β-氨基丁酸抑制草莓低溫貯藏過程中灰霉病的效果及其機理

王 雷，李 華，張 華，王 會，金 鵬，趙 燕，鄭永華,*

（1.聊城大學農學院，山東 聊城 252000；2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

β-氨基丁酸抑制草莓低溫貯藏過程中灰霉病的效果及其機理

王 雷1，李 華1，張 華1，王 會1，金 鵬2，趙 燕1，鄭永華2,*

（1.聊城大學農學院，山東 聊城 252000；2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

以‘紅顏’草莓為實驗材料，研究β-氨基丁酸（β-aminobutyric acid，BABA）對草莓果實采后貯藏在低溫（（5±1）℃）條件下灰霉病的抑制效果及相關機理。草莓果實經過20 mmol/L的BABA處理后接種灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）孢子，然后在（5±1）℃的條件下貯藏12 d，結果發現BABA顯著抑制了灰霉病的發生和病斑直徑的擴展，與對照組相比，處理組幾丁質酶（chitinase，CHI）和β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）的活力分別提高了9.2%和54.9%，多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）和纖維素酶（cellulose，Cel）的活力分別降低了29.3%和24.4%，同時，BABA提高了FaCHI和FaGLU基因的表達，抑制了FaPG和FaCel基因的表達；此外，體外實驗的結果發現，BABA能夠破壞灰葡萄孢霉孢子的質膜完整性，導致了孢子內部可溶性蛋白質和可溶性糖的泄漏。結果表明，BABA通過誘導抗病相關酶活力來提高抗病性、延緩果實軟化并通過對病原菌的直接抑制作用減輕草莓果實采后灰霉病的發生。

草莓；β-氨基丁酸；灰葡萄孢霉；誘導抗性；基因表達；質膜完整性

草莓（Fragaria ananassa Duch.）屬薔薇科草本植物，果實為漿果類，成熟水果組織嬌嫩多汁，采摘和運輸過程中易遭受物理損傷和病原菌侵染而發生腐爛變質[1]，其中由灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是草莓果實采后貯運過程中最常見的真菌性病害之一[2]。水果采后真菌性病害的傳統防治措施主要是使用化學殺菌劑，但隨著人們對化學殘留以及真菌抗藥性的關注，采用綠色的激發子誘導抗病性正越來越受到研究者的重視[3]。

通過激發子誘導提高果蔬采后抗病性成為國際上果蔬貯藏保鮮研究的熱點。β-氨基丁酸（β-aminobutyric acid，BABA）是一種結構簡單的非蛋白質氨基酸，對多種作物以及水果具有廣譜的誘導抗病活性，能夠抑制病害的發生[4]。Ton等[5]研究發現BABA提高了擬南芥對霜霉病的抗病性，?a?ek等[6]發現BABA處理過的油菜在接種病原菌之后病程相關蛋白（pathogenesis related protein，PR）得到了積累，提高了油菜的抗病性。眾多的研究結果表明，BABA處理分別誘導了蘋果[7]、葡萄[8]、桃[9]以及冬棗[10]等果實對采后真菌病害的抗性，提高了果實中幾丁質酶（chitinase，CHI）、β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）等抗病相關酶活性，減輕了貯藏期間的病害。然而關于BABA對草莓果實在冷藏期間抗病保鮮的相關研究鮮見報道，本實驗選擇‘紅顏’果實為實驗材料，研究了BABA在草莓果實冷藏過程中對灰霉病的抑制效果及相關機理，為BABA在草莓采后貯運中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

病原菌灰葡萄孢霉分離于自然發病的草莓果實。

草莓品種為‘紅顏’（Fragaria ananassa Duch. cv.Hongyan），商業成熟期采摘自聊城市冠縣農業生態園，采摘后立即運到實驗室，選擇大小基本相同、無病蟲害和物理損傷的果實。

考馬斯亮藍、牛血清白蛋白、β-巰基乙醇、半胱氨酸、檸檬酸、磷酸氫二鈉 國藥集團化學試劑有限公司；十六烷基三甲基溴化胺（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB） 美國Biosharp公司。

1.2 儀器與設備

SP-752型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；Axioskop 40熒光顯微鏡 卡爾蔡司光學（中國）有限公司；Nano Drop 2000分光光度計 美國賽默飛世爾科技公司；SPX-250B生化培養箱 上海博迅實業有限公司；MyCycler普通聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 原料的預處理

灰葡萄孢霉經鑒定和回接實驗后，從草莓果實的病健交界處再次分離純化所得，將病原菌接種在PDA培養基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min）進行擴大培養，26 ℃條件下培養14 d，隨后用無菌生理鹽水將菌種的濃度配成1×105CFU/mL（血球計數板計數），現用現配。

實驗中所用草莓隨機分成2 組（處理組和對照組），為避免交叉感染，先用酒精（75%）擦拭草莓果實表面需要接種的部位，用滅菌鐵釘在果實的赤道部位打孔（深3 mm、直徑2 mm）。處理組用移液槍注入20 μL、20 mmol/L的BABA（預實驗最優濃度），對照組注入等量的無菌水，3 h后在果實的打孔處注入15 μL的病原菌孢子懸液。接種后，將果實用塑料盒分裝，并用0.01 mm厚的聚乙烯保鮮袋保濕，將果實貯藏于（5±1）℃、相對濕度為90%的培養箱中12 d，每隔4 d測定果實的發病率和病斑直徑，并在去除腐爛組織后用液氮取樣保存在-80 ℃的冰箱中，測定其他生化指標。每個處理組60 個果實，實驗重復3 次。

1.3.2 發病率和病斑直徑的測定

發病率的測定參考龍清紅等[8]的方法，草莓果實上灰霉病的病斑直徑大于2 mm時，認定為發病，其計算如式（1）所示。

病斑直徑用游標卡尺進行測定。

1.3.3 BABA對病原菌灰葡萄孢霉孢子質膜完整性的影響

BABA對灰葡萄孢霉質膜完整性的實驗參考Liu Jia等[11]的方法并作改進。用移液槍取100 μL灰霉孢子菌懸液加入到含20 mmol/L BABA的PDB培養基（20 mL）中，使得灰葡萄孢霉孢子的終濃度為5×105CFU/mL，不含BABA的試管作為對照。試管在26 ℃、200 r/min的恒溫搖床中培養，4 ℃、10 000×g離心20 min，收集培養時間為0、2、4、6 h的病原菌孢子。用磷酸緩沖液（50 mmol/L、pH 7.0）沖洗2 次以去除殘留培養基，灰葡萄孢霉孢子懸液用10 mg/mL的碘化丙啶（propidium iodide，PI）在30 ℃條件下染色5 min，離心收集孢子并用緩沖液沖洗去除殘留染料。在熒光顯微鏡下觀察孢子的染色情況，并依據公式（2）計算質膜完整性。

1.3.4 BABA對灰葡萄孢霉孢子可溶性蛋白質和可溶性糖泄漏的影響

BABA對灰葡萄孢霉孢子內可溶性蛋白質和可溶性糖泄漏的測定按照Zhang Changfeng等[12]的方法并作改進。100 μL灰霉孢子菌懸液轉移到含有100 mL PDB培養基的三角瓶中，灰葡萄孢霉孢子終濃度為5×105CFU/mL，在26 ℃、200 r/min的搖床培養，3 d后收集菌絲體。用雙蒸水沖洗3 次去除剩余的培養基，稱取3 g菌絲體轉移到含BABA（20 mmol/L）的20 mL雙蒸水的錐形瓶中，不含BABA作為對照，26 ℃、200 r/min的搖床上培養2、4、6 h后，用0.2 μm的微孔膜過濾，收集濾液測定總可溶性蛋白質和可溶性糖的含量。可溶性蛋白質含量的測定依據Bradford[13]的方法，使用考馬斯亮藍法進行測定，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為標準，結果表示為mg/g（以菌絲體質量計）。可溶性糖含量的測定參考Dubois等[14]的方法，用苯酚-硫酸法測定，以葡萄糖作為標準，結果表示為mg/g（以菌絲體質量計）。

1.3.5 CHI、GLU、多聚半乳糖醛酸酶和纖維素酶活力的測定

稱取1.0 g果肉，冰浴條件下用5 mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 5.0）勻漿，4 ℃、12 000×g離心20 min，取上清液用于測定CHI和GLU的活力。按照Wang Lei等[15]的方法，測定2 種酶的活力。以524 nm波長處反應混合物每分鐘增加0.001吸光度所需要的酶量為1 個CHI活力單位（U）；使用3,5-二硝基水楊酸法，測定反應體系在540 nm波長處的吸光度，以每小時生成1 mg葡萄糖為1 個GLU活力單位（U），結果以U/mg pro表示。

稱取1.0 g果肉組織，冰浴條件下用5 mL、40 mmol/L的乙酸鈉緩沖液（pH 5.5，其中含有100 mmol/L NaCl、體積分數2% β-巰基乙醇、體積分數0.2%半胱氨酸和質量分數1%聚乙烯吡咯烷酮）研磨，4 ℃、12 000×g離心20 min，取上清液測定多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）活力，參照Zhou Hongwei等[16]的方法，以半乳糖醛酸作為標準，測定276 nm波長處的吸光度，每小時水解釋放1 μmol/L半乳糖醛酸定義為1 個酶活力單位（U）。

稱取1.0 g草莓果肉組織，冰浴條件下用5 mL NaCl（0.4 mol/L）充分研磨，4 ℃條件下12 000×g離心20 min，取上清液測定纖維素酶（cellulose，Cel）活力，根據朱樹華[17]使用的方法進行測定。以1 h催化纖維素水解生成1 μg的葡萄糖所消耗的酶量為1 個酶活力單位，用U/mg pro表示。

1.3.6 FaCHI、FaGLU、FaPG和FaCel基因的表達

草莓果實抗病相關基因的表達根據Jiang Lulu等[18]的方法進行測定，測定的抗病相關基因包括FaCHI、FaGLU、FaPG和FaCel，根據美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）數據庫中相關基因的序列，利用Primer 5.0設計相關基因的PCR引物序列，由上海賽百盛生物基因技術有限公司合成，引物序列的相關信息見表1。果肉組織（5.0 g）在液氮中充分研磨，在15 mL含體積分數2%巰基乙醇的CTAB提取液（65 ℃）中混勻提取20 min，4 ℃離心20 min，所得上清液用等體積氯仿提取并離心，上清液用10 mol/L的氯化鋰沉淀，隨后4 ℃、12 000×g離心15 min，所得沉淀用SSTE溶液（內含1.0 mol/L NaCl、質量分數0.5%SDS、10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）和1 mmol/L乙二胺四乙酸）溶解，并用氯仿抽提2 次。抽提后的上清液用無水乙醇沉淀，所得的RNA用Nano Drop 2000分光光度計測定260 nm和280 nm波長處的光密度值并計算RNA含量。反轉錄過程按照2步法反轉錄（reverse transcription，RT）-PCR程序操作，以18S rRNA基因作為管家基因，對草莓果實相關基因的表達情況進行分析，用Quantity One v4.6軟件計算目的基因光密度值和內參基因光密度值，按照式（3）計算基因相對表達量。

表1 草莓果實抗病相關基因引物Table 1 Primers for the defense-related genes in strawberry fruits

1.4 數據統計分析

采用Origin 8.5軟件對實驗數據進行分析，用Duncan多重比較方法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 BABA對草莓果實灰霉病的抑制效果

如圖1所示，草莓果實在低溫（（5±1）℃）貯藏過程中，發病率和病斑直徑在貯藏過程中隨時間延長而增加，貯藏第12天時處理組和對照組的發病率均達到100%，但BABA處理能夠顯著抑制灰霉病病斑直徑的增大，貯藏期間處理組果實的病斑直徑都顯著小于對照組（P＜0.05），5 ℃貯藏12 d后，對照組和處理組病斑直徑分別為12.54 mm和6.87 mm，處理組的病斑直徑僅為對照組的54.8%。

圖1 BABA對草莓果實灰霉病發病率（A）和病斑直徑（B）的影響Fig. 1 Effect of BABA on disease incidence (A) and lesion diameter (B)of gray mold in strawberry fruits

2.2 BABA對病原菌灰葡萄孢霉孢子質膜完整性的影響

圖2 BABA對灰葡萄孢霉孢子質膜完整性的影響Fig. 2 Effect of BABA on plasma membrane integrity of B. cinerea spores

從圖2可以看出，對照組的灰葡萄孢霉孢子在培養過程中，質膜完整性基本沒有變化，而在含有BABA的PDB培養基中，病原菌孢子的質膜完整性在培養2 h內略有下降，隨后處理組的孢子質膜完整性急劇下降。這說明20 mmol/L的BABA處理破壞了灰葡萄孢霉孢子的質膜完整性。

2.3 BABA對病原菌灰葡萄孢霉孢子內可溶性蛋白質和可溶性糖泄漏的影響

從圖3可以看出，隨著培養時間的延長量，病原菌孢子中的可溶性蛋白質和可溶性糖的泄露在培養期間呈現上升的趨勢。在整個培養過程中，BABA處理組中的可溶性蛋白質和可溶性糖的泄露量都顯著高于對照組（P＜0.05）。培養6 h后，處理組和對照組中可溶性蛋白質含量分別為0.40、0.19 mg/g，處理組是對照組的2.1 倍；處理組和對照組中可溶性糖含量分別為1.95、0.90 mg/g，處理組是對照組的2.2 倍。這說明BABA處理促進了灰葡萄孢霉孢子內蛋白質和糖的泄露。

圖3 BABA對灰葡萄孢霉孢子內可溶性蛋白質（A）和可溶性糖（B）泄漏的影響Fig. 3 Effect of BABA on protein (A) and sugar (B) leakage from B. cinerea spores

2.4 BABA對草莓果實CHI和GLU活力的影響

圖4 BABA對草莓果實CHI（A）和GLU（B）活力的影響Fig. 4 Effect of BABA on CHI (A) and GLU (B) activities in strawberry fruits

如圖4所示，在低溫貯藏過程中，對照組草莓果實CHI的活力呈逐漸上升趨勢，處理組果實在貯藏的前8 d逐漸上升并達到最大值，隨后略有下降，貯藏結束時，處理組和對照組CHI活力分別為20.2、18.5 U/mg pro，處理組比對照組活力高9.2%；處理組的GLU活力在貯藏期間呈上升趨勢，而對照組的GLU活力在貯藏的第8天達到最大值后下降，貯藏結束時，處理組和對照組GLU活力分別為10.6、6.8 U/mg pro，處理組比對照組的高55.9%。整個貯藏過程，處理組的CHI和GLU活力都顯著高于對照組（P＜0.05），說明BABA處理能夠提高草莓果實中CHI和GLU的活力。

2.5 BABA對草莓果實PG和Cel活力的影響

圖5 BABA對草莓果實PG（A）和Cel（B）活力的影響Fig. 5 Effect of BABA on PG (A) and Cel (B) activities in strawberry fruits

從圖5可以看出，草莓果實的PG和Cel活力在貯藏期間逐漸上升，BABA處理可以抑制酶活力的升高。在整個貯藏期間，處理組果實的PG活力均顯著低于對照組（P＜0.05），貯藏結束時（12 d），處理組和對照組的PG活力分別為1.45、2.05 U/mg pro，處理組的PG活力僅為對照組的70.7%；處理組果實Cel活力從貯藏的第8天開始顯著低于對照組（P＜0.05），貯藏結束時（12 d），處理組和對照組的Cel活力分別為65.6、86.8 U/mg pro，處理組的Cel活力僅為對照組的75.6%。這說明BABA處理能夠延緩草莓果實的軟化。

2.6 BABA對草莓果實抗病相關基因表達的影響

圖6 BABA對草莓果實抗性相關基因表達的影響Fig. 6 Effect of BABA on the expression of defense-related genes in strawberry fruits

從圖6可以看出，貯藏第4天時，對照組果實的FaCHI和FaGLU基因表達量略有升高，而處理組果實的FaCHI和FaGLU基因表達量急劇升高，并維持在較高的水平；對照組草莓果實FaPG和FaCel基因的表達量隨著貯藏時間的延長逐漸增加隨后下降，而整個貯藏過程中，處理組果實的FaPG和FaCel基因表達量總體均低于對照組。這說明BABA處理抑制了FaPG和FaCel基因的表達。

3 討 論

誘導抗病性是植物在長期進化過程中形成的一種重要的抗病機制。采用各種物理、化學或者生物激發子處理提高果蔬的抗病性被認為是減少病害侵染的有效方式[19]。BABA作為一種新型的化學激發子，被認為是調節植物誘導抗性中的重要信號分子，參與了眾多抗病反應的過程[20]。在本研究中，BABA處理顯著抑制了草莓果實采后灰霉病的發病率（貯藏前期）和病斑直徑的擴展，實驗結果說明，BABA處理提高了草莓果實的抗病性，減輕了草莓采后灰霉病的發生。

激發子對病原菌的直接抑制作用有助于減輕病原菌對水果的侵染[21]。離體實驗證明，BABA破壞了灰葡萄孢霉孢子的質膜完整性，造成孢子內部可溶性蛋白質和可溶性糖的泄漏。Wang Lei等[22]研究結果表明，蠟樣芽孢桿菌在體外實驗中抑制了青霉孢子的生長，減輕了甜櫻桃果實的采后病害。此外，茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）也通過抑制某些采后致病真菌離體條件下的生長，提高了抗病性[23-24]。這些結果說明，直接抑制灰葡萄孢霉孢子的生長是BABA能夠抑制草莓采后灰霉病發生的原因之一。

水果采后抗病性的提高與PR的含量密切相關[25]。GHI和GLU是2 種重要的PR蛋白，在植物體中這2 種酶能夠水解真菌細胞壁中的幾丁質和葡聚糖從而破壞病原菌細胞的結構，抵抗真菌侵染[26]。Wang Kaituo等[27]的研究結果證實，楊梅果實經過熱空氣處理3 h后，果實中GHI和GLU活性顯著提高，降低了果實的自然腐爛率和青霉病的發生。葡萄果實采后經過MeJA處理誘導提高了果實中CHI和GLU的活性和相關基因的表達，增強了果實對灰霉病的抗性[18]。在本研究中，BABA處理組果實中的CHI、GLU的活性和FaCHI、FaGLU基因的表達在低溫貯藏過程中都顯著高于對照組（P＜0.05），果實的發病率和病斑直徑也都顯著小于對照果實（P＜0.05），這說明BABA處理可以通過誘導草莓果實抗病相關酶活性的提高和增強相關基因表達來抑制灰霉病的發生和發展。

水果的軟化是水果成熟和貯藏過程中的正常現象，是一個不可逆的過程，包括眾多分子、生化和生理等方面的變化，水果軟化與果實的抗病性密切相關[28]。果實的軟化主要是由細胞壁的降解造成，這些變化與水果中細胞壁降解酶有關，PG和Cel在果膠的降解中起著重要的作用。PG水解多聚半乳糖醛酸，使細胞壁分解，Cel水解細胞壁中的纖維素和半纖維素，最終影響果實內部的結構，導致果實軟化[29]。Cantu等[30]的研究發現，抑制番茄果實的軟化能夠降低番茄果實對灰霉病的敏感性。Wang Lei等[24]的研究也發現，MeJA熏蒸抑制了甜櫻桃果實PG活力的升高，下調了與軟化相關基因的表達，提高了其抗病性。本研究中，BABA處理抑制了PG、Cel活性的升高和FaPG、FaCel基因的表達，提高了果實的抗病性，這說明BABA處理可以通過延緩草莓果實的軟化來提高其抗病性。

綜上所述，20 mmol/L的BABA處理能夠顯著降低低溫貯藏過程中草莓果實采后灰霉病的發病率和病斑直徑。BABA通過破壞灰葡萄孢霉孢子的質膜完整性、誘導抗病相關酶活性升高和相關基因的表達以及延緩草莓果實的軟化共同促進了果實抗病性的提高，減輕了草莓果實腐爛的發生。

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Inhibitory Effect and Mechanisms of β-Aminobutyric Acid on Grey Mold (Botrytis cinerea) in Strawberry Fruits during Low Temperature Storage

WANG Lei1, LI Hua1, ZHANG Hua1, WANG Hui1, JIN Peng2, ZHAO Yan1, ZHENG Yonghua2,*

(1. College of Agriculture, Liaocheng University, Liaocheng 252000, China;2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The inhibitory effects of β-aminobutyric acid (BABA) on gray mold decay caused by Botrytis cinerea in harvested strawberry fruits stored at (5 ± 1) ℃ and the possible mechanisms were investigated. The strawberry fruits were pretreated with 20 mmol/L BABA, inoculated with the spores of Botrytis cinerea, and then stored at (5 ± 1) ℃ for 12 days. The results showed that the fruits treated with BABA had significantly lower disease incidence and smaller lesion diameters than the control fruits. The fruits treated with BABA showed 9.2% higher activity of chitinase (CHI) and 54.9% higher activity of β-1,3-glucanase (GLU) than the control fruits at the end of storage. BABA-treated fruits showed 29.3% lower activity of polygalacturonase (PG) and 24.4% lower activity of cellulose (Cel) than the control fruits. BABA treatment upregulated the expression of FaCHI and FaGLU and downregulated the expression of FaPG and FaCel. Moreover, BABA damaged the plasma membrane integrity of B. cinerea spores and caused the leakage of protein and sugar from the pathogen mycelia in vitro.The results indicated that BABA could effectively inhibit gray mold decay in strawberry fruits, which may be related to increased defense-related enzyme activities in fruits, suppressed PG and Cel activities and direct fungitoxic property against the pathogen.

strawberry; β-aminobutyric acid; Botrytis cinerea; induced resistance; gene expression; plasma membrane integrity

10.7506/spkx1002-6630-201721043

TS255.3

A

1002-6630（2017）21-0272-07

王雷, 李華, 張華, 等. β-氨基丁酸抑制草莓低溫貯藏過程中灰霉病的效果及其機理[J]. 食品科學, 2017, 38(21): 272-278.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721043. http://www.spkx.net.cn

2016-12-21

公益性行業（農業）科研專項（201303073）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31601521）；山東省高等學校科技計劃項目（J16LF61）；聊城大學博士啟動基金項目（318051535）；聊城大學大學生科技文化創新基金項目（26312168812）

王雷（1981—），男，講師，博士，研究方向為果蔬采后生理與貯藏保鮮。E-mail：freshair928@163.com

*通信作者：鄭永華（1963—），男，教授，博士，研究方向為果蔬采后生理與貯藏保鮮。E-mail：zhengyh@njau.edu.cn

WANG Lei, LI Hua, ZHANG Hua, et al. Inhibitory effect and mechanisms of β-aminobutyric acid on grey mold (Botrytis cinerea) in strawberry fruits during low temperature storage[J]. Food Science, 2017, 38(21): 272-278. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201721043. http://www.spkx.net.cn