氣體沿面放電低溫等離子體對擴展青霉孢子殺滅效果

潘春青，岳田利，王鐵成，王 媛，袁亞宏,*，李雨娟

（1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.西北農林科技大學資源環境學院，陜西 楊凌 712100）

氣體沿面放電低溫等離子體對擴展青霉孢子殺滅效果

潘春青1，岳田利1，王鐵成2，王 媛1，袁亞宏1,*，李雨娟2

（1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.西北農林科技大學資源環境學院，陜西 楊凌 712100）

目的：研究氣體沿面放電低溫等離子體對擴展青霉孢子的殺菌效果。方法：以擴展青霉標準菌株CICC 40658和擴展青霉分離菌株F-LPH10-06為目標菌株，探討2 株菌在馬鈴薯葡萄糖液體培養基中的生長和產毒特性；應用自制的氣體沿面放電低溫等離子體殺菌設備，探討處理時間、電源電壓及孢子不同初始濃度對殺菌效果的影響；并應用掃描電子顯微鏡對孢子形態變化進行觀察。結果：擴展青霉CICC 40658和F-LPH10-06培養14 d后的菌體干質量分別為28.6 mg和128.7 mg，展青霉素含量分別為912.40 μg/L和147.97 mg/L，F-LPH10-06產毒量幾乎是CICC 40658產毒量的162 倍。氣體沿面放電低溫等離子體21 min能全部殺死樣品中CICC 40658孢子（初始濃度為3.4×106個/mL）；處理30 min，能使樣品中F-LPH10-06孢子（初始濃度為1.5×106個/mL）減少4.58 lg（個/mL）。在相同的處理時間下，隨著電源電壓升高和初始孢子濃度降低，殺菌效果逐漸提高。掃描電子顯微鏡結果表明，孢子表面形態經過放電處理后被改變，這可能與放電過程中產生的高能電子和活性氧有關。結論：氣體沿面放電低溫等離子體對擴展青霉孢子有一定殺滅作用，這為低溫殺菌技術的發展和應用提供了理論依據。

低溫等離子體；氣體沿面放電；擴展青霉；殺菌效果；展青霉素

展青霉（毒）素（patulin）又稱棒曲霉（毒）素、珊瑚青霉素，是由曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）和絲衣霉屬（Byssochlamys）等多種真菌代謝產生的一種具有神經毒性的次級代謝產物[1-2]。展青霉素對動物組織和細胞具有很強的毒性，小鼠經皮下注射展青霉素會引起腎淤血、肺水腫、呼吸困難、腹腔和胸腔積液、組織壞死等癥狀。人體攝入過量的展青霉素會引發腸炎、痙攣、潰瘍、抽搐、呼吸困難、癌變等一系列的急性和慢性病癥[3]。

在食品生產中普遍存在展青霉素污染的問題。大量研究表明，蘋果、梨、獼猴桃等水果在收獲、貯藏及加工過程中均有可能受到展青霉素產生菌的污染[4-7]。Zhu Yan等[8]在草酸對獼猴桃貯藏過程中對擴展青霉抑制作用的研究中表明，獼猴桃在貯藏過程中易感染霉菌而患貯積病，尤其是表面有破損的果實極易被青霉菌污染[9-10]。在所有水果中，蘋果及其制品受展青霉素的污染最為嚴重。病原微生物主要通過破損的組織或傷口進入果實內部，在適宜的條件下，病原微生物迅速繁殖，引起水果腐爛和病變。有研究表明，在干酪和谷物產品[11]如小麥、大麥、谷物根部、飼料[12]中也可檢測出展青霉素。鑒于展青霉素對人體的危害，世界各國相繼制定了食品中展青霉素的限量標準。GB 14974—2003《蘋果和山楂制品中展青霉素限量》中明確規定了蘋果、山楂制品中展青霉素的最大容許量不得超過50 μg/L[13]，歐盟第455/2004指令規定，果汁、果酒及其果肉發酵制品中展青霉素質量濃度小于50 μg/L，可使用蘋果及固體產品中展青霉素限量為25 μg/L，兒童食用蘋果汁和嬰幼兒食品中展青霉素限量則更低，毒素質量濃度要小于10 μg/L[14-15]。目前，對食品中展青霉素的控制主要集中在兩個方面，一方面是在加工過程中通過原料挑選、清洗、吸附、輻射、過濾、微波及紫外處理去除食品中的展青霉素[16-19]；另一方面是通過各種物理、化學、生物方法殺滅各種展青霉素產生菌，從源頭上控制展青霉素的產生?；瘜W滅菌法主要是利用有機化學試劑進行殺菌，殺菌效果好、使用方便、設備投資少，但是長期使用會增加微生物的抗藥性，同時毒性大、有腐蝕性，會對環境造成污染。生物滅菌法由于成本較高、技術掌握困難，目前處于理論研究階段[20]。常用的滅菌方法是物理滅菌法，包括加熱滅菌法和低溫滅菌法。加熱滅菌法是比較傳統的滅菌方法，但殺菌的同時也會對食品的品質和營養價值造成一定的破壞。低溫等離子體滅菌法作為一種新型的低溫滅菌方法，具有很高的研究價值。

低溫等離子體是氣體介質在高壓放電條件下所激發出的離子，是區別于液態、固態、氣態所存在的物質的第4種狀態[20]。低溫等離子體滅菌技術作為一種新型的低溫滅菌方法在污水治理[21]、空氣凈化[22]、醫療器械消毒[23]、材料表面改性等方面有廣泛的應用，但在食品領域應用較少。低溫等離子體的滅菌機理主要是利用在放電過程中產生的帶電粒子的物理破壞作用[24-25]、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）的氧化作用[26]以及紫外光的輻射作用[27-28]。低溫等離子體技術作為一種安全、快速、低溫、環保的滅菌方法具有廣闊的應用前景。

本研究以2 株擴展青霉CICC 40658和F-LPH10-06作為目標菌株，探討了2 株菌產生展青霉素的產毒特性，以氣體沿面放電低溫等離子體對其進行處理，初步研究了處理時間、電源電壓及孢子不同初始濃度對滅菌效果的影響，并通過掃描電子顯微鏡初探氣體沿面放電低溫等離子體的滅菌機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：擴展青霉（Penicillium expansum）CICC 40658購自中國工業微生物菌種保藏管理中心；擴展青霉（P. expansum）F-LPH10-06由西北農林科技大學食品科學與工程學院發酵動力學實驗室提供。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯汁1 000 mL、葡萄糖20.0 g、瓊脂20 g，pH值自然，121 ℃滅菌20 min。其中馬鈴薯汁的制備方法為馬鈴薯去皮，挖芽眼，洗凈，切片，稱取200 g放入1 000 mL蒸餾水中用文火煮沸10～20 min，雙層紗布過濾，濾液加水補至1 000 mL。馬鈴薯葡萄糖液體培養基（potato dextrose broth，PDB）：PDA培養基不加瓊脂。

葡萄糖 西隴化工股份有限公司；瓊脂粉 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

TDS2012示波器 美國Tektronix公司；LC-2010A高效液相色譜儀 日本島津公司；HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；CX31顯微鏡 日本奧林巴斯公司；BCN-1360B生物潔凈工作臺哈爾濱東聯電子技術開發公司；ES-315高壓蒸汽滅菌器日本Tomy公司；MP-160B霉菌培養箱 上海福瑪實驗設備有限公司；S-4800場發射掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

圖1 放電等離子體反應系統示意圖Fig. 1 Schematic diagram of discharge plasma reaction system

氣體沿面放電低溫等離子體殺菌設備（圖1），與Wang Tiecheng等[29]用氣相沿面放電等離子體降解腐殖酸實驗中所用設備相似。放電電源采用交流高壓電源發生器（頻率50 Hz，電源電壓0～40 kV，可調，由大連理工大學環境等離子體研究室提供）；反應器是一個內徑5 cm、高35 cm的有機玻璃圓桶；高壓電極由一個內徑12 mm、厚1.5 mm的石英玻璃管組成，內部連接有一根直徑1 mm的螺旋狀不銹鋼絲，放電長度為17 cm；被處理的樣品作為接地電極，氣體沿石英管放電，放電氣體介質為干燥的空氣。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將1.1節菌株接種到PDB培養基，25～28 ℃培養5 d后，劃線轉接至PDA培養基，25～28 ℃培養5 d后，轉接至PDA試管，25～28 ℃培養7 d后，用無菌水將孢子洗下，接種于裝有100 mL PDA培養基的250 mL三角瓶中，25～28 ℃培養10 d后，4 ℃冰箱保存，備用。

1.3.2 孢子懸液的制備

用無菌水洗下三角瓶中PDA表面的孢子，漩渦振蕩器振蕩后，無菌脫脂棉過濾，制備孢子懸浮液。

1.3.3 菌株生長特性研究

用血球計數板計數后，取適量孢子懸液加到滅過菌的PDB培養基中，使培養基中孢子濃度為5×105個/mL，混勻后，將菌液分裝到50 mL離心管中，每管20 mL，25 ℃靜置培養，每2 d取一次樣，每個樣品3 個平行，濾紙過濾，恒質量法（80 ℃烘干）測菌體干質量，共測14 d。

1.3.4 菌種產毒特性研究

濾紙過濾后的濾液，用于培養液中展青霉素含量的檢測。采用濾紙過濾法除去培養液中的菌體和雜質成分，依照SN/T 1859—2007《飲料中棒曲霉素和5-羥甲基糠醛的液相色譜-質譜測定方法》處理和檢測濾液中展青霉素的含量[30]。色譜條件為：Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm）、柱溫30 ℃、流動相為乙腈-水（10∶90，V/V）、流速1.0 mL/min、進樣量20 μL、檢測波長276 nm。

1.3.5 低溫等離子體處理

孢子懸液用血球計數板計數后，加入到350 mL無菌水中，使稀釋后的樣品中孢子濃度為104～106個/mL。低溫等離子體處理條件為工作頻率50 Hz、氣體流量160 L/h，放電介質為干燥的空氣，在室溫、常壓條件下進行處理。

1.3.6 滅菌效果檢測

滅菌效果用處理后存活菌數的對數值表示。孢子存活數采用平板計數法進行統計，分別取不同處理時間下1 mL樣品進行10 倍梯度稀釋，選擇合適的稀釋度，取100 μL菌懸液涂布于PDA平板上，每個稀釋度3 個平行，25～28 ℃培養48 h后進行菌落計數。

將處理前和經等離子體處理3 min的樣品經4 ℃、2 820×g離心10 min，棄去上清液，加入1 mL 4%戊二醛固定液常溫條件下固定2 h。然后用0.1 mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖液進行漂洗，5、10、15、20、25、30 min時各沖洗一次。再用1%鋨酸常溫固定2 h，再用0.1 mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖液進行漂洗，5、10、15、20、25、30 min，各沖洗一次。之后用乙醇進行梯度脫水，分別用30%、50%、70%、80%、90%乙醇各脫水一次，每次15 min，最后用100%乙醇脫水2 次，每次30 min。制片、自然晾干、噴金，在5 kV、5 000 倍掃描電子顯微鏡視野下觀察、拍照。

1.4 數據統計分析

在擴展青霉生長特性和產毒特性的測定實驗中，每次取3 個樣品進行檢測，檢測結果取其平均值。在不同因素對擴展青霉殺滅效果的影響實驗中，每個時間點取樣1 mL進行梯度稀釋，選擇3 個合適的梯度進行平板涂布，每個梯度做3 個平行。采用Origin 9.0軟件作圖，用SPSS 22.0軟件對實驗數據進行多重比較，分析顯著性。

2 結果與分析

2.1 不同菌株生長特性

圖2 2 株擴展青霉在不同培養時間的菌體干質量Fig. 2 Dry weight biomass of P. expansum after different culture time

如圖2所示，前4 d為P. expansum CICC 40658的生長適應期，在此期間，菌體生長遲緩，菌體干質量增加緩慢；從第4天開始進入快速生長時期，菌體干質量迅速增加，在第6天時達到最大值（28.6 mg），之后逐漸進入穩定期，菌體干質量達到穩定并稍有下降。P. expansum F-LPH10-06經過短暫的延滯期后迅速進入快速生長時期，從第2天到第10天均為快速生長時期，在第10天菌體干質量達到最大值（128.7 mg），之后達到穩定狀態。Taniwaki等[31]對不同體積分數CO2環境下毛霉的生長特性的研究結果也表現出相似的生長規律。從2 株菌的生長情況來看，F-LPH10-06的菌體干質量是CICC 40658菌體干質量的4.5 倍，這可能與2 株菌的種間差異有關。

2.2 不同菌株產毒特性

圖3 2 株擴展青霉在不同培養時間的展青霉素質量濃度Fig. 3 Concentrations of patulin produced by two strains of P. expansum after different culture times

由圖3可知，2 株擴展青霉菌株均為展青霉素產生菌。從產毒曲線上可以看出，2 株擴展青霉產毒量均呈遞增趨勢。不同的是，P. expansum F-LPH10-06 從第4天開始產生展青霉素，隨著培養時間的延長，產毒量逐漸增加，在第14天時達到147.97 mg/L；而CICC 40658從第6天才有展青霉素檢出，且產毒量只有33.5 μg/L，隨著培養時間的延長，CICC 40658的毒素含量有一定的積累，在第12天達到最大值（912.40 μg/L），之后略微降低。Dombrink-Kurtzman等[32]對擴展青霉在幾種不同培養基上產毒情況的研究結果也表現出相同的產毒規律。從產毒速率上看，第4～10天是F-LPH10-06的快速產毒時期，之后，產毒速率有所下降，產毒量增加緩慢，逐步趨于穩定；而CICC 40658的快速產毒時期為第6～10天，之后產毒速率下降，產毒量趨于穩定。

把同一菌株的生長特性和產毒特性進行比較發現，前6 d主要是CICC 40658菌體的適應和快速生長時期，在此期間并沒有展青霉素的檢出；之后菌體的生長逐漸趨于穩定，開始代謝產生展青霉素，隨著時間的延長，展青霉素含量逐漸增加。對于F-LPH10-06，其適應期較短，之后迅速進入快速生長期，展青霉素的代謝從第4天逐漸開始；第4天之后，菌體生物量和展青霉素含量開始同步增加，在第10天同時達到穩定。

對三組入選對象均實施盆底超聲檢查，行盆底超聲檢查前要求入選對象排空大小便，將褲子脫掉后仰臥于檢查床上，且指導入選對象將體位正確擺放成截石位。探頭涂抹耦合劑后將對其包裹一層消毒薄膜（避孕套），再將耦合劑涂抹于避孕套后對入選對象實施盆底超聲檢查。檢查時將探頭放置于會陰部尿道外口與陰道口之間，左右旋轉掃查；指導患者分別做平靜呼吸和縮肛動作，觀察兩種狀態下的尿道、膀胱、陰道、宮頸以及直腸與肛門連接部；每個切面需重復測量2次后取平均值。

2.3 處理時間對殺菌效果的影響

實驗中選取放電電壓20.3 kV、頻率50 Hz、氣體流量160 L/h，對已制好的樣品進行處理，樣品中2 株菌的孢子濃度分別為3.4×106、1.5×106個/mL。處理過的樣品用平板計數法統計存活孢子數，以樣品處理時間為橫坐標，存活孢子數對數值為縱坐標，繪制2 株擴展青霉的殺菌動力學曲線（圖4）。

圖4 氣體沿面放電低溫等離子體對2 株擴展青霉孢子的殺菌動力學曲線Fig. 4 Kinetic curves of low-temperature plasma generated by gas phase surface discharge for killing spores of two strains of P. expansum

由圖4可知，隨著作用時間的延長，樣品中的孢子數逐漸減少，處理6 min時，CICC 40658孢子數降低1.0 lg（個/mL），樣品中存活孢子數對數值開始極顯著下降（P＜0.01），處理18 min時，孢子數對數值下降5.2 lg（個/mL），大多數孢子被殺死，進一步延長時間到21 min時，檢出限范圍內未檢出活孢子（檢出限為10 個）。隨著處理時間的延長F-LPH10-06樣品中孢子數也呈現遞減的趨勢，9 min時，孢子數減少1.8 lg（個/mL），樣品中孢子數對數值極顯著降低（P＜0.01），21 min時減少3.1 lg（個/mL），30 min時，1 mL樣品中僅剩余40 個孢子。由此可見，氣體沿面放電低溫等離子體對擴展青霉孢子有很好的殺滅效果[24]。

2.4 孢子不同初始濃度對殺菌效果的影響

由圖5、6可知，在不同的孢子初始濃度條件下，氣體沿面放電低溫等離子體對擴展青霉孢子都有明顯的殺菌效果（P＜0.01）。樣品中CICC 40658初始濃度分別為3.4×106、1.2×105、1.4×104個/mL，當孢子初始濃度為104個/mL時，經過6 min的低溫等離子體處理后，在檢出限范圍內未有活孢子檢出；當孢子初始濃度為105個/mL時，殺死樣品中全部孢子需要12 min；當孢子初始濃度為106個/mL時，殺死全部孢子所需時間延長到21 min（圖5）。

圖5 不同孢子濃度的擴展青霉CICC 40658對低溫等離子體滅菌效果的影響Fig. 5 Effect of initial spore concentration on fungicidal effect of low-temperature plasma against spores of P. expansum CICC 40658

圖6 不同孢子濃度的擴展青霉F-LPH10-06對低溫等離子體滅菌效果的影響Fig. 6 Effect of initial spore concentration on fungicidal effect of low-temperature plasma against spores of P. expansum F-LPH10-06

F-LPH10-06初始濃度分別為1.5×106、1.3×105、1.4×104個/mL。當F-LPH10-06孢子初始濃度為104個/mL時，經過18 min的低溫等離子體處理能將孢子全部殺死；當孢子濃度為105個/mL時，低溫等離子體處理30 min，可以將孢子全部殺死；當孢子濃度為106個/mL時，低溫等離子體處理30 min，樣品中孢子數下降了4.58 lg（個/mL）（圖6）。從圖5、6可知，降低樣品中孢子濃度，可以明顯縮短殺菌時間。鄭超[33]用脈沖放電低溫等離子體處理不同濃度的大腸桿菌菌懸液，發現當細胞初始濃度為7×104CFU/mL時，放電處理0.5 min后細菌即被全部殺死，這對低溫等離子體殺菌技術在實際生活中的應用具有重要意義。從圖5、6也可以看出，在相同的放電處理條件下，F-LPH10-06較CICC 40658更難殺死，這可能是因為F-LPH10-06孢子比CICC 40658孢子細胞壁或細胞膜較厚[24]，在處理的過程中更難被破壞，需對其進一步研究探討。

2.5 電壓對殺菌效果的影響

通過調節電源控制面板調節反應器上的電壓分別為10.3、12.8、15.3、17.8、20.3 kV，考察氣體沿面放電低溫等離子體反應體系中放電電壓對低溫等離子體滅菌效果的影響，得到兩株擴展青霉孢子在處理時間內的存活曲線，如圖7、8所示。2 株擴展青霉初始孢子濃度分別為2.9×105個/mL（CICC 40658）和1.4×106個/mL（F-LPH10-06），從存活曲線可以看出，放電電壓越高，滅菌效率越高。放電電壓為10.3 kV時，什么低溫等離子體處理21 min后，CICC 40658孢子濃度只能下降3 lg（個/mL）；當電壓分別提高到12.8 kV和15.3 kV時，殺死樣品中全部孢子需要的時間分別為18 min和15 min；繼續升高電壓到17.8 kV，殺死全部孢子的時間縮短到12 min；進一步升高電壓到20.3 kV時，殺死全部孢子所需的時間并沒有進一步縮短（圖7）。對15.3、17.8、20.3 kV 3 個電壓條件下不同時間點的孢子存活數進行分析，發現當電壓為15.3、17.8 kV時，在9 min以內各時間點的殺菌效果并無明顯差異，僅在12 min時才表現出明顯的殺菌效果；當處理電壓為17.8、20.3 kV時，2 個電壓條件下的殺菌效果也只在6 min時有明顯差異，其他時間點差異均不明顯。究其原因，可能是因為當電壓升高到一定程度時繼續提高電壓，電壓達到了一定的飽和狀態，此時的殺菌效率不會繼續提高。

圖7 不同放電電壓對擴展青霉CICC 40658孢子殺菌效果的影響Fig. 7 Effect of discharge voltage on fungicidal effect of plasma against spores of P. expansum CICC 40658

圖8 不同放電電壓對擴展青霉F-LPH10-06孢子殺菌效果的影響Fig. 8 Effect of discharge voltage on fungicidal effect of plasma against spores of P. expansum F-LPH10-06

從圖8也可以看出，在相同的放電電壓條件下，孢子濃度隨處理時間的延長而減少；在相同的處理時間下，隨電源電壓逐漸升高，F-LPH10-06孢子存活率也越來越低。當放電電壓為10.3 kV時，低溫等離子體處理30 min，F-LPH10-06孢子濃度下降1.70 lg（個/mL），升高電壓到12.8 kV時，樣品中孢子數對數值明顯降低，進一步升高電壓到15.3、17.8 kV時，存活孢子對數值與12.8 kV時殺菌效果相比無明顯差異，繼續提高電壓為20.3 kV時，樣品中孢子數對數值下降，絕大多數的孢子能被殺死。對于不同放電方式殺菌，電源電壓都是影響殺菌效果的一個重要因素，張錚等[34]在常壓介質阻擋放電殺滅金黃色葡萄球菌的研究中也表明，隨著電源電壓升高，殺菌效果逐漸提高并最終趨于穩定。

2.6 掃描電子顯微鏡結果

圖9 低溫等離子體處理前后2 株擴展青霉孢子的掃描電子顯微鏡圖Fig. 9 Scanning electron micrographs of spores of P. expansum (CICC 40658 and F-LPH10-06) before and after low-temperature plasma exposure

由圖9可知，正常的P. expansum CICC 40658孢子形態為規則的橢球形，表面粗糙，周邊完整，形態飽滿，擁有完整的細胞結構（圖9A）；P. expansum F-LPH10-06孢子形態與CICC 40658孢子形態相比較圓，為規則的球形，同樣表面粗糙，形態飽滿，細胞結構完整（圖9C）。Ye Shengying等[35]在連續直流電暈放電對擴展青霉孢子的殺滅研究中也表明，正常的擴展青霉孢子形狀為橢圓形，表面完整光滑；而經電暈放電處理的孢子，細胞膜被破壞，孢子表面出現很多深孔，孢子形狀變得不規則。Luo Ying等[36]用掃描電子顯微鏡對吸附展青霉素的酵母細胞進行觀察，結果表明正常的酵母細胞在掃描電子顯微鏡下表現為完整的圓形或橢圓形。經沿面放電低溫等離子體處理3 min后，可明顯觀察到部分霉菌孢子細胞壁和細胞膜破裂，胞內細胞質外溢，細胞表面皺縮、凹陷[37]，失去原有形態，還有部分細胞破碎后僅殘存一些細胞碎片[24]（圖9B、D），這與Ye Shengying等[35]用電暈放電處理擴展青霉孢子效果一致。

3 討 論

實驗中采用的是一種新型的介質阻擋放電方式——氣體沿面放電。在電源電壓20.3 kV、頻率50 Hz、氣體流量160 L/h、處理時間30 min的條件下，氣體沿面放電對液體樣品中擴展青霉CICC 40658和F-LPH10-06孢子有很好的殺菌效果。電源電壓、處理時間、孢子的不同初始濃度都是氣體沿面放電低溫等離子體殺菌效果的有效影響因素。在其他條件不變的情況下，延長作用時間或是增大放電電壓都能使更多的能量[33-34]、ROS、RNS、帶電粒子注入到反應器中，從而增大與孢子細胞的作用幾率，導致樣品中孢子殺滅效果增強。實驗結果顯示，降低樣品中的孢子濃度，可以明顯縮短殺菌時間，主要是因為當孢子濃度降低后，平均作用于單個孢子的能量會相應提高，從而使得孢子能更快地被殺死。除此之外，反應器的規格（如螺旋電極的長度[38-40]、低壓電極結構[38]、曝氣孔的大小[39]、氣體流速[40]）也是影響反應體系殺菌效果的重要因素。本實驗中采用的是固定參數的放電電極，在未來的研究中可以通過改變電極參數來檢測殺菌效果。

低溫等離子體所包含的成分復雜，其滅菌的機理包括放電過程中產生的帶電粒子和高能電子對細胞壁和細胞膜產生的蝕刻作用[33]；羥自由基、原子氧、O3、H2O2等ROS的氧化作用[26]、紫外光的物理輻射作用[27-28]以及RNS和其在水中副產物（NO2-、NO3-）的酸化作用[41]。Moisan等[42]認為活性粒子和紫外輻射在放電的過程中破壞了微生物的細胞膜化學成分及遺傳物質結構，起了主要的殺菌作用。放電氣體和放電方式不同，在放電過程中發揮主要作用的物質也不相同。所以究竟是哪種物質在滅菌過程中起主要作用，目前還沒有明確的結論。掃描電子顯微鏡的結果顯示，經低溫等離子體處理過的孢子表面出現了明顯的皺縮、凹陷，也有部分孢子在高壓放電后細胞壁和細胞膜破裂成碎片，表明了沿面放電主要是通過破壞正常的菌體細胞結構實現殺菌的。李兆杰等[24]在輝光放電低溫等離子體技術對微生物的殺菌動力學及殺菌機制研究中指出，由于放電氣體為氬氣，不存在ROS的氧化作用，引起細菌細胞壁和細胞膜破裂的主要原因是帶電粒子和高能電子的蝕刻作用。張錚等[34]通過介質阻擋放電空氣等離子體對金黃色葡萄球菌殺滅效果及機理的研究，也得出了相同的結論。至于是蝕刻作用、氧化作用還是紫外輻射作用，還需在今后的實驗中進一步證明。

與傳統的加熱殺菌和化學消毒方法相比，沿面放電低溫等離子體殺菌技術具有安全、快速、低溫、環保等優點[38]，擁有較大的研究價值和應用前景。目前，低溫等離子體滅菌技術作為一種新型的低溫滅菌方法在皮膚組織的消毒[33]及有害染料的降解[29]等方面得到了廣泛的應用并取得了良好的效果，在未來的研究中應該擴大低溫等離子滅菌技術在食品行業的應用范圍；在已有報道中，大多學者專家的研究對象主要集中在細菌和酵母，對霉菌的研究較少，因此要進一步擴大菌種的研究范圍。同時，為了探究低溫等離子體引起細胞死亡的原因，也要對等離子體的滅菌機理進行進一步研究。

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Killing Effect of Low-Temperature Plasma Generated by Gas Phase Surface Discharge on Penicillium expansum Spores

PAN Chunqing1, YUE Tianli1, WANG Tiecheng2, WANG Yuan1, YUAN Yahong1,*, LI Yujuan2
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China;2. College of Natural Resources and Environment, Northwest A & F University, Yangling 712100, China)

Objective: This study was conducted to evaluate the fungicidal effect of low-temperature plasma generated by gas phase surface discharge on the spores of Penicillium expansum. Methods: Two strains (CICC 40658 and F-LPH10-06)of P. expansum were used to investigate their growth and patulin-producing characteristics in potato dextrose broth medium. Low-temperature plasma generated by gas phase surface discharge sterilizer was developed and used to study the effect of treatment time, power supply voltage and initial spore concentration on its fungicidal effect against P. expansum.Furthermore, the morphological changes of P. expansum spores were characterized using scanning electron microscopy(SEM). Results: The biomass (dry weight) of P. expansum CICC 40658 and F-LPH10-06 were 28.6 and 128.7 mg after 14 days of culture, respectively. The concentration of patulin produced by P. expansum F-LPH10-06 was 147.97 mg/L at the end of incubation, which was nearly 162 times higher than that produced by CICC 40658 (912.40 μg/L). CICC 40658 at an initial concentration of 3.4 × 106spores/mL could be completely killed after 21 min treatment by low-temperature plasma generated by gas phase surface discharge. For F-LPH10-06 (1.5 × 106spores/mL), a reduction of 4.58 lg(spores/mL) was observed after treatment for 30 min. In addition, the fungicidal effect was enhanced with the increase in discharge voltage or decrease in initial spore concentration after the same treatment time. SEM observation showed that the morphology of spores changed after treatment, which may be related to the charged particles with high energy and reactive oxygen species produced during high voltage discharge. Conclusion: Low-temperature plasma generated by gas phase surface discharge has strong fungicidal effect against P. expansum, which may provide an important theoretical basis for the development and application of low-temperature sterilization technology.

low-temperature plasma; gas phase surface discharge; Penicillium expansum; fungicidal effect; patulin

2016-08-14

國家自然科學基金面上項目（31371814）；國家科技基礎性研究專項（2013FY113400）

潘春青（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全控制技術。E-mail：pancq326@163.com

*通信作者：袁亞宏（1971—），女，教授，博士，研究方向為食品工程高新技術、食品發酵工程及食品安全控制技術。E-mail：yuanyh@nwsuaf.edu.cn

10.7506/spkx1002-6630-201721001

TS201.3；TS255.44

A

1002-6630（2017）21-0001-07

潘春青, 岳田利, 王鐵成, 等. 氣體沿面放電低溫等離子體對擴展青霉孢子殺滅效果[J]. 食品科學, 2017, 38(21): 1-7.

10.7506/spkx1002-6630-201721001. http://www.spkx.net.cn

PAN Chunqing, YUE Tianli, WANG Tiecheng, et al. Killing effect of low-temperature plasma generated by gas phase surface discharge on Penicillium expansum spores[J]. Food Science, 2017, 38(21): 1-7. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721001. http://www.spkx.net.cn