米渣蛋白中谷蛋白與亞油酸的相互作用機制

耿 勤，黃 麗，楊 榕，戴濤濤，劉成梅，伍立新，呂成良，羅舜菁,*

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌市食品藥品檢驗所，江西 南昌 330038；3.江西金農生物科技有限公司，江西 宜春 336400）

米渣蛋白中谷蛋白與亞油酸的相互作用機制

耿 勤1，黃 麗2，楊 榕1，戴濤濤1，劉成梅1，伍立新3，呂成良3，羅舜菁1,*

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌市食品藥品檢驗所，江西 南昌 330038；3.江西金農生物科技有限公司，江西 宜春 336400）

利用熒光猝滅光譜、8-苯胺基-1-奈磺酸（1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid，ANS）結合熒光光譜、紫外-可見吸收光譜及圓二色光譜法研究了谷蛋白（rice glutelin，RG）與亞油酸復合體系的結構變化、熒光特性、結合機制及熱力學特性。熒光猝滅實驗結果表明：亞油酸可使谷蛋白發生熒光猝滅，猝滅機制為靜態猝滅，且亞油酸與谷蛋白之間主要相互作用為疏水性相互作用。ANS結合熒光光譜、紫外-可見吸收光譜及圓二色光譜法實驗數據表明：亞油酸的加入會使谷蛋白的二級結構及三級結構發生變化，α-螺旋結構含量明顯增加，蛋白質穩定性增強。兩者相互作用的研究可為實際生產高純度蛋白質及新型蛋白產品提供理論依據。

谷蛋白；亞油酸；相互作用；光譜法；結構

米渣中含有豐富的大米蛋白，大米蛋白作為植物蛋白，氨基酸配比平衡合理，具有低過敏性、高生物效價、低膽固醇等特點[1]，因此，米渣蛋白資源的開發利用備受關注。其中大米谷蛋白（rice glutelin，RG）是米渣蛋白中的主要成分，RG含量高達80%左右，RG中所含豐富的谷胺酰胺在維持小腸代謝、結構和功能上也起重要的作用，因此，RG也可作為一種營養補充劑[2]。然而，因米渣蛋白中含有較多的脂肪（質量分數10%）[3]，在制備高純度米渣蛋白的過程中，米渣蛋白中的殘余脂肪可能因與蛋白質發生結合[4]，使其較難被脫除，阻礙了蛋白質的純化。研究發現，脂肪會與蛋白質發生疏水性結合，從而改變蛋白質的結構[5]，且殘余脂肪的氧化會誘導蛋白質發生一定程度的氧化[6]，這對米渣蛋白的進一步加工產生一定的影響，降低米渣蛋白產品的品質并縮短貨架期[7-8]，這些問題普遍存在于脂肪含量較高的植物蛋白中，然而，目前關于植物蛋白與脂肪之間的相互作用并沒有清晰的研究。

在對米渣蛋白中的脂肪酸進行測定分析時，發現其主要的脂肪酸組成為：亞油酸（linoleic acid，LA）33%、油酸26%、棕櫚酸18%，其中，LA是米渣蛋白中含量最高的多不飽和脂肪酸，且LA是體內必需脂肪酸的一種，為功能性多不飽和脂肪酸[9]。

目前已有相當多的研究利用配體-蛋白質復合物的形成，對配體與蛋白質之間的結合、相互作用等進行研究[10]，但關于大米RG與油脂的結合研究鮮見報道。為研究米渣中蛋白質與脂肪的結合作用，本實驗選擇米渣蛋白中含量最高的RG與LA為研究對象，采用光譜學方法對RG與LA復合體中蛋白質的結構變化、熒光特性、結合機制及熱力學特性進行考察，對蛋白質與脂肪的結合機制進行研究。為進一步降低脂肪含量、制備高純度蛋白質提供實驗依據，且可為結合型蛋白產品的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米渣蛋白（蛋白質量分數68.64%、脂肪質量分數9.46%、水分質量分數6.37%） 江西金農生物科技有限公司；LA標準品（純度≥99.0%）上海晶純生化科技股份有限公司；高溫α-淀粉酶（酶活力4 000 U/g） 諾維信（中國）投資有限公司；8-苯胺基-1-奈磺酸（1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid，ANS）、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

F-7000型熒光分光光度計 日立Hitachi公司；TU-1810型紫外-可見光分光光度計 北京普析通用公司；KYD-9820凱氏定氮儀 廈門精藝興業科技有限公司；MOS-450圓二色光譜儀 法國Bio-Logic公司。

1.3 方法

1.3.1 RG的提取

根據史蘇華等[11]的提取方法，并稍作改進。稱取100 g經石油醚浸泡脫脂后的米渣蛋白，以固液比1∶10（m/V）溶于0.1 mol/L NaOH溶液中，調pH值至11.0，并置于50 ℃的水浴中浸提3 h，將浸提液4 800 r/min離心10 min，沉淀按上述方法重復提取2 次，合并3 次的上清液，得到米渣RG粗提液。將米渣RG粗提液于55 ℃水浴鍋中保溫，用1 mol/L鹽酸調pH值至6.5。加入5%α-淀粉酶去除淀粉多糖，水解4 h后調節pH值至4.8（RG等電點）進行酸沉，4 ℃冰箱冷沉2 h后離心棄上清液，所得沉淀分別用5% NaCl、70%乙醇和蒸餾水洗滌3 次，除去堿提過程中提取出的球蛋白、醇溶蛋白、清蛋白以及殘留的無機鹽。最后，沉淀物用去離子水稀釋，用0.1 mol/L NaOH調回到pH 7.0，在4 ℃冰箱中透析48 h，期間，多次更換去離子水。冷凍干燥后得米渣RG粉，-20 ℃貯存備用，凱氏定氮法測得米渣RG干基質量分數為93.12%。

1.3.2 復合物制備

RG儲備液[12]：稱取0.2 g RG，溶于20 mL 0.01mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，室溫條件下磁力攪拌2 h后，4 800 r/min離心10 min取上清液備用，上清液蛋白質量濃度采用考馬斯亮藍法測定。

LA溶液制備：稱取一定量的LA溶于0.01 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，于55 ℃水浴攪拌至完全分散，溶液呈均勻乳白色，得到不同濃度LA溶液備用，0 ℃保存。

將不同體積的LA溶液加入到儲備液（蛋白質量濃度50 μg/mL）中，持續攪拌2 h，制備LA濃度為0.00、1.78、3.56、7.13、14.20、17.80 mmol/L的RG-LA復合體系，該體系用于后續實驗測定。

1.3.3 紫外光譜測定

復合體系的紫外光譜測定根據Zhong Dagen等[13]的方法采用紫外分光光度計測定，掃描范圍為200～400 nm。對照組為實驗組相應濃度的LA溶液。

1.3.4 熒光滴定實驗

取充分混勻的RG-LA復合體系，置于1 cm石英比色皿中。設定激發波長為280 nm，發射波長300～500 nm，激發和發射狹縫寬度都為2.5 nm[14]。采用熒光分光光度計測定熒光光譜，對照組為實驗組相應濃度的LA溶液。

1.3.5 LA與RG結合機制的研究

根據Chen Liuhua等[15]的方法采用熒光分光光度計測定。分別在溫度298、304、310 K條件下測定復合體系的內源熒光，設定激發波長為280 nm，發射波長300～500 nm，激發和發射狹縫寬度都為2.5 nm，對照組為實驗組相應濃度的LA溶液。

1.3.6 表面疏水性的測定

表面疏水性的測定以ANS為熒光探針，采用熒光光譜儀進行分析，參照Si Yuexiu[16-17]和Mohan[18]等的方法并稍作修改。設置激發波長為390 nm，激發和發射狹縫分別為5.0 nm和2.5 nm。20 μL 9.0×10-4mol/L的ANS加入4 mL復合體系中，充分混勻。對照組為實驗組相應濃度的LA溶液。表面疏水性以ANS熒光強度來表示[19]。

1.3.7 圓二色光譜測定

復合體系的遠紫外-圓二色光譜根據Wu Xuli等[20]的方法使用圓二色光譜儀進行測定。RG-LA復合體系的光譜掃描范圍為200～250 nm。

1.4 數據統計

每次實驗均重復3 次，取平均值。采用Origin 9.0軟件對數據進行作圖，采用SPSS 16.0統計軟件進行Duncan顯著性分析，顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 復合體系的紫外掃描光譜

圖1 RG-LA復合體系紫外光譜圖Fig. 1 UV absorption spectra of rice gluten and linoleic acid composite system

紫外吸收光譜是一種檢測結構變化及分子間相互作用的有效手段[21]，對RG-LA復合體系進行紫外掃描，扣除相應濃度LA空白，結果如圖1所示（LA濃度為17.8 mmol/L的曲線趨勢同曲線e，圖中未顯示），復合體系的紫外吸收光譜在波長278 nm附近有特征吸收峰，這是由肽鏈上色氨酸和酪氨酸殘基的雜環π→π*躍遷引起的[22]。隨著LA溶液濃度的不斷增加，在278 nm波長處的吸光度不斷增強，這一現象與Xu Xingfeng等[23]研究發現配體對RG影響趨勢一致，表明RG結合LA后二級結構發生了一定的變化。LA引起蛋白質肽鏈伸展[24]，同時疏水基團之間的疏水作用減弱，π→π*和n→π*躍遷能量增大[25]，且兩者之間的相互作用可用熒光光譜進一步分析測定。

2.2 熒光滴定實驗

采用內源熒光滴定法可測定LA對RG內源熒光的猝滅作用。本研究利用米渣RG自身內源熒光作為探針，考察LA的復合對RG內源熒光強度的影響。

圖2表示在25 ℃、pH 7.0的條件下，固定激發波長為280 nm，掃描波長為300～450 nm范圍內隨LA量的增加（圖2）內源熒光發射光譜的變化（已扣除相應LA濃度空白）。從圖2可以看出，復合體系的最大發射波長在340 nm，隨著LA的不斷加入，復合體系的熒光峰值強度逐漸降低，表明LA與谷蛋白之間發生了一定的相互作用，LA對RG的內源熒光產生了強烈的猝滅作用，從而使RG的空間構象發生了一定的變化[26]，這一結果與紫外掃描研究結果一致，均可表明RG的構象發生了改變。

圖2 LA對RG內源熒光的猝滅光譜圖Fig. 2 Effect of linoleic acid on the fluorescence-quenching spectrum of rice gluten

2.3 LA對RG結合機制的探討

熒光猝滅機制通常可以分為動態猝滅、靜態猝滅和靜態動態混合猝滅3 種[27]。動態猝滅是指猝滅劑和熒光物質的激發態分子之間相互作用過程，遵循Stern-Volmer方程。靜態猝滅是指猝滅劑和熒光物質分子在基態時生成不發光的復合物，從而導致熒光物質熒光強度降低的過程，符合Lineweaver-Burk雙倒數方程。

首先假設LA對RG熒光猝滅的作用為動態猝滅，符合Stern-Volmer方程（式（1））。

式中：F、F0分別為加入猝滅體和不添加猝滅體時蛋白質的熒光強度；Kq為生物分子的猝滅速率常數/（L/（mol·s））；τ0為不存在猝滅體時熒光體的熒光壽命（通常生物大分子的熒光壽命大約為10-8s）；cQ為猝滅體的濃度/（mol/L）；KS為Stern-Volmer猝滅常數/（L/mol）。

圖3 不同溫度下LA對RG熒光猝滅的Stern-Volmer圖Fig. 3 Stern-Volmer curves of gluten fluorescence quenching by linoleic acid at different temperatures

由圖3可見，按Stern-Volmer方程作圖得一直線，F0/F與LA濃度有良好的線性關系。由此表明LA對RG的熒光猝滅機制不是靜態和動態的混合猝滅。根據不同溫度條件下的行為來區分動態猝滅、靜態猝滅。

通常動態猝滅是溫度升高有利于猝滅過程的進行，所以KS會隨著溫度的升高而增大，而靜態猝滅是溫度升高使形成的復合物穩定性降低，所以KS將會隨著溫度的升高而減小。而從圖3中可以看出，隨著溫度的升高曲線的斜率不斷減小，即KS不斷減小，這說明LA對RG的猝滅為靜態猝滅過程。

表1 RG-LA復合體系在不同溫度下的Stern-Volmer猝滅常數Table 1 Stern-Volmer quenching constants at different temperatures

通常各類猝滅劑對生物大分子的最大動態猝滅常數Kq為2.0×1010L/（mol·s）。根據公式可求得不同溫度條件下的猝滅常數如表1所示。3 個不同溫度條件下熒光猝滅速率常數遠大于2.0×1010L/（mol·s），且隨著溫度的升高而不斷減小，這進一步表明LA對RG的猝滅為靜態猝滅過程，且LA與RG中的色氨酸殘基結合而形成了某種具有特定結構的超分子復合物[25]。

2.4 LA與RG的結合位點數

靜態猝滅符合Lineweaver-Burk雙倒數方程（式2）：

式中：F和F0分別為加入LA和不添加LA時蛋白的熒光強度；n為結合位點數；K0為靜態猝滅結合常數/（L/mol）；cLA為LA的濃度/（mol/L）。

以lg（F0/F-1）對lg cLA作圖（圖4），可得出LA與RG的K0和n。

圖4 不同溫度下RG-LA復合體系lg（F0/F- 1）-lg cLA雙對數圖Fig. 4 Double logarithmic graphs from lg(F0/F-1)-lg cLA of gluten and linoleic acid composite system at different temperatures

表2 lg（F0/F -1）對lg cLA擬合曲線的回歸方程、相關系數和結合位點數Table 2 Fitting regression equations, correlation coefficients and number of binding sites of lg(F0/F-1) against lg cLA curve

由表2可知，LA與RG的K0較大，表明LA與RG的結合能力較強，且K0隨溫度升高也略有增大，可能是由于隨著溫度的升高復合物穩定性略有提高從而導致K0變大[12]。同時，在不同溫度條件下n均約等于1，表明LA與RG有一個相對獨立的結合位點。

2.5 作用力類型的確定

RG與LA的熱力學參數可通過式（3）、（4）計算：

式中：K為結合常數/（L/mol），T為實驗溫度/K，R為氣體常數（8.314 J/（mol·K））。

通過熱力學參數焓變和熵變的大小可以確定小分子物質與生物大分子RG之間的主要作用力。根據式（3），以1/T為自變量，ln K為應變量，擬合曲線，根據斜率截距算出焓值和熵值，將ΔH、ΔS代入式（4），根據溫度計算出ΔG。若ΔH＞0和ΔS＞0表明為疏水作用[28]；ΔH＜0和ΔS＜0為范德華力和氫鍵[29]；ΔH＜0和ΔS＞0表明靜電相互作用[30]；ΔG＜0表明結合過程是自發的[31]。

表3 RG-LA復合體系的熱力學參數值Table 3 Thermodynamic parameters of linoleic acid and gluten composite system

由表3可知，ΔH＞0和ΔS＞0表明LA與RG之間的相互作用主要為疏水作用，且ΔG＜0表明結合過程是由焓和熵驅動的自發過程。

2.6 表面疏水性的測定結果

圖5 不同濃度RG-LA復合體系的ANS結合熒光光譜Fig. 5 ANS fluorescence spectra of linoleic acid and gluten composite system

在中性條件下，以ANS為熒光探針的熒光光譜法測定不同濃度RG-LA復合體系的表面疏水性，結果如圖5所示，隨著LA濃度的增加，復合體系的熒光強度降低，這主要是因為ANS是一種非共價熒光探針，可以通過非共價鍵疏水性作用與蛋白質的疏水性區域結合[32]，而LA同樣與RG的表面疏水性基團結合，使RG表面疏水性區域減少，減少了RG與ANS的結合，而導致測定的表面疏水性降低[33-34]。復合體系熒光最大吸收峰發生了紅移，表明蛋白質的三級結構發生改變。

2.7 圓二色光譜測定結果

圖6 不同濃度RG-LA復合體系的圓二色光譜圖Fig. 6 CD spectra of linoleic acid and gluten composite system

對RG-LA復合體系的圓二光譜進行測定，結果如圖6所示，復合體系在210 nm左右有一個明顯的負峰，是α-螺旋的特征峰，屬于α-螺旋中肽鏈的π→π*躍遷[35]。隨著LA濃度增加，復合體系在210 nm波長處峰的振幅明顯增強，但峰的位置并沒有發生明顯地位移。這說明LA與RG結合后，RG的二級結構發生了變化，與紫外掃描結果一致，且RG中α-螺旋結構含量明顯增加，蛋白質穩定性增強[36]。

3 結 論

本實驗以米渣蛋白中RG與LA為研究對象，對復合體系中蛋白的結構變化、熒光特性、結合機制及熱力學特性進行考察，研究RG與LA之間的相互作用。熒光猝滅光譜結果表明，LA會與RG自發結合，且LA對RG的熒光猝滅機制為靜態猝滅，兩者之間的主要相互作用為疏水性相互作用。采用紫外-可見光譜法、ANS結合熒光光譜及圓二色光譜3 種結構測定手段，分析了RG結合LA后結構的變化。結果表明，RG結合LA后三級結構及二級結構發生改變，α-螺旋結構含量顯著增加，蛋白質穩定性增強。

明確脂肪與蛋白質間的相互作用，可為植物蛋白中脂肪的脫除提供實驗指導，為進一步制備高純度植物蛋白，提高產品的附加值及利用率提供理論基礎。后續實驗可進一步研究不同條件下脂肪與蛋白質的相互作用，為實際生產提供理論依據。

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Interaction Mechanism of Gluten and Linoleic Acid in Rice Dreg Protein

GENG Qin1, HUANG Li2, YANG Rong1, DAI Taotao1, LIU Chengmei1, WU Lixin3, Lü Chengliang3, LUO Shunjing1,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. Nanchang Institute for Food and Drug Control, Nanchang 330038, China; 3. Jiangxi Jin Nong Biological Technology Co. Ltd., Yichun 336400, China)

Structural changes, fluorescence characteristics, binding mechanism and thermodynamic features of gluten and linoleic acid composite system in rice dreg protein were studied using fluorescence quenching spectroscopy,1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid (ANS) fluorescence spectroscopy, ultraviolet-visible (UV-Vis) absorption spectroscopy and circular dichroism (CD) spectroscopy. The fluorescence spectral results showed that the endogenous fluorescence of gluten was significantly quenched by linoleic acid and the mechanism of fluorescence quenching was static quenching. The major driving force was hydrophobic interactions. Meanwhile, the ANS fluorescence, UV-Vis absorption and CD spectral data showed that the secondary and tertiary structure of gluten were changed by the addition of linoleic acid. A significant increase in α-helix structure content was observed and protein stability was enhanced. This study will provide a theoretical basis for the production of high-purity protein and innovative protein product systems.

gluten; linoleic acid; interaction; spectroscopy; structure

10.7506/spkx1002-6630-201721024

TS213.3

A

1002-6630（2017）21-0152-06

耿勤, 黃麗, 楊榕, 等. 米渣蛋白中谷蛋白與亞油酸的相互作用機制[J]. 食品科學, 2017, 38(21): 152-157.

10.7506/spkx1002-6630-201721024. http://www.spkx.net.cn

GENG Qin, HUANG Li, YANG Rong, et al. Interaction mechanism of gluten and linoleic acid in rice dreg protein[J]. Food Science,2017, 38(21): 152-157. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721024. http://www.spkx.net.cn

2016-08-22

耿勤（1992—），女，碩士，研究方向為食品（含生物質）資源的開發利用。E-mail：gengqin00@163.com

*通信作者：羅舜菁（1969—），女，教授，碩士，研究方向為現代高新技術與食品加工工程。E-mail：luoshunjing@aliyun.com