統評估中國糜子資源的遺傳差異，發現聚類群組與地理起源相關，其中北方春糜子區和黃土高原春夏糜子區遺傳多樣性最豐富。

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（責任編輯 李莉，岳梅）

附表1 96份糜子試材明細表

Table S1 The detail of 96 accessions of common millet material in this experiment

編號Serial number統一編號Unicode名稱Name原產地Origin來源Accession donor備注Remark 100006653金黍Jinshu海南省瓊海市Qionghai, HainanICS, CAAS地方品種Landrace 200007435黑硬糜Heiyingmi青海省樂都縣Ledu, QinghaiICS, CAAS地方品種Landrace 300007445褐紅糜Hehongmi青海省樂都縣Ledu, QinghaiICS, CAAS地方品種Landrace 400007463白皮糜Baipimi青海省平安縣Ping’an, QinghaiICS, CAAS地方品種Landrace 500007469灰麻糜Huimami青海省循化縣Xunhua, QinghaiICS, CAAS地方品種Landrace 600007478白圪塔糜Baigedami青海省湟中縣Huangzhong, QinghaiICS, CAAS地方品種Landrace 700007491二白糜Erbaimi青海省湟中縣Huangzhong, QinghaiICS, CAAS地方品種Landrace 800007503褐紅糜Hehongmi青海省西寧市Xining, QinghaiICS, CAAS地方品種Landrace 900007468灰糜子Huimizi青海省循化縣Xunhua, QinghaiICS, CAAS地方品種Landrace 1000007473灰糜子Huimizi青海省循化縣Xunhua, QinghaiICS, CAAS地方品種Landrace 1100007450白鴿子蛋Baigezidan青海省民和縣Minhe, QinghaiICS, CAAS地方品種Landrace 1200007504白老糜Bailaomi青海省西寧市Xining, QinghaiICS, CAAS地方品種Landrace 1300007471青掃帚糜Qingsaozhoumi青海省循化縣Xunhua, QinghaiICS, CAAS地方品種Landrace 1400007443黃硬糜Huangyingmi青海省樂都縣Ledu, QinghaiICS, CAAS地方品種Landrace 1500002783榆中小黃糜Yuzhongxiaohuangmi甘肅省榆中縣Yuzhong, GansuICS, CAAS地方品種Landrace 1600000711靖遠中堡青糜Jingyuanzhongpuqingmi甘肅省靖遠縣Jingyuan, GansuICS, CAAS地方品種Landrace 17紅糜子Hongmizi甘肅省靖遠縣Jingyuan, Gansu永新鄉臥中村Wozhong, Yongxin農家種Accession from farmer 1800002787榆中黃糜Yuzhonghuangmi甘肅省榆中縣Yuzhong, GansuICS, CAAS地方品種Landrace 1900007320金積小黃糜Jinjixiaohuangmi甘肅省GansuICS, CAAS地方品種Landrace 2000007333黃糜子Huangmizi甘肅省GansuICS, CAAS地方品種Landrace 2100002776皋蘭雞蛋青Gaolanjidanqing甘肅省皋蘭縣Gaolan, GansuICS, CAAS地方品種Landrace 2200002780白銀五硯黃糜Baiyinwuguanhuangmi甘肅省蘭州市Lanzhou, GansuICS, CAAS地方品種Landrace 2300000718華池紅軟糜子Huachihongruanmizi甘肅省華池縣Huachi, GansuICS, CAAS地方品種Landrace 2400002695永昌糜子Yongchangmizi甘肅省永昌縣Yongchang, GansuICS, CAAS地方品種Landrace 2500000750白糜子Baimizi新疆沙灣縣Shawan, XinjiangICS, CAAS地方品種Landrace 2600007345疏勒附糜Shulefumi新疆沙灣縣Shawan, XinjiangICS, CAAS地方品種Landrace 2700000635達旗黃桿大白黍Daqihuanggandabaimi內蒙古伊盟達旗Yimengdaqi, Inner MongoliaICS, CAAS地方品種Landrace 2800002487伊盟大黃糜Yimengdahuangmi內蒙古伊盟達旗Yimengdaqi, Inner MongoliaICS, CAAS地方品種Landrace 2900002250臨河黃糜子Linhehuangmizi內蒙古巴盟臨河Linhe, Bameng, Inner MongoliaICS, CAAS地方品種Landrace 30伊糜5號Yimi 5內蒙古伊盟達旗Yimengdaqi, Inner MongoliaICSAR, SAAS育成品種Bred variety 3100004268小紅黍Xiaohongshu內蒙古Inner MongoliaICS, CAAS地方品種Landrace 3200007224東勝野糜Dongshengyemi內蒙古伊盟東勝Dongsheng, Yimeng, Inner MongoliaICS, CAAS地方品種Landrace 3300007225異交野糜內蒙古伊盟東勝Dongsheng, Yimeng, Inner MongoliaICS, CAAS地方品種Landrace 3400007238大紅糜子Yijiaoyemi內蒙古巴盟Bameng, Inner MongoliaICS, CAAS地方品種Landrace 3500007275糜子Mizi內蒙古Inner MongoliaICS, CAAS地方品種Landrace 36黃糜子Huangmizi內蒙古固陽縣Guyang, Inner Mongolia固陽縣Guyang農家種Accession from farmer 續附表1 Continued table S1 編號Serial number統一編號Unicode名稱Name原產地Origin來源Accession donor備注Remark 3700000956大青黍Daqingshu山西靈丘縣Lingqiu, ShanxiICS, CAAS地方品種Landrace 38紅黍子Hongshuzi山西省陽泉市平定縣Pingding, Yangquan, Shanxi冠山鎮南坳村Nan’ao, Guanshan農家種Accession from farmer 39黍子Shuzi山西省陽泉市平定縣Pingding, Yangquan, Shanxi冠山鎮西溝村Xigou, Guanshan農家種Accession from farmer 40黍子Shuzi山西省陽泉市平定縣Pingding, Yangquan, Shanxi張莊鎮寧艾村Ning’ai, Zhangzhuang農家種Accession from farmer 41白糜子Baimizi山西省臨汾市鄉寧縣Xiangning, Linfen, Shanxi昌寧鎮韓村Han, Changning農家種Accession from farmer 42白糜子Baimizi山西省長治市長子縣Zhangzi, Changzhi, Shanxi色頭鎮色頭村Setou, Setou農家種Accession from farmer 4300000992大白黍Dabaishu山西省大同市左云縣Zuoyun, Datong, ShanxiICS, CAAS地方品種Landrace 44白糜子Baimizi山西省陽泉市平定縣Pingding, Yangquan, Shanxi冠山鎮衛垴村Weinao, Guanshan農家種Accession from farmer 4500000985紫羅帶Ziluodai山西省大同市Datong, ShanxiICS, CAAS地方品種Landrace 46青黍子Qingshuzi山西省呂梁市汾陽市Fenyang, Lüliang, Shanxi楊家莊鎮南偏城村Nanpiancheng, Yangjiazhuang農家種Accession from farmer 47黃糜子Huangmizi山西省孝義市Xiaoyi, Shanxi下堡鎮Xiapu農家種Accession from farmer 48黃糜子Huangmizi山西省呂梁市Lüliang, Shanxi柱濮鎮Zhupu農家種Accession from farmer 49白糜子Baimizi山西省太原市陽曲縣Yangqu, Taiyuan, Shanxi泥屯鎮東青善村Dongqingshan, Nitun農家種Accession from farmer 50紅糜子Hongmizi山西省陽泉市盂縣Yuxian, Yangquan, Shanxi北下莊鄉Beixiazhuang農家種Accession from farmer 51黃黍子Huangshuzi山西省忻州市偏關縣Pianguan, Xinzhou, Shanxi窯頭鄉寺埝堡村Sinianpu, Yaotou農家種Accession from farmer 5200001514黃硬黍Huangyingshu山西省臨汾市翼城縣Yicheng, Linfen, ShanxiICS, CAAS地方品種Landrace 53雁黍7號Yanshu 7山西省大同市Datong, ShanxiICSAR, SAAS育成品種Bred variety 54大紅黍Dahongshu山西省忻州市定襄縣Dingxiang, Xinzhou, Shanxi師家崗村Shijiagang地方品種Landrace 55黍子Shuzi山西省晉中市榆社縣Yushe, Jinzhong, Shanxi榆社縣Yushe農家種Accession from farmer 56紅糜子Hongmizi山西省陽泉市平定縣Pingding, Yangquan, Shanxi冠山鎮甘井村Ganjing, Guanshan農家種Accession from farmer 5700005272黃糜子Huangmizi陜西省定邊縣Dingbian, ShaanxiICS, CAAS地方品種Landrace 5800005423紫穗糜Zisuimi陜西省延安市Yan’an, ShaanxiICS, CAAS地方品種Landrace 59紅糜子Hongmizi陜西省榆林市Yulin, Shaanxi榆林市Yulin農家種Accession from farmer 6000001635二瓦灰Erwahui陜西省榆林市Yulin, ShaanxiICS, CAAS地方品種Landrace 6100004821糯糜子（黍）Nuomizi (Shu)陜西省ShaanxiICS, CAAS地方品種Landrace 6200004824糯糜（黍）Nuomi (Shu)陜西省ShaanxiICS, CAAS地方品種Landrace 6300003806長糜Changmi陜西省志丹縣Zhidan, ShaanxiICS, CAAS地方品種Landrace 64紅黍子Hongshuzi陜西省渭南市合陽縣Heyang, Weinan, Shaanxi路井鎮高原寨村Gaoyuanzhai, Lujing農家種Accession from farmer 續附表1 Continued table S1 編號Serial number統一編號Unicode名稱Name原產地Origin來源Accession donor備注Remark 6500002620古城紅糜子Guchenghongmizi寧夏固原市Guyuan, NingxiaICS, CAAS地方品種Landrace 6600002518平羅紫稈Pingluozigan寧夏平羅縣Pingluo, NingxiaICS, CAAS地方品種Landrace 6700006781鼓鼓頭-2 Gugutou-2寧夏固原市Guyuan, NingxiaICS, CAAS地方品種Landrace 680000678360天小黑糜60-dayXiaoheimi寧夏固原市Guyuan, NingxiaICS, CAAS地方品種Landrace 6900006790涇源小青Jingyuanxiaoqing寧夏固原市涇源縣Jingyuan, Guyuan, NingxiaICS, CAAS地方品種Landrace 7000007287中衛大黃Zhongweidahuang寧夏NingxiaICS, CAAS地方品種Landrace 7100007306五太保灰糜Wutaibaohuimi寧夏NingxiaICS, CAAS地方品種Landrace 7200007308九十天糜90-day mi寧夏NingxiaICS, CAAS地方品種Landrace 7300007309黃糜Huangmi寧夏NingxiaICS, CAAS地方品種Landrace 7400007297賀蘭大紅Helandahong寧夏NingxiaICS, CAAS地方品種Landrace 7500000081黃糜子Huangmizi黑龍江省富錦市Fujin, HeilongjiangICS, CAAS地方品種Landrace 7600000100白糜子Baimizi黑龍江省樺川縣Huachuan, Heilongjiang ICS, CAAS地方品種Landrace 7700000012白糜子Baimizi黑龍江省德都縣Dedu, HeilongjiangICS, CAAS地方品種Landrace 7800000143黑糜子Heimizi黑龍江省密山市Mishan, HeilongjiangICS, CAAS地方品種Landrace 7900000177紅糜子Hongmizi黑龍江省寧安市Ning’an, HeilongjiangICS, CAAS地方品種Landrace 8000000411白糜子Baimizi吉林省吉安市Ji’an, JilinICS, CAAS地方品種Landrace 8100002044紅糜子Hongmizi吉林省延吉市Yanji, JilinICS, CAAS地方品種Landrace 8200002045糜子Mizi吉林省延吉市Yanji, JilinICS, CAAS地方品種Landrace 8300000413昌圖紅糜子Changtuhongmizi遼寧省昌圖縣Changtu, LiaoningICS, CAAS地方品種Landrace 84白糜子Baimizi河北省辛集市Xinji, Hebei舊城鎮耿莊村Gengzhuang, Jiucheng農家種Accession from farmer 85黑黍子Heishuzi河北省石家莊市贊皇縣Zanhuang, Shijiazhuang, Hebei嶂石巖鄉三六溝村Sanliugou, Zhangshiyan農家種Accession from farmer 8600000763黍子Shuzi河北省寬城縣Kuancheng, HebeiICS, CAAS地方品種Landrace 8700007076紅糜子Hongmizi河北省寬城縣Kuancheng, HebeiICS, CAAS地方品種Landrace 8800007096黍子（糜）Shuzi (mi)河北省寬城縣Kuancheng, HebeiICS, CAAS地方品種Landrace 8900007100小黃糜子Xiaohuangmizi河北省赤城縣Chixheng, HebeiICS, CAAS地方品種Landrace 9000007118糜子Mizi河北省阜平縣Fuping, HebeiICS, CAAS地方品種Landrace 9100007198陳莊白黍Chenzhuangbaishu河北省完縣Wanxian, HebeiICS, CAAS地方品種Landrace 9200007214褐粒黍Helishu河北省南宮市Nabgong, HebeiICS, CAAS地方品種Landrace 9300007343白糜Baimi山東ShandongICS, CAAS地方品種Landrace 9400004409黑黍子Heishuzi山東ShandongICS, CAAS地方品種Landrace 9500004202貍黍子Lishuzi江蘇淮陰Huaiyin, JiangsuICS, CAAS地方品種Landrace 96紅黍子Hongshuzi河南省安陽市Anyang, HenanICS, CAAS地方品種Landrace

ICS、CAAS：中國農業科學院作物科學研究所；ICSAR、SAAS：山西省農業科學院高寒區作物研究所

ICS, CAAS: Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences; ICSAR, SAAS: Institute of Crop Science in Alpine Region, Shanxi Academy of Agricultural Sciences

附表2 篩選抗鹽相關引物的糜子材料

Table S2 SSR primers based on salt resistance RNA-Seq for primary screen

編號Serial number統一編號Unicode名稱Name來源Origin 100000956大青黍Daqingshu山西省靈丘縣Lingqiu, Shandong 200000100白糜子Baimizi黑龍江省樺川縣Huashuan, Heilongjiang 300002518平羅紫稈Pingluozigan青海省平羅縣Pingluo, Qinghai 400004189散尾兒Sanweier江蘇省Jiangsu 500006653金黍Jinshu海南省瓊海縣Qionghai, Hainan 600007345疏勒附糜Shulefumi新疆沙灣縣Shawan, Xinjing

附表3 篩選抗旱相關引物的糜子材料

Table S3 SSR primers based on drought resistance RNA-Seq for primary screen

編號Serial number統一編號Unicode名稱Name來源Origin 100000104鵝頭Etou黑龍江省樺川縣Huachuan, Heilongjiang 200006653金黍Jinshu海南省瓊海市Qionghai, Hainan 300007287中衛大黃Zhongweidahuang寧夏Ningxia 400007343白糜Baimi山東省Shandong 500007435黑硬糜Heiyingmi青海省樂都縣Ledu, Qinghai 600007358大黃糜Dahuangmi山西省Shanxi

附表4 85個SSR引物特性

Table S4 Characteristics of 85 SSR primers

標記Marker正向引物F-Sequence反向引物R-Sequence重復基序Repeated motif 序列Sequence (5′-3′)退火溫度Tm (℃)序列Sequence (5′-3′)退火溫度Tm (℃) RYW1TAACGCTTCACCTTCAGACC55.25′ TGAGATGGAGTTGGCTGATG56.2(TCATCT)6 RYW2TTAGGGCTCTCCTGCATCC57.45′ CAGCGAGTTCACCGTCAAG57(CGAAGC)5 RYW3GGAGGCGTGACAATAAAAC52.85′ GGCGTGAGGTGTTGTTTTT55.7(CTGCAA)5 RYW4AATCCACAACGCACACGAC56.95′ ATTTGCTCCTCTCGTCGGT56.9(GTGCCG)5 RYW5GACGATGCTCTTGACCTTGT54.75′ CACCGTGAAATGTCTCTGCT55.6(CCTTT)5 RYW6AGCCGATTTGCTGTGGAGT57.85′ CTGCCTCCGATGAGTTGGT56.4(ACACC)5 RYW7TCCACTCATCCATTGCTCGT58.45′ GATGGATTCAAAGGGACGCT58.9(CGCGC)5 RYW8GGGTCAGAGAATACACAGCG55.3GTAGGGAAGGAGAAGTGGGT56(AATAG)5 RYW9GGACCCTTCCCTCACAGATT57.6TCCAGTTGCTCTTGCCGTT58.9(CTAG)6 RYW10TGGATTGGGTGGTGGTAT53AAGGACGGCAGCACAAAT56(CGAG)5 RYW11TGCTCGTCTTCTCGCTTCG59.7AGTAGTCCTCCACCGCCATCT60.1(GGTA)5 RYW12ACCATCCCAGCACAAACCA58.9TGCCTGAAGGAGAAGAGCG58.6(AGCT)5 RYW13CTCCTGCTCTGCTTCGTTT55.3CTTCCAGCAGACCTTCACTC54.4(CGGC)5 RYW14CGCACAACGACCACAAGAG57.8ATACACCAGAGGAGCACGC55.5(GGCC)5 RYW15ACCGTGAAAAGAAATGCTG53.4GTCCTGGATGTCGTCAACT51.9(ACAA)5 RYW16ATCTCCTCCGCCTTCTAACCC61.4TGGCAATGGTCGTACAAACT56.3(GAGC)5 RYW17TCAGCTACTTCGAACGGC54.2GGATCATGCGATACATTTGG56.1(TTTC)5 RYW18CTCCCTCTTTGTCCTCGTT53.8GCTGCCTCTTCGCTATCTT54.8(AGTT)6 RYW19GAATGATAGGTCCGCAAGG55.3CAGCCTTTGTTCAGTTGTCTC54.9(TTAT)5 續附表4 Continued table S4 標記Marker正向引物F-Sequence反向引物R-Sequence重復基序Repeated motif 序列Sequence (5′-3′)退火溫度Tm (℃)序列Sequence (5′-3′)退火溫度Tm (℃) RYW20ACCTCTTGCCGCACACTAC55.6TTCTACATCCCCGAACCAC55.2(TTGG)6 RYW21CCCTCCTACTGCTCCCTTT55.8ATTACTCGTTCTCGCCTCG55.3(CGGA)6 RYW22AAGCCAACACATTTGAGGT52.4CGTGATAACTGAATACGAGCC55.3(GGAA)5(GCA)5 RYW23AGGAACAGCAGAGAGAGGG53.7CAGAACACCACGAAACACC53.6(GGAA)5 RYW24TTTCTTCGGCTCGTGTGAC56.5CGTCGCTCTTGTTCACTCC56(TGGA)5 RYW25AATCGCTCCACCGCTAATC57.7GACATCCCGAAACCCTAACC58.3(ATAC)5 RYW26TAAGGGTGGCGTTGGATAG56AACCCAACAGGTCCTCCAT56.1(AGGA)6 RYW27GCTGCTGGTTTCATTTTCC55.5CCAAGATTGATTCGGTTCG56.1(GGAA)5 RYW28CCAAGGCTGAGCAGAAAGAT57ACAAGGTGAAACCCGAAGC57.3(AGGC)5 RYW29CTTGATTTCTCACGCACCG57.1TGTCCAGCAGTAGTCGTTCCT57.2(GCAG)5 RYW30TAGCCTTCTTTGCCACCACT57.5GCCCGTGATGATATTCGAC55.7(TTTC)5 RYW31ACCCAGAGTCCAGAGAAGC53.4GATGTCCTCCTCCTTCTCC52.6(AGCG)5 RYW32CAGGTTATGGGAGGACGAG55GGTGCTACGGTTACAGGGT54.7(ATCTT)5 RYW33CGATTCTACACCGACGAGG56.1TGTAGGGTTCCATTCATCTCC56.4(CCATC)5 RYW34TCCCCCGATTAGGAAAGAT56.1CTGGTGAGGTGATGAAGCC55.4(CGATT)5 RYW35ATTAGCATCCCCCTCCAC54.1ATCCGCTTTCCCAACCAC57.7(CGTGC)5(GGA)6 RYW36TATTGTCCTTCCGCTCCC55.4ATGACTACTCTCCCCCCCT54.6(GGCTT)5 RYW37CATTCCGTTCCTTGTCTTCC56.9CAGTCTCACTCCTGCGATGT55.3(GCGAT)5 RYW38TCCCTGAAGGAGAAGAGCG57.5CACCATCCCAGCACAAACC58.9(AGCT)5 RYW39GTTGGGCGAGGTCAATCTG58.3TAGGGAGCCGAAGCAGAAG58(TCCT)5 RYW40TGCTCTTCGGCTCTTCTCC57.7ATCAGCTCATCGTGACCCC57.5(CAGC)6 RYW41GCAAACACTTGGCGGATAG56.5TGGAATGCCCAGGAGAAAT57.5(GATG)6 RYW42AGACACCCTGGGCAACATC57.4CTGGACTGGGCTTCGTTCT57.3(GGCT)5 RYW43GGAGATGCTTGCTTGGTTG56.2CAGGAATCGCAAGGAACAG56.2(GGAG)5 RYW44TAAAGCAGGTCGGCAAGAG56.4TCGGGTTTCTCCAGCATAAT57.3(CAAT)5 RYW45TCGCTGCTCAACATCAACC57.3TGGATCGGGCTATGTTGC57.1(TGGC)5 RYW46TAGCGGATTCACGAACGAG56.9AGACGCTAAAAAGCCCGAC57.3(CCTC)6 RYW47TTGTTTTTGCTGCTGCCTC57.2TGCTGGACTTCTTTTTGCC56.1(GCCT)5 RYW48TTTCTGAACTCACGCCACC56.3GGCAGCAACTAACCGTGTG57.1(GAAG)5 RYW49GCTAAATCCGCTGATGAGGT57TGTATGTTGCTCCAGCCTTG56.9(TATC)6 RYW50CAAGGCAGATAGGGCAAGT55.1TCGTCTGCTGCTGGTTTGT57(GGAG)5 RYW51TATCGCCGCACCTTACAAC57TGAGCCTGCTTCCATCTTG56.6(CTGC)5 RYW52AGTAGTCCTCCACCGCCAT56.5CTCTTCCTCGTTCTCGGCT56.8(TACC)5 RYW53ATGCCTCCGATGTAGATGC55.4GCCGCCTTCTCTTCATTCT56.8(GAGG)5 RYW54GCACTTGCTCCTGCTTCTC55.5GACCTTGCCGATGTTGTTG56.7(CCTC)5 RYW55CTGGTGGTGGTAGTTAGCG53.7TTATGCCACCCACCGTAGC59.1(TAGC)5 RYW56TCGTTTTCTTCCCTGCTTG56.1TTCGGCAGAACCTGTCGT56.6(AGAA)5 RYW57GGATTGCGGCTAAGTGTTG56.5CCCGCCTTTTTTTTACTACC56.6(TGTA)5 RYW58AGCCAGACCGAGAGTTTCC56.4AGCCACCTCACCTATGTTCC56.3(TTCT)5 續附表4 Continued table S4 標記Marker正向引物F-Sequence反向引物R-Sequence重復基序Repeated motif 序列Sequence (5′-3′)退火溫度Tm (℃)序列Sequence (5′-3′)退火溫度Tm (℃) RYW59CAGCAAAGCAACCTTCACC56.3TCGGAGAGAGGGTGAGAGAT55.7(GGCA)5 RYW60GGGAGATGCTTGCTTGGTT57.4GCTTTCTTTCCTTAGCCGAT56.1(GGAA)6 RYW61ACTGCTGCTTGCTCCTTGT55.5ACATCCCGAAACCCTAACC56.2(ATAC)5 RYW62GTTTAGAGAGCAGGAGGCG55AGCCCTGTCCACCCTAATC56.1(GCTC)5 RYW63TTTCTCTGCCACCATTTTC53.1CTGGTGCCTTTGCGATTAT56.1(GAGT)5 RYW64CCAGCGACTGACGAAACTT55.8AACATCAGGAACCACACGC55.9(ACCG)6 RYW65TAGCGTCGTCAAGAAGCACT56ACAGAGGTGACGAAACGATG55.4(GCCG)5 RYW66AGGATGTTGGCGGTGTTC55.8TTGGTGTGGGAGTATGCG55.1(GGTT)5 RYW67GAAGGAAACGCACCAGAGT54.7TTGGGTTTGTGCTTGGAGT55.9(TGCG)5 RYW68AGAGAACAATCCACACCGC55.2ATGTGGAGGTGGCATTCTG55.8(AGGG)5 RYW69AGCCGTTGGAAGAGGATT54.2GCTTGCTTTTTTGAGGGG55.7(GGAA)5 RYW70AGGTTAGGGATTGGGGGAT57.2CCTTTTTTTCCAGTCTCACA52.7(CGAG)5 RYW71CATCAACTTCATCTGCCCC55.6TGCTCTTGTGGTCGTTGTG55.3(GGCC)5 RYW72GGCACCTCCATTCATTCAC55.3CCAGATTTTCAAACCCCAT54.6(ACGC)5 RYW73TTATTTTGAATGCTCCCCC55.2TGGTCAGTCTTGAAGTCGC53.5(ACAA)5 RYW74AACGGATGTTCAGAAGCAG53TGGTTCCCAGCACCTAAAT55.2(GCAG)5 RYW75GTTCTCGTAACTGAAGGCG53.1GCCAGTAGGCTCTCTGAACA55.1(TTAT)5 RYW76TCCCTGTTTTTCTTCTCCG55.1GAATCTTCACGGAATCAGG52.2(GGAT)5 RYW77CAGCAAGCAGACAGAGCAG54.6ACAAAGCAGAGAGGGGAAG54(ATAC)5 RYW78ATGGTTGGATGTCTCTCGC55GCGTGAGCCTTTTTCTTTT55(ATCG)5 RYW79TCAGCAGACAACCCAAAAG53.9CGATTGTTGAGGGAAGTGA53.5(ATCA)5 RYW80ACCCAGAGTCCAGAGAAGC53.4GATGTCCTCCTCCTTCTCC52.6(AGCG)5 RYW81TCAGATTTTACAGCCGCAT54TCTTGGTTCTTCCCACTTG52.8(GTTT)6 RYW82TGCTGGTTGCTGGTAGGT53.9GTGCCGAAGAAGATGGTG53.7(AGCG)5 RYW83TTGTAGAGCAGGAAGGAGAT51.4TAGACGAAGGACACGAAAC50.3(GAAA)5 RYW84AACCCACCCATCCATTCCT58.5TAAGTCGTCGTCGGCAGAGT58.2(GAGC)5 RYW85GATGGATGGATTGCGTTTC55.7AACGGATTGTCTCCATTGC55.3(TCAC)5

附表5 85個糜子SSR標記的特性

Table S5 Characteristics of 85 common millet SSR markers with polymorphism

引物名稱Marker name觀察等位基因大小Observed allele size in common millet (bp)分辨率（Rp值）Resolving power (Rp) value RYW1100; 300; 4503.5 RYW2100; 150; 200; 250; 4503 RYW3100; 150; 350; 4004.25 RYW4100; 150; 200; 2505.25 RYW5300; 350 2.75 RYW6100; 150; 400; 450 3.75 RYW7150; 200; 3004 RYW8350; 4002.25 續附表5 Continued table S5 引物名稱Marker name觀察等位基因大小Observed allele size in common millet (bp)分辨率（Rp值）Resolving power (Rp) value RYW9150; 350; 4004.5 RYW10150; 250; 4004.5 RYW11150; 350; 4003.5 RYW12150; 200; 2504.5 RYW13100; 200; 250; 3505.25 RYW14400; 4503 RYW15100; 150; 2003 RYW16100; 150; 250; 300; 3504.5 RYW17150; 300; 3504.25 RYW18100; 350; 4003.5 RYW19100; 150 3 RYW20150; 350; 4003.5 RYW21150; 200; 300; 3505.5 RYW22100; 200; 300; 4005.5 RYW23100; 150; 200; 400; 4504.5 RYW24100; 150 3 RYW25100; 150; 4004.5 RYW261001.5 RYW27250; 4002.25 RYW28100; 200; 3003.75 RYW29100; 200; 3503.75 RYW30100; 200; 3504 RYW31100; 200; 300; 4005.5 RYW32100; 150; 200; 4002.75 RYW33150; 250; 350; 400; 4502.75 RYW34150; 250; 3501.5 RYW35100; 150; 200; 3503 RYW36100; 200; 350; 4502 RYW37150; 200; 250; 3003.25 RYW38200; 300; 3502.25 RYW39100; 150; 350; 4002.5 RYW40150; 350; 4002 RYW41150; 300; 4004 RYW42100; 250 1 RYW43250; 350; 4503.75 RYW44100; 1501.75 RYW45100; 2502.25 RYW46100; 150; 2503.25 RYW47100; 200; 300; 4005.75 RYW48100; 250; 4003.75 續附表5 Continued table S5 引物名稱Marker name觀察等位基因大小Observed allele size in common millet (bp)分辨率（Rp值）Resolving power (Rp) value RYW49200; 2503 RYW502001.5 RYW51100; 200; 4504 RYW52100; 250; 3002.5 RYW53100; 150; 250; 3002.75 RYW54150; 200; 3501.5 RYW55150; 250; 350; 400; 4503.25 RYW56200; 350; 4004.25 RYW57200; 300; 3503 RYW58100; 150; 200; 3503 RYW59150; 250; 3501.5 RYW60150; 250; 3502.25 RYW61250; 300; 3501.5 RYW62200; 250; 350; 4004.25 RYW63100; 150; 2002.5 RYW64100; 250; 4002.25 RYW65150; 250; 350; 400; 4502.5 RYW66150; 200; 250; 3002 RYW67100; 250; 3003 RYW682001.5 RYW69100; 2002.25 RYW70150; 3001.25 RYW71100; 150; 250; 4503.25 RYW72100; 200; 3502 RYW73100; 150; 3502.5 RYW74200; 3502.25 RYW75100; 150; 4002 RYW76100; 150; 350; 4002.75 RYW77100; 150; 200; 4003.5 RYW78100; 150; 200; 3503 RYW79100; 150; 4503 RYW80100; 300; 350; 4004 RYW81100; 250; 3503.25 RYW82200; 300; 3504.25 RYW83100; 150; 250; 3505 RYW84250; 4502 RYW85150; 200; 3502.75 平均Mean3.15

附表6 85對引物檢測的遺傳參數

Table S6 Genetic parameters of the 85 polymorphic SSR markers used in the study

位點Locus觀測等位基因Na有效等位基因Ne多樣性指數I觀測雜合度Ho期望雜合度HeNei’s期望雜合度Nei多態性信息含量PIC RYW132.12570.87810.55210.52960.43020.6318 RYW231.96230.77790.61460.49040.46730.4824 RYW331.93310.72930.53120.48270.44590.5882 RYW432.21860.88670.65620.54930.44490.5751 RYW532.32290.93080.66670.56950.55570.5616 RYW632.16260.84360.64580.53760.43350.5612 RYW731.87090.77170.43750.46550.39060.6343 RYW832.60231.01170.43750.61570.57190.7281 RYW932.02550.76570.60420.50630.47530.5744 RYW1031.95670.74770.48960.48890.41220.5665 RYW1132.05260.80980.59380.51280.49860.5690 RYW1232.54690.99980.51040.60740.55930.6393 RYW1332.12060.82630.65620.52840.51530.6185 RYW1421.84320.65000.70830.45750.44720.3278 RYW1521.99910.69290.97920.49980.49980.0400 RYW1632.00430.73450.59380.50110.48050.5650 RYW1731.98560.72970.51040.49640.47970.6176 RYW1821.84320.65000.70830.45750.36530.3226 RYW1931.91460.69420.57290.47770.46820.5311 RYW2021.99460.69180.71880.49860.40380.4527 RYW2121.98620.68970.79170.49650.48600.3548 RYW2221.54630.53830.37500.35330.35370.4328 RYW2321.98940.69050.65620.49730.49320.4926 RYW2421.89140.66420.55210.47130.38050.5727 RYW2522.00000.69310.68750.50000.43970.5052 RYW2621.93210.67550.75000.48240.48350.3504 RYW2721.81110.64010.46880.44790.35870.5371 RYW2831.68840.66980.43750.40770.41330.6196 RYW2931.66280.72170.34380.39860.40440.5866 RYW3032.37920.95540.39580.57970.48060.6522 RYW3132.47510.97400.66670.59600.45440.5971 RYW3231.97850.83390.47920.49460.37480.5296 RYW3332.01050.76190.72920.50260.40570.3819 RYW3432.06150.76250.80210.51490.41950.3360 RYW3532.18930.88010.71880.54320.44590.4105 RYW3621.95230.68090.69790.48780.48770.4993 續附表6 Continued table S6 位點Locus觀測等位基因Na有效等位基因Ne多樣性指數I觀測雜合度Ho期望雜合度HeNei’s期望雜合度Nei多態性信息含量PIC RYW3832.23150.90720.75000.55190.53290.4922 RYW3921.71670.60820.57290.41750.35140.3980 RYW4032.33580.92550.52080.57190.54500.6771 RYW4132.61971.01660.70830.61830.58260.4453 RYW4232.35370.92910.83330.57510.56250.3423 RYW4332.25300.88310.63540.55620.53400.5465 RYW4431.64040.61720.50000.39040.41260.4052 RYW4521.78860.63280.65620.44090.44200.3494 RYW4632.01160.71980.93750.50290.50180.1133 RYW4721.92460.67340.80210.48040.47380.2760 RYW4832.08200.77950.82290.51970.51710.3105 RYW4932.20820.86070.71880.54710.46570.4356 RYW5031.78550.67100.48960.43990.31800.4702 RYW5131.85340.72790.62500.46040.39610.4686 RYW3732.81531.06330.65620.64480.60270.4765 RYW5231.94780.70330.72920.48660.48410.3576 RYW5332.76761.05290.60420.63870.59900.6038 RYW5432.10530.83020.72920.52500.41280.5198 RYW5532.11350.82470.71880.52690.42400.4679 RYW5632.64561.03540.44790.62200.56010.5826 RYW5732.56711.00730.56250.61050.57070.6416 RYW5832.26020.90070.80210.55760.55670.5219 RYW5932.42050.97720.78120.58690.54740.5060 RYW6032.06290.76280.54170.51520.43780.5862 RYW6131.93920.81800.50000.48430.37750.5448 RYW6221.98620.68970.81250.49650.49060.3020 RYW6321.86330.65600.66670.46330.46070.5868 RYW6432.00890.74950.75000.50220.42200.3502 RYW6532.04230.80720.65620.51040.49280.4388 RYW6632.14750.82430.86460.53430.52360.2360 RYW6732.06520.77550.78120.51580.50710.4080 RYW6832.14650.84690.57290.53410.43080.5809 RYW6932.37650.93780.69790.57920.47990.5282 RYW7021.90020.66670.77080.47370.47740.2909 續附表6 Continued table S6 位點Locus觀測等位基因Na有效等位基因Ne多樣性指數I觀測雜合度Ho期望雜合度HeNei’s期望雜合度Nei多態性信息含量PIC RYW7121.90870.66900.65620.47610.39560.5107 RYW7231.66580.68970.44790.39970.42960.4642 RYW7332.06940.84580.53120.51680.49980.5117 RYW7431.89610.68900.75000.47260.37790.3592 RYW7531.14660.28420.11460.12790.12460.1879 RYW7632.08390.79080.54170.52010.39500.6074 RYW7721.99910.69290.91670.49980.49890.1522 RYW7821.61330.56800.40620.38020.28490.5219 RYW7921.71670.60820.57290.41750.35040.5911 RYW8021.91680.67130.72920.47830.46430.3803 RYW8132.04160.74380.85420.51020.50120.2501 RYW8231.99420.77790.69790.49850.41840.4476 RYW8331.36520.52690.23960.26750.24220.4215 RYW8432.00110.71720.76040.50030.49720.4262 RYW8531.95520.70530.67710.48860.48320.6097 平均 Mean2.72942.04000.77080.63360.49980.45510.4723 標準差SD0.44170.28740.13470.15330.07620.07800.1339

Evaluation of Genetic Diversity of Common Millet () Germplasm Available in China using High Motif Nucleotide Repeat SSR Markers

Wang RuiYun1,2, LIU XiaoYu1, Wang HaiGang2, Lu Ping3, Liu MinXuan3, CHEN Ling2, Qiao ZhiJun2

(1College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi;2Institute of Crop Germplasm Resources, Shanxi Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau, Ministry of Agriculture/Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Genetic Improvement of Minor Crops, Taiyuan 030031;3Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

Theobjective of this study to develop SSRs with high motif (tetra-, penta- and hexa-) nucleotide repeat and use them to evaluate the genetic diversity of common millet germplasms, and to provide significant implications for future linkage maps construction and evolution research of common millet.Comprehensive evaluation of phenotypic diversity was carried out based on membership function, principal component analysis (PCA) and cluster analysis. SSR primers developed in author’s laboratory by high-throughput sequencing were used to identify polymorphisms in different common millet accessions from various geographic origins. PowerMarker 3.25 and PopGen 1.32 were used to calculate the measures of genetic diversity and Nei’s genetic distance, respectively. Mega 5.0 and Structure 2.2 were used to carry out cluster analysis and identify genetic groups.A set of 96 common millet accessions were used and seven phenotypic traits were investigated. Results showed that the genetic variation of tiller numbers and plant height were the most abundant. A total of 85 pairs of amplified primers (56.29%) showed high polymorphism among the 96 genotypes. A total of 71 tetra-nucleotide repeat SSRs were detected, accounted for 83.53%. Meanwhile, 10 (11.76%) penta- and 4 (4.7%) hexa- nucleotide repeat SSRs were identified, respectively. The size of 85 SSRs ranged from 100 to 450 bp with an average value of polymorphism information content (PIC) of 0.51. Resolving power (Rp) value varied from 1.00 to 5.75 (mean = 3.15).Theaverage Rp value of tetra-, penta- and hexa- nucleotide repeat SSRs was 3.15, 2.8 and 4.0, respectively. Evaluating the distribution frequency of 85 SSRs based on Rp, it was observed that their ranges were 0-1, 1-2, 2-3, 3-4, 4-5 and 5-6, with 1 (1.18%), 15 (17.65%), 31 (36.47%), 20 (23.53%), 12 (14.12%) and 6 (7.06%) markers at each interval, respectively. Fifty-one markers accounting for 60% distributed at intervals of 2-3 and 3-4. A total of 232 alleles were amplified among 96 accessions by the 85 SSR markers. 2-3 alleles were generated by each locus, with an average of 2.7294 alleles. Sixty-two markers produced 3 alleles, and 23 markers produced 2 alleles. The range of gene diversity was 0.2842-1.0633, with an average of 0.7708. The range of PIC was 0.0400-0.7281, with an average of 0.4723.Genetic distance and genetic identity of common millet resources with different ecotopes were 0.0093-0.5052 (average=0.1798) and 0.6034-0.9907 (average=0.8485). Cluster analysis based on unweighted pair group method of mathematical averages (UPGMA) separated the 96 accessions into four groups (Northeast spring-sowing, Northern spring-sowing, Northern summer-sowing and Loess Plateau spring & summer-sowing ecotopes). A genetic structure assay indicated a close correlation between geographical region and genetic diversity.The present work developed a set of 85 tetra-, penta- and hexa- nucleotide repeat SSRs in common millet. These high motif microsatellite markers with high Rp value can distinguish different genotypes, generate high polymorphisms in polymerase chain reaction amplification. Based on the above molecular markers, the genetic diversity of Chinese common millet germplasms was assessed and those accessions from Northern spring-sowing and Loess Plateau spring & summer-sowing ecotopes are highly and genetically diverse.

common millet (); high motif SSR; genetic diversity; clustering analysis; population structure

2017-05-17；接受日期：2017-06-12

國家自然科學基金（31271791）、山西省回國留學人員科研資助項目（2016-066）、國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-06-13.5-A16）、山西省重點研發計劃（一般項目）（農業）項目（201603D221003-5）

王瑞云，Tel：15234420135；E-mail：wry925@126.com。劉笑瑜，E-mail：251719093@qq.com。王瑞云和劉笑瑜為同等貢獻作者。通信作者王瑞云。通信作者喬治軍，Tel：0351-7065530；E-mail：nkypzs@126.com