不同紫花苜蓿品種對低磷環境的形態與生理響應分析

栗振義，張綺芯，仝宗永，李躍，徐洪雨，萬修福，畢舒貽，曹婧，何峰，萬里強，李向林

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不同紫花苜蓿品種對低磷環境的形態與生理響應分析

栗振義1，張綺芯2，仝宗永1，李躍1，徐洪雨1，萬修福1，畢舒貽1，曹婧1，何峰1，萬里強1，李向林1

（1中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193；2蘭州大學草地農業科技學院/草地農業生態系統國家重點實驗室，蘭州 730020）

篩選耐低磷苜蓿品種及與耐低磷密切相關的性狀指標，進一步為紫花苜蓿耐低磷機制研究和生產應用提供理論依據。在溶液培養條件下，對20個紫花苜蓿品種的24 d齡的幼苗分別進行常磷（500 μmol·L﹣1KH2PO4）和低磷（5 μmol·L﹣1KH2PO4）處理，30 d后檢測各品種的莖葉干重（）、株高（）、根干重（）、根冠比（）、總根長（）、根表面積（）、全磷含量（）、磷利用率（）、酸性磷酸酶活性（），并計算各指標的耐低磷系數。進一步對各指標的耐低磷系數進行相關性分析，并運用主成分分析、隸屬函數分析、回歸分析及聚類分析方法，綜合評價不同品種耐低磷性及篩選與耐低磷密切相關的指標，同時建立耐低磷評價模型。低磷脅迫下，各品種紫花苜蓿的地上部分生長受到抑制，地下根系增大，全磷含量顯著下降（＜0.01）。通過主成分分析可將9個單項指標轉化為4個新的相互獨立的綜合指標。進一步利用隸屬函數對4個新的綜合指標進行耐低磷綜合評價，結合聚類分析結果，可將20個紫花苜蓿品種可分為三類，其中耐低磷較強的品種包括敖漢、新牧1號、耐鹽之星、皇冠；中度耐低磷品種包括騎士T、馴鹿、牧歌37CR、龍牧801等9個品種；耐低磷較弱的品種包括巨能Ⅱ、中苜2號、康賽等7個品種。進一步利用逐步回歸分析方法建立了紫花苜蓿耐低磷性評價數學模型=-0.7997+0.3856+0.2025+0.3789+0.1051+0.4188+0.1347，方程的決定系數R=0.9982.通過分析紫花苜蓿不同品種的耐低磷能力，得出耐低磷較強的品種為敖漢、新牧1號、耐鹽之星、皇冠，與耐低磷性最相關的指標有莖葉干重、株高、根干重、總根長、全磷含量和酸性磷酸酶活性，可用于紫花苜蓿耐低磷性的評價篩選。

紫花苜蓿；耐低磷；主成分分析；綜合評價；回歸分析

0 引言

【研究意義】據統計當今世界13.19億hm2耕地中約有43%的土壤缺磷，中國1.07億hm2農田中約有50%的耕地土壤速效磷含量低于5 mg·kg-1[1]，而紫花苜蓿生產所需有效磷一般為10—15 mg·kg-1[2]。磷屬于非可再生資源，磷礦資源預計還可以利用50－200年[3]，依靠施用大量磷肥難以滿足未來農業生產的需求，而且中國磷肥的當季利用率只有15%左右，總利用率也不超過25%[4]，有效磷極易與金屬離子及土壤顆粒形成AlPO4、FePO4、Fe3(PO4)2、Ca3(PO4)2等難溶磷[5-6]。所以提高紫花苜蓿（）磷吸收利用效率，改善磷營養遺傳特性是解決土壤有效磷缺乏的有效途徑。通過挖掘紫花苜蓿自身遺傳潛力，篩選耐低磷品種，可以為苜蓿磷高效吸收利用機制的研究提供理論依據。【前人研究進展】磷是植物生長所必需的大量元素之一，是構成核酸、磷脂、高能磷酸化合物等的重要組分，并參與能量代謝、糖分代謝、酶促反應、光合作用等重要代謝過程[7]。磷高效植物在磷素營養供應不足時仍能維持正常生長或受低磷影響較小，如磷高效大豆表現為磷吸收能力強，再分配效率高，低磷條件下保持較多的磷，因此表現為耐低磷[8]。耐低磷植物主要通過調整根形態結構、分泌有機酸和磷酸酶、結合叢植菌根真菌、誘導高親和磷轉運蛋白[9]等措施提高土壤磷的吸收效率[10]，同時通過釋放液泡中磷，改造膜減少對磷脂的依賴，轉移衰老組織中的磷等方式提高磷利用效率以維持體內磷濃度的平衡[3]。根系作為植物營養吸收器官，在低磷脅迫下通過增加根冠比、促進側根和根毛的生長擴大吸收磷面積[11]。其中最典型的是白羽扇豆（）在低磷下形成排根，大大提高了磷吸收效率[12]。低磷下植物根系通過分泌磷酸酶催化磷酸單酯水釋放磷[13]，以及釋放檸檬酸、蘋果酸、草酸、琥珀酸等多種有機酸活化土壤中的Al、Fe、Ca等形成的難溶性磷酸鹽[14-15]。目前已有多篇文章報道了大豆（）耐低磷品種的篩選與評價[16-18]，但關于紫花苜蓿耐低磷評價及機制研究較少。高艷等[19]指出黃花苜蓿（）主要通過根系分泌檸檬酸活化根際難溶磷，而蒺藜苜蓿通過維持較大的根系來適應低磷環境。任立飛[20]發現低磷脅迫下錫盟黃花苜蓿的干重、鮮重、株高、地上部磷含量、凈光合速率、氣孔導度與蒸騰速率等下降幅度較小，而主根長與檸檬酸釋放速率的增加幅度較大，綜合評價得出錫盟黃花苜蓿的耐低磷性強于呼盟黃花苜蓿。【本研究切入點】解決土壤有效磷缺乏問題只能從增施磷肥或改變植物磷吸收效率兩方面入手，但施入土壤的磷肥很容易被固定并造成磷資源浪費，所以挖掘植物遺傳潛力，篩選耐低磷紫花苜蓿品種是解決土壤有效磷缺乏的有效途徑。【擬解決的關鍵問題】本研究通過模擬低磷環境，分析20個紫花苜蓿品種幼苗期耐低磷綜合表現，并基于各形態生理指標與耐低磷性的關系建立苜蓿耐低磷評價模型，以期篩選出耐低磷較強的紫花苜蓿品種以及與耐低磷密切相關的指標，為紫花苜蓿耐低磷評價及磷高效吸收利用機制研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試紫花苜蓿材料

參試材料為20個國內外紫花苜蓿品種，品種名見表1。

表1 試驗材料

1.2 培養條件

挑選顆粒飽滿顏色純正的紫花苜蓿種子，用75%酒精滅菌后晾干，置于含有濾紙的培養皿發芽。保持濕潤條件，待幼苗生長9 d時移至36 cm×26 cm×14 cm的含有營養液的方形培養盆，置于溫室培養。每盆移植60棵，溫室條件為晝/夜溫度為25℃/20℃，濕度為60%，光照/黑暗為14 h/10 h，每4 d換一次營養液，營養液pH 6.0－6.3。營養液成分為1 000 μmol·L-1MgSO4，250 μmol·L-1K2SO4，250 μmol·L-1CaCl2，1 000 μmol·L-1NH4NO3，2 500 μmol·L-1KNO3，500 μmol·L-1KH2PO4，100 μmol·L-1Fe-Na2-EDTA，30 μmol·L-1H3BO3， 5 μmol·L-1MnSO4，1 μmol·L-1ZnSO4，1 μmol·L-1CuSO4，0.7 μmol·L-1Na2MoO4。紫花苜蓿幼苗在正常磷（500 μmol·L-1KH2PO4）條件下生長15 d后，進行低磷（5 μmol·L-1KH2PO4）脅迫，以常磷條件為對照，連續脅迫處理30 d后分別檢測低磷與常磷條件下紫花苜蓿低磷相關性狀指標，每個指標檢測3個生物學重復，每個重復4個單株。

1.3 性狀測定

取低磷條件下培養30 d的紫花苜蓿幼苗，以常磷培養為對照，3組重復，每組取4株生長均一的植株，測量株高；取紫花苜蓿根及莖葉，100℃殺青30 min后60℃烘烤48 h，分別稱量莖葉及根干重，并計算根冠比；用根系掃描儀掃描完整的根系并利用萬深LA-S根系分析系統計算總根長及根表面積。

酸性磷酸酶活性檢測：稱取0.1—0.3 g新鮮根，盡量取根尖部分，液氮條件下研磨至粉末狀，溶于1.2 mL的0.1 mol·L-1提取緩沖液（1 mol·L-1冰醋酸溶液8.82 mL和0.3 mol·L-1醋酸鈉溶液273.3 mL，pH 4.0），酸性磷酸酶活性以單位時間內單位鮮重質量的紫花苜蓿根內酸性磷酸酶水解對硝基苯磷酸二鈉（ρ-NPP）生成對硝基苯酚（ρ-NP）的量（μmol·g-1·h-1）表示[17]。

植株地上部分磷含量的測定：植株莖葉在100℃殺青30 min后于60℃烘烤48 h至恒重，采用鉬銻抗比色法測定植株磷含量[21]，并計算磷利用率[17]，植株磷利用率=植株干重/植株磷吸收量。

1.4 數據統計分析

利用SAS 9.2進行相關性分析、主成分分析、聚類分析、逐步回歸分析，采用隸屬函數對20個品種的紫花苜蓿進行耐低磷綜合評價。指標計算參考相關文獻[22-23]。

分別計算莖葉干重、株高、根干重、根冠比、總根長、根表面積、酸性磷酸酶活性、植株全磷含量及植株磷利用率的耐低磷系數[17]。

不同品種紫花苜蓿綜合指標的隸屬函數值計算：

式中，(X)表示第個綜合指標的隸屬函數值，X表示第個綜合指標值；X表示第個綜合指標的最大值，X表示第個綜合指標的最小值。

各綜合指標權重的計算：

W==1, 2, 3, …, n（3）

式中，W表示第個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度及權重；P為各品種第個綜合指標的貢獻率。

耐低磷綜合評價值的計算：

=1, 2, 3, …, n（4）

式中，表示在低磷脅迫條件下各品種耐低磷能力的綜合評價值。

2 結果

2.1 低磷下各性狀差異分析

紫花苜蓿幼苗在常磷與低磷脅迫下各性狀都存在差異。為了消除品種間固有的差異，采用了耐低磷系數（即相對值）計算方法，以便準確地反映不同品種的耐低磷性。如表2所示，紫花苜蓿莖葉干重的耐低磷系數變化范圍在0.5930—1.0756，有17個品種小于1，株高的耐低磷系數變化范圍為0.6454— 1.1828，其中18個品種小于1，綜合表明，低磷導致莖葉干物質量及株高下降；根干重和根冠比耐低磷系數分別為0.6429—1.6120和1.0805—1.5648，表明低磷導致根系比例增大；總根長和根表面積耐低磷系數變化范圍分別為0.6455—1.3110和0.6480— 1.3129，其中敖漢、耐鹽之星、皇冠、馴鹿、甘農3號總根長及根表面積的耐低磷系數均大于1，有報道顯示紫花苜蓿通過增大根系來適應低磷環境[19]；全磷含量的耐低磷系均小于1，在0.2442—0.4471，說明低磷下全磷含量均低于常磷下的紫花苜蓿，但磷利用率的耐低磷系數均大于1，變化范圍為2.2462—4.1289；酸性磷酸酶活性的耐低磷系數變化范圍為0.5282—1.5567。

表2 低磷脅迫下不同品種各性狀的耐低磷系數

：莖葉干重 Weight of stems and leaves；：株高 Plant height；：根干重 Dry weight of root；：根冠比 Ratio of root to stem；：總根長 Total root length；：根表面積 Root square area；：全磷含量 Total Pi content；：磷利用率phosphate utilization efficiency；：酸性磷酸酶活性Acid phosphatase activity

2.2 性狀相關性分析

通過分析不同性狀之間的相關性可以揭示性狀間是否存在依存關系及相關關系的方向與強度[24]。結果顯示部分指標間存在一定相關性，即不同性狀間可能存在信息重疊，單靠單項性狀難以對表現復雜的耐低磷性進行綜合評價。如表3，莖葉干重與株高、根干重、根表面積、酸性磷酸酶活性呈正相關（＜0.05）；根冠比與總根長、全磷含量呈極顯著正相關（＜0.01），與酸性磷酸酶活性呈顯著負相關（＜0.05）；總根長與根冠比、根干重、株高、根表面積都呈極顯著正相關（＜0.01）。全磷含量與磷利用率成極顯著負相關（＜0.01），相關系數為-0.9536，全磷含量與根冠比的相關系數為0.5529，呈顯著正相關（＜0.05）；酸性磷酸酶活性與莖葉干重呈顯著正相關（＜0.05），與根冠比呈顯著負相關（＜0.05）。

表3 低磷脅迫下各性狀的耐低磷系數相關性

*代表顯著性差異（＜0.05），**代表極顯著性差異（＜0.01）

* represents significant difference at＜0.05, ** represents significant difference at＜0.01

2.3 主成分分析

主成分分析可在損失較少信息的基礎上將大量指標轉化為有效少量指標，從而達到簡化指標及濃縮數據的目的[22]。由表4—5可知，前4個主成分的貢獻率分別為42.17%、25.78%、17.27%、6.82%，其中第1主成分的特征值是3.7950，貢獻率為42.17%，對應較大的特征向量是根干重和總根長，反映了根系因子；第2主成分特征值是2.3202，貢獻率為25.78%，載荷較高的是莖葉干重；第3主成分特征值為1.5542，貢獻率為17.27%，載荷較高的是全磷含量和酸性磷酸酶活性；第4主成分特征值為0.6134，貢獻率為6.82%，載荷較高的是株高；前4個主成分累計貢獻率達92.04%，其余貢獻率可忽略不計，這樣可以將9個單項指標轉化為4個相互獨立的綜合指標，并代表了原始指標的大部分信息。

2.4 品種綜合評價

2.4.1隸屬函數分析 根據主成分分析得到的4個相互獨立的綜合指標，利用公式（2）計算不同品種各綜合指標的隸屬函數值(X)。從表6可以看出，在同一綜合指標()中，敖漢的(X)最大，為1.0000，巨能Ⅱ的(X)最小，為0.0000，表明敖漢在()綜合指標上耐低磷性最強，巨能II耐低磷性最差。根據各綜合指標貢獻率，利用公式（3）計算其權重W，計算得到4個綜合指標的權重分別為0.4582、0.2801、0.1876、0.0741（表6）。進一步利用公式（4）計算耐低磷綜合評價值值，并根據值大小對其耐低磷性強弱排序，其中耐低磷較強的有敖漢、新牧1號、耐鹽之星等；耐低磷較弱的品種有巨能Ⅱ、中苜2號、康賽等（表6）。

表4 各綜合指標特征根及貢獻率

表5 各因子載荷矩陣

2.4.2 耐低磷品種聚類分析 為了客觀地將不同耐低磷紫花苜蓿分類，對4個新的綜合指標的耐低磷評價值采用最大距離法進行了聚類分析[22,25]，根據最大距離值大于1.2050可將20個紫花苜蓿品種分為3類，第一類為耐低磷較強的品種，耐低磷綜合評價值為0.6534—0.7352，包括敖漢、新牧1號、耐鹽之星、皇冠；第二類為中度耐低磷品種，耐低磷綜合評價值為0.4404—0.6534，包括騎士T、馴鹿、牧歌37CR、龍牧801、MF4020、三得利、中苜1號、WL232HQ、隴東；第三類為耐低磷較弱的品種，耐低磷綜合評價值為0.1733—0.4404，包括WL168HQ、甘農3號、牧歌、公農2號、康賽、中苜2號、巨能Ⅱ（圖1）。

2.5 回歸模型的建立

為了檢驗主成分分析結果，同時建立紫花苜蓿耐低磷評價數學模型[22]，本試驗以耐低磷綜合評價值（）為因變量，以各單項指標的耐低磷系數作自變量進行逐步回歸分析[25]，得到回歸方程：=-0.7997+ 0.3856+0.2025+0.3789+0.1051+ 0.4188+0.1347（＜0.01），方程的決定系數R=0.9982，=1211.37。由方程可知，在9個指標中有6個指標對紫花苜蓿耐低磷性有顯著影響，分別是莖葉干重、根干重、株高、總根長、全磷含量、酸性磷酸酶活性，與主成分分析結果相吻合。對20個紫花苜蓿品種的耐低磷性的綜合評價值與預測值進行相關性分析發現，相關系數為=0.92674，達到極顯著水平（＜0.01），說明此方程對紫花苜蓿耐低磷性預測效果較好。

表6 各品種的綜合性狀指標值、權重、μ(X)及綜合評價值（D）

3 討論

土壤對磷具有強烈吸附作用，通常有效磷含量為0.1—10.0 μmol·L-1 [26]，目前已報道了低磷（有效磷濃度≤10 μmol·L-1）對紫花苜蓿形態生理方面的影響[15,19-20]。在室內試驗營養液培養環境中，一般將500 μmol·L-1KH2PO4作為苜蓿[19-20]和大豆[27-28]正常磷水平，所以本試驗以常磷500 μmol·L-1KH2PO4為對照，在低磷（5 μmol·L-1KH2PO4）環境下對國內外20個紫花苜蓿品種進行了耐低磷評價與分析。植物耐低磷表現是一個復雜的過程，同時受遺傳背景和環境因素影響，運用多個指標綜合評價才能有效反映出不同品種的耐低磷性。本試驗為了消除品種間固有的差異，本試驗引用了耐低磷系數進行分析。

低磷脅迫下植物凈光合速率、氣孔導度與蒸騰速率均下降，從而引起地上生物量減少[29-30]，磷含量降低[20]，根冠比[31]、根系表面積、總根長、磷利用率增大，根尖酸性磷酸酶活性增強[17,20,32]等現象。低磷脅迫下，葉片光合作用下降[33]，葉肉細胞變小[34]，葉面積、葉片生長速率和葉片數量顯著減少，從而降低了同化面積并嚴重限制光合作用的總碳固定量[35]。光合作用的下降主要因為有機磷循環以及RuBP（核酮糖二磷酸羧化酶）更新速率的降低，進而導致植物葉片RuBP濃度、RuBP羧化酶活性、RuBP羧化酶結合位點都有不同程度的降低[36-37]。為了適應低磷環境，植物優先將光合產物分配到地下部分，并抑制地上部分生長[11]，表現為根冠比增加[32,38-39]。本試驗中，低磷脅迫下大部分紫花苜蓿品種的莖葉干重、株高有所下降，所有品種表現為全磷含量下降，根冠比和磷利用率增加。

低磷下植物根系分泌酸性磷酸酶也是植物適應低磷脅迫的重要機理[32]，酸性磷酸酶能酶促土壤有機磷化合物的酯磷鍵發生裂解，釋放相應的醇和無機磷，從而提高土壤磷素的有效性[40]。高彬等[41]指出大豆缺磷時根系磷含量降低，但根系組織酸性磷酸酶活性是全磷培養植株的1.3倍。劉淵[17]發現大豆在2 μmol·L-1和1 000 μmol·L-1處理下22個品種根尖酸性磷酸酶的耐低磷系數為1.9229—35.2011。在本試驗中，低磷脅迫下部分品種根組織的酸性磷酸酶活性有所增強。

關于植物耐低磷的形態及生理指標有很多，本試驗初步選取了9個指標用于紫花苜蓿耐低磷評價。通過主成分分析可將9個原始的單項指標轉換成4個新的相對獨立的綜合指標，進一步對4個新的綜合指標利用隸屬函數分析法得到耐低磷綜合評價值，這樣比較客觀的展示了不同品種的耐低磷性，避免了利用單個性狀指標描述耐低磷的局限性。聚類分析可以根據研究對象之間親疏關系的統計量進行分類，從而排除人為確定標準帶來的主觀影響，該方法已普遍應用于植物抗逆材料的篩選研究[22,24-25]，通過聚類可將20個紫花苜蓿品種客觀地分為耐低磷品種、中度耐低磷品種、耐低磷較弱的品種。逐步回歸得到6個顯著影響耐低磷的單項指標，與主成分分析結果一致，同時得到紫花苜蓿耐低磷性評價數學模型，可以預測不同紫花苜蓿品種耐低磷性的強弱，使抗逆性的鑒定與利用研究更有預見性[23]。

4 結論

本研究對20個紫花苜蓿品種進行了耐低磷評價及篩選，根據耐低磷能力強弱可分為3類，其中耐低磷品種包括敖漢、新牧1號、耐鹽之星、皇冠，中度耐低磷品種包括騎士T、馴鹿、牧歌37CR、龍牧801、MF4020、三得利、中苜1號、WL232HQ、隴東，耐低磷較弱的品種包括WL168HQ、甘農3號、牧歌、公農2號、康賽、中苜2號、巨能Ⅱ。低磷脅迫下，莖葉干重、株高、根干重、總根長、全磷含量、酸性磷酸酶活性可作為篩選耐低磷紫花苜蓿的參考指標。本試驗為進一步研究紫花苜蓿磷高效吸收利用機制提供了理論依據。

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（責任編輯 楊鑫浩）

Analysis of Morphological and Physiological Responses to Low Pi Stress in Different Alfalfas

LI ZhenYi1, ZHANG QiXin2, Tong ZongYong1, Li Yue1, XU HongYu1, WAN XiuFu1, BI ShuYi1, CAO Jing1, He Feng1, WAN LiQiang1, LI XiangLin1

(1Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193;2College of Pastoral Agriculture Science and Technology/State Key Laboratory of Grassland Agro-Ecosystems, Lanzhou 730020)

The objective of this study is to screen low Pi (inorganic phosphate) tolerant alfalfa and related characters, and to provide the theoretical basis for deficient Pi tolerance mechanism and then for application in production.In the condition of nutrient solution, twenty 24-day-old alfalfa seedlings were cultured in nutrient solution with sufficient phosphate (500 μmol·L﹣1KH2PO4) and deficient phosphate (5 μmol·L﹣1KH2PO4). After 30 days of treatment, a variety of physiological indexes, including dry weight of stems and leaves (), plant height (), dry weight of root (), ratio of root to shoot (), total root length (), root square area (), total Pi content (), phosphate utilization efficiency (), acid phosphatase activity (), were measured, and coefficients of resistance to deficient-Pi of each index were calculated. Furthermore, the correlation was carried out on the deficient-Pi coefficient of each index. Based on principal component analysis, subordinate function analysis, regression analysis and cluster analysis, deficient-Pi tolerance of different varieties were evaluated, and the indexes closely related to deficient-Pi tolerance were screened. At the same time, the evaluation model of deficient-Pi tolerance was established.Under deficient-Pi stress, the aboveground growth of all varieties were inhibited. However, the root system and the content of total Pi were decreased (＜0.01). Through principal component analysis, nine primary indexes could be transformed into four new mutual independent comprehensive indexes, which covered 92.04% of information. Then four new indexes were used to comprehensively assess the characters of deficient-Pi tolerance by subordinate function analysis. Combined with the clusters result, 20 alfalfa varieties were divided into three clusters. The varieties resistant to deficient-Pi include Aohan, Xinmu NO.1, Magnum Salt, Phabulous; varieties moderate resistant to deficient-Piinclude nine varieties, such as Knight T, Caribou, Amerigraze 37CR, Longmu 801 and so on; varieties sensitive to deficient-Pi include seven varieties, such as Magnum II, Zhongmu NO. 2, Concept and so on. Furthermore, the mathematic evaluation model of resistance to deficient-Pi,=﹣0.7997+0.3856+0.2025+0.3789+0.1051+0.4188+0.1347(R= 0.9982).The analysis of the ability of deficient-Pi tolerance in different alfalfa varieties showed Aohan, Xinmu NO.1, Magnum Salt and Phabulous have strong resistance to deficient-Pi stress. And the dry weight of stems and leaves, plant height, root dry weight, total root length, total Pi content and acid phosphatase activity were the most suitable indicators for the tolerance to deficient-Pi.

; deficient-Pi tolerance; principal component analysis; comprehensive evolution；regression analysis

2017-02-23；接受日期：2017-06-27

國家牧草產業技術體系（CARS-35）、農業科技創新工程（ASTIP-IAS14）

栗振義，E-mail：lizhenyily@163.com。張綺芯，E-mail：584271141@qq.com。栗振義和張綺芯為同等貢獻作者。通信作者李向林，E-mail：lxl@caas.cn