刺參體壁及羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白特性的對比研究

張正雨，李傲婷，王鳳林，李委昆，唐 越，于翠平，孫 娜，吳海濤*

（大連工業大學食品學院，國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116034）

刺參體壁及羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白特性的對比研究

張正雨，李傲婷，王鳳林，李委昆，唐 越，于翠平，孫 娜，吳海濤*

（大連工業大學食品學院，國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116034）

本實驗對刺參體壁酶促溶性膠原蛋白（pepsin soluble collagen from Stichopus japonicus，sjPSC）和羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白（pepsin soluble collagen from Oreochromis niloticus，onPSC）的理化特性進行對比研究。結果表明，兩種膠原蛋白的紫外與傅里葉變換紅外光譜分析結果都較為相似。由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜可知，兩種膠原蛋白均以α-和β-鏈為主，在非還原和還原條件下，二者的電泳圖譜非常相似，這表明蛋白中沒有二硫鍵被還原。甘氨酸是sjPSC和onPSC中主要氨基酸，其中每1 000 個氨基酸殘基中分別含有（344.57±2.16）、（353.00±4.84） 個甘氨酸殘基。相比較而言，sjPSC中谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸含量較高，onPSC中L-羥脯氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸含量較高。在V8酶和α-糜蛋白酶作用下，sjPSC和onPSC的肽譜分析表明二者的結構有一定區別，尤其是谷氨酸、天冬氨酸及羥脯氨酸殘基。

酶溶性膠原蛋白；刺參；羅非魚；氨基酸；結構

刺參作為重要的海珍品，兼具營養價值和保健功能。而刺參體壁是其主要可食部位，膠原蛋白含量尤為豐富[1]。近年來，魚皮已成為工業生產中膠原蛋白的主要來源，常用于制作膠卷底片、香腸腸衣等，也常被用作食品添加劑[2]。羅非魚是僅次于草魚的養殖魚類，魚皮常被當作漁業加工生產中的副產物，是膠原蛋白的潛在來源，其膠原蛋白水解產物具有抗氧化、抗衰老的功效[3-4]。Matsumura[5]指出海參膠原蛋白與脊椎動物膠原蛋白相比，具有顯著的難溶性，但對其理化性質和亞基組成研究較少。刺參體壁經尿素及十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液處理，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分析得到其溶出的蛋白質組分主要為非膠原蛋白質；而以相同的溶液提取羅非魚皮蛋白質組分，經電泳分析可獲得清晰的膠原蛋白條帶[6]。因此，與羅非魚皮膠原蛋白相比，刺參體壁中的膠原蛋白具有極端的不溶解性，對其膠原蛋白分子的特性進行系統研究十分必要，可為實際生產應用提供理論支撐。

目前，關于水產動物膠原蛋白的理化特性研究報道較多，其中郝淑賢等[7]研究了熱水法、酸法及超聲波輔助酶法提取對羅非魚皮膠原蛋白理化特性的影響，3 種提取方法對羥脯氨酸和脯氨酸含量影響差異不顯著，對變性溫度影響差異也不顯著，但熱水提取可顯著提高魚皮膠原蛋白的凝膠強度，酸法提取可顯著提高魚皮膠原蛋白的特性黏度。Zhu Beiwei等[8]研究了刺參體壁酶促溶性膠原蛋白理化性質及其自由基清除能力，胃蛋白酶提取的膠原蛋白具有完整的三螺旋結構，并且具有很強的自由基清除能力。侯虎等[9]分析刺參體壁膠原纖維，并采用胃蛋白酶促溶法提取海參膠原蛋白，發現刺參體壁主要為紅色的膠原纖維，呈網狀排列，少見肌原纖維，提取的膠原蛋白符合水產膠原蛋白特征。雖然國內外對羅非魚皮膠原蛋白及刺參體壁膠原蛋白的研究較多，但對它們分子特性的比較研究較少。因此，本實驗通過紫外光譜、傅里葉變換紅外光譜、SDS-PAGE、肽譜及氨基酸組成分析，從分子結構上對刺參體壁和魚皮膠原蛋白進行全面的分析與比較，為開發利用刺參膠原制備生物材料和膠原肽提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮刺參（Stichopus japonicus）購于大連乾日海洋食品有限公司，放置于冰盒內運輸1 h抵達實驗室。羅非魚購于大連百洋食代食品有限公司。

SDS、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、考馬斯亮藍R-250、牛血清白蛋白 上海生工生物工程有限公司；V8酶、賴氨酰基肽鏈內切酶、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

EMS-4B型磁力攪拌器 汕頭市粵威事業有限公司；BS224S電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；Scientz-Ⅲ型數控層析冷柜 寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-2100型紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；PHS-3C精密pH計 上海雷磁電子儀器廠；2KBTES-55型真空冷凍干燥機 美國Virtis公司；低溫保存箱 海爾集團；超低溫冰箱（-80 ℃）日本三洋公司；TS.B-108往復式脫色搖床 江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；MF-ChemiBIS 2.0凝膠成像儀 以色列DNR成像系統有限公司；LAMBDA 35紫外-可見光譜儀、傅里葉變換紅外光譜儀 美國珀金埃爾默公司；AE-6450垂直電泳儀 日本ATTO株式會社；CF 16XⅡ冷凍離心機 日本日立公司；HH- 4數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇榮華儀器制造有限公司；P1201高效液相色譜儀 大連依利特分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 膠原蛋白的提取

1.3.1.1 刺參體壁酶促溶性膠原蛋白的提取

參照Zhu Beiwei等[8]的方法對刺參體壁酶促溶性膠原蛋白（pepsin soluble collagen from Stichopus japonicus，sjPSC）進行提取。以下操作除特殊注明外，均在4 ℃條件下進行。先將冷凍刺參體壁打碎，通過13 600×g離心水洗10 min，向所得沉淀中加入0.1 mol/L的Tris-HCl（pH 8.0，含5 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、0.5 mol/L NaCl）緩沖液攪拌過夜；再將13 680×g離心10 min后所得沉淀水洗2～3 次至中性，加去離子水攪拌提取72 h，經9 500×g離心5 min，得到的上層清液中含有粗膠原纖維；向下層沉淀中加入去離子水重復提取一次，并將兩次提取的上清液合并；經0.1 mol/L NaOH洗滌72 h（溶液每12 h換一次）后再反復水洗至中性，經17 300×g離心30 min，取沉淀經冷凍干燥得到膠原粗纖維。將所得膠原纖維溶于500 倍體積（m/V）0.5 mol/L乙酸溶液中，并加入胃蛋白酶，攪拌72 h；17 300×g離心20 min，向上清液中加入NaCl靜置過夜；經13 500 r/min離心5 min所得沉淀溶于少量0.5 mol/L乙酸中，分別采用0.02 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4（pH 8.0）和0.1 mol/L乙酸透析液透析48 h（透析液每24 h換一次），最后將13 500 r/min離心20 min所得沉淀經冷凍干燥得到sjPSC。

1.3.1.2 魚皮酶促溶性膠原蛋白的提取

參照Kittiphattanabawon等[10]的方法提取魚皮酶促溶性膠原蛋白（pepsin soluble collagen from Oreochromis niloticus，onPSC）。新鮮羅非魚皮用冷水清洗干凈，于-80 ℃冷凍備用。以下所有提取操作除特殊注明外，均在4 ℃條件下進行。取預處理后的魚皮加入0.1 mol/L NaOH攪拌24 h（溶液每8 h換一次），過濾所得沉淀用去離子水反復清洗至中性后，加入0.5mol/L乙酸溶液攪拌溶脹，攪拌24 h（溶液每12 h換一次），過濾所得沉淀加入4 倍體積（m/V）0.5 mol/L乙酸溶液，并加入胃蛋白酶攪拌48 h，過濾，向上清液中加入胃蛋白酶，過濾，向上清液中加入Tris至終濃度為0.05 mol/L、NaCl 2.5 mol/L（緩沖液體系pH值為3.7），攪拌20 min后靜置過夜鹽析。將過濾所得沉淀溶于少量0.5 mol/L乙酸中，采用0.1 mol/L乙酸透析72 h后，再采用蒸餾水透析，直到AgNO3檢測無白色沉淀時為止，凍干即為onPSC。

1.3.2 SDS-PAGE分析

[11]的方法，將膠原蛋白溶于250 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5、8 mol/L尿素、5% SDS、5% β-巰基乙醇）中，配制質量濃度為2 mg/mL，煮沸3 min。SDS-PAGE條件為：5%濃縮膠、8%分離膠，電泳時濃縮膠電流8 mA，分離膠電流15 mA，SDS-PAGE緩沖液采用SDS-Tris-甘氨酸體系。非還原條件下，上樣緩沖液中不含強還原劑β-巰基乙醇。樣品電泳完畢后，進行考馬斯亮藍R-250染色，脫色后采用凝膠成像儀進行成像。

1.3.3 紫外光譜分析

在室溫條件下，將膠原蛋白樣品溶于0.5 mol/L HAc溶液中配成1.0 mg/mL的膠原蛋白溶液，以0.5 mol/L HAc溶液作為空白對照，使用紫外-可見光譜儀測定其紫外吸光度，波長范圍為200～800 nm。

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜分析

稱取一定量樣品，經過KBr壓片，使用傅里葉變換紅外光譜儀對樣品進行掃描，范圍為400～4 000 cm-1。掃描信號累加32 次，儀器分辨率為0.5 cm-1。

1.3.5 氨基酸組成分析

采用高效液相色譜進行氨基酸分析，準確稱取25 mg樣品于安瓿瓶當中，準確加入3 mL鹽酸（6 mol/L）。利用酒精噴燈封口后，放入110 ℃烘箱中恒溫水解24 h。將水解液在80 ℃條件下水浴蒸干，加衍生緩沖液定容，過濾取5 mL進行衍生化反應。加平衡緩沖液稀釋至試劑瓶刻度，靜置。取10 μL進樣，利用氨基酸分析柱進行高效液相色譜分析。

1.3.6 肽譜分析

肽譜分析參照Saito[1]、Liu Wentao[12]等的方法進行修改。取膠原蛋白樣品2 mg溶于1mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2，含0.5 g/100 mL SDS）。取100 μL溶液轉移到1.5 mL離心管中備用，為啟動反應，取10 μL含5 μg V8酶或0.1 mg賴氨酰基肽鏈內切酶的酶液（溶于0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.2），或10 μL含5 μg胰蛋白酶或α-糜蛋白酶的酶液（溶于1 mol/L HCl、20 mmol/L CaCl2溶液，pH3.0），混合液分別于37 ℃孵育5、25、60、120 min。添加5×電泳上樣緩沖液（250 mmol/L Tris-HCl、8 mol/L尿素、5% SDS、體積分數5% β-巰基乙醇，pH 7.5），沸水浴3 min終止反應。采用SDS-PAGE分析所得到的樣品。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 sjPSC和onPSC的SDS-PAGE對比分析

圖1 非還原及還原條件下sjPSC和onPSC的電泳圖譜分析Fig. 1 SDS-PAGE patterns of sjPSC and onPSC under non-reducing and reducing conditions

由圖1可知，本研究所提取的sjPSC和onPSC純度較高，不含雜蛋白，主要含有β-鏈及α-鏈及少量γ-鏈，onPSC中各組分在SDS-PAGE中的遷移速率均大于sjPSC。在還原條件下，β-巰基乙醇會還原蛋白分子中的二硫鍵，從圖譜中可以看出，在非還原及還原條件下的兩種膠原蛋白條帶非常相似，并沒有二硫鍵遭到破壞，這表明了兩種膠原蛋白中不含二硫鍵，從而說明其氨基酸組成中不含與二硫鍵密切相關的半胱氨酸[13-16]。本研究結果與前期報道的其他魚皮膠原蛋白特性相一致，如大眼鯛[17]、紅鯛魚[18]、斑點叉尾鮰[19]、多須石首魚和羊頭鯛[20]，都具有膠原蛋白的典型特征。

2.2 sjPSC和onPSC的紫外光譜對比分析

一般具有共軛雙鍵的物質都具有紫外吸收功能，因此蛋白分子在溶液中能夠吸收一定波長范圍的紫外光，產生紫外吸收光譜[21]。由圖2可知，sjPSC和onPSC具有相似的紫外吸收譜，其特征吸收波長均位于233 nm左右，這是膠原蛋白三螺旋結構的特征吸收峰，主要是由肽鍵—C＝O的n→π*躍遷所貢獻，符合酶促溶性膠原蛋白的特征吸收，與其他魚類膠原蛋白的研究結果一致[21-22]。色氨酸在280 nm波長處的紫外吸收最強，所以大多數蛋白質在280 nm波長處都有很強的紫外吸收，但所提膠原蛋白中幾乎不含色氨酸，所以在280 nm波長處沒有強吸收峰的出現，這可以表明所提取的膠原蛋白具有較高的純度[23]。

圖2 sjPSC和onPSC的紫外光譜Fig. 2 Ultraviolet spectra of sjPSC and onPSC

2.3 sjPSC和onPSC的傅里葉變換紅外光譜分析

圖3 sjPSC和onPSC的傅里葉變換紅外光譜分析Fig. 3 FT-IR spectra of sjPSC and onPSC

由圖3可知，sjPSC和onPSC的傅里葉變換紅外譜圖極為相似，均具有PSC的特征吸收峰，包括酰胺A帶、酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶。其中，酰胺A帶與PSC的N—H伸縮振動有關，酰胺A帶的吸收峰在3 400～3 440 cm-1處，而當含N—H基團的肽段參與氫鍵形成時，N—H基團的伸縮振動產生的吸收峰會降低100 cm-1左右，由圖3可知，兩種膠原蛋白均在3 330 cm-1左右有吸收峰出現，說明兩種膠原蛋白分子均有氫鍵存在[17]。在蛋白質分子中，氨基酸之間含有大量肽鍵，由于羰基鍵的伸縮振動，會出現酰胺Ⅰ帶（1 600～1 700 cm-1）吸收峰，常被用來鑒定和分析蛋白質的二級結構[8]。如圖3所示，兩種膠原蛋白均在1 660 cm-1附近出現的吸收峰，與酰胺Ⅰ帶的出峰位置一致，證明膠原蛋白分子處于交聯狀態。在已知的膠原蛋白分子中，膠原蛋白酰胺Ⅱ帶的吸收峰通常位于1 500～1 600 cm-1范圍內，兩種膠原蛋白均在1 550 cm-1附近出現吸收峰，這說明該吸收區為酰胺Ⅱ帶，同酰胺Ⅰ帶一樣，酰胺Ⅱ帶也是由α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲疊加共同作用所產生的[24]。酰胺Ⅲ帶的吸收峰通常位于1 200～1 300 cm-1，兩種膠原蛋白在酰胺Ⅲ帶均出現吸收峰，這表明sjPSC和onPSC均保持完整的三螺旋結構[25]。

2.4 sjPSC和onPSC的氨基酸組成對比分析

表1 sjPSC和onPSC的氨基酸組成及含量Table 1 Amino acid compositions of sjPSC and onPSC

由表1可知，膠原蛋白的特征氨基酸Gly含量在sjPSC和onPSC均最多，分別為（344.57±2.16）‰、（353.00±4.84）‰，大約占總氨基酸含量的1/3。sjPSC和onPSC的Arg（（49.65±3.46）‰、（53.05±0.69）‰）、Thr（（30.99±4.72）‰、（25.07±0.38）‰）、Ala（（93.33±8.88）‰、（111.18±15.91）‰)含量以及少量的Met（（6.46±1.10）‰、（7.02±3.59）‰）含量較為相近（P＞0.05）。相比較而言，sjPSC中Glu、Asp、Ser、Val、Ile以及Tyr含量較高，而onPSC中Hyp、Pro、Leu、Phe、His及Lys含量較高。其中sjPSC中的酸性氨基酸Glu、Asp含量較多，而堿性氨基酸His、Lys及Arg含量較少，這與文獻[7-8]中報道sjPSC的等電點為4.14，onPSC的等電點為6.8相符。sjPSC中Hyp及Pro的總含量為167‰，這與Saito[1]及Cui Fengxia[26]等的報道相似。onPSC中Hyp及Pro的總含量高于sjPSC，為198‰，這與大部分魚類膠原蛋白相似[27]。有相關報道指出，onPSC的熱變性溫度為31 ℃，而sjPSC的熱變性溫度為22.3 ℃[7,9]，這可能與兩種膠原蛋白的Hyp及Pro的總含量有關。

2.5 sjPSC和onPSC的肽譜對比分析

由圖4A可知，在V8酶作用下，sjPSC和onPSC隨著酶解時間的延長呈現逐漸降解的趨勢。V8酶作用于sjPSC達到5 min時，γ-和β-鏈消失，α-鏈逐漸降解成了小分子片段，分子質量依次為90.5、76.3、47.9 kD。V8酶作用于onPSC達到25 min時，β-和α-鏈僅有部分降解為小分子片段，分子質量依次為97.7、68.1、66.4、59.1、46.1、42.8、39.9 kD。這與Mizuta等[28]的報道相一致，不同來源和種屬的膠原蛋白，其肽指紋圖譜是不同的。由此推斷，與onPSC相比，sjPSC對V8酶更為敏感，這與其含有更多的谷氨酸和天冬氨酸有關，V8酶為絲氨酸蛋白酶，其催化作用位點恰為含有谷氨酸和天冬氨酸的殘基[29]。

由圖4B、C可知，在賴氨酰基肽鏈內切酶及胰蛋白酶作用下，隨著酶解時間的延長，sjPSC和onPSC都有一定程度的降解。當賴氨酰基肽鏈內切酶及胰蛋白酶作用時間分別達到60、5 min時，β-鏈消失，α-鏈降解成了分子質量小于116 kD的小分子片段。在胰蛋白酶的作用下，onPSC比sjPSC出現了更多的小分子片段，這表明onPSC對胰蛋白酶更為敏感。胰蛋白酶主要水解C末端含有賴氨酸和精氨酸的氨基酸殘基[26]，這也說明onPSC中含有更多的賴氨酸和精氨酸。

由圖4D可見，當α-糜蛋白酶作用于sjPSC和onPSC達到5 min時，γ-和β-鏈消失，α-鏈降解成了小分子片段，在sjPSC中分子質量依次為116.7、98.0、69.8 kD，在onPSC中分子質量依次為113.0、106.8、94.7、77.2、69.7、63.8、57.8、47.6、36.6 kD。onPSC中有更多的小分子片段，表明onPSC對α-糜蛋白酶更為敏感，這與其含有較多的疏水性氨基酸殘基有關，因為α-糜蛋白酶特異水解C端含有疏水性氨基酸的殘基，如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和亮氨酸殘基[30]，所以α-糜蛋白酶可以用于sjPSC和onPSC的鑒別。

圖4 sjPSC和onPSC肽譜分析Fig. 4 Peptide maps of sjPSC and onPSC

3 結 論

對sjPSC和onPSC進行對比研究表明，二者具有相似的紫外、傅里葉變換紅外光譜，SDS-PAGE顯示二者均以α-鏈和β-鏈為主要成分且不含二硫鍵，氨基酸分析結果也表明二者均具有膠原蛋白的典型特征。對刺參體壁及魚皮酶促溶性膠原蛋白的肽譜分析表明，采用V8酶和α-糜蛋白酶進行酶解，二者呈現完全不同的圖譜，可以有效區分二者，尤其是谷氨酸、精氨酸和羥脯氨酸殘基的含量不同。

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Comparative Studies on Characteristics of Pepsin-Soluble Collagen from Sea Cucumber (Stichopus japonicas)Body Wall and Tilapia (Oreochromis niloticus) Skin

ZHANG Zhengyu, LI Aoting, WANG Fenglin, LI Weikun, TANG Yue, YU Cuiping, SUN Na, WU Haitao*
(National Engineering Research Center of Seafood, School of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China)

In this paper, the characteristics of pepsin-soluble collagen from the body wall of Stichopus japonicus (sjPSC)and the skin of Oreochromis niloticus (onPSC) were comparatively studied. The results showed that ultraviolet and Fourier transform-infrared spectroscopic measurements of onPSC and sjPSC were quite similar. Both PSCs contained mainly α- and β-chains as indicated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The electrophoretic patterns of these two collagens under non-reducing and reducing conditions were quite similar, suggesting that reduction of disulfide bonds did not occur in these two collagens. Glycine was the dominant amino acid in both sjPSC and onPSC, accounting for approximately (344.57 ± 2.16)‰ and (353.00 ± 4.84)‰ of the total amino acid residues, respectively. More glutamic acid, aspartic acid, serine, valine, isoleucine and tyrosine were observed in sjPSC when compared with onPSC (P 〈 0.05).However, more L-hydroxy proline, L-proline, leucine, phenylalanine, histidine and lysine were observed in onPSC (P 〈 0.05).Peptide maps of both PSCs digested by V8 and α-chymotrypsin were completely different, suggesting some differences in their structure, especially in terms of glutamic acid, aspartic acid and hydroxyproline residues.

pepsin-soluble collagen; Stichopus japonicus; Oreochromis niloticus; amino acid; structure

10.7506/spkx1002-6630-201721009

TS254.1

A

1002-6630（2017）21-0055-06

張正雨, 李傲婷, 王鳳林, 等. 刺參體壁及羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白特性的對比研究[J]. 食品科學, 2017, 38(21):55-60.

10.7506/spkx1002-6630-201721009. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Zhengyu, LI Aoting, WANG Fenglin, et al. Comparative studies on characteristics of pepsin-soluble collagen from sea cucumber (Stichopus japonicas) body wall and tilapia (Oreochromis niloticus) skin[J]. Food Science, 2017, 38(21):55-60. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721009. http://www.spkx.net.cn

2016-07-15

國家自然科學基金面上項目（31370037）；遼寧省教育廳科學研究一般項目（L2015050）

張正雨（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：540773720@qq.com

*通信作者：吳海濤（1980—），女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：wht205@163.com