環糊精功能化修飾納米銀負載姜黃素的制備及其抗腫瘤活性

陳建平，余 苗，秦小明，諶素華，鐘賽意,*

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088；2.廣東省天然產物綠色加工與產品安全重點實驗室，廣東 廣州 510640； 3.江西省糧油質量監督檢驗中心，江西 南昌 330046）

環糊精功能化修飾納米銀負載姜黃素的制備及其抗腫瘤活性

陳建平1,2，余 苗3，秦小明1，諶素華1，鐘賽意1,*

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088；2.廣東省天然產物綠色加工與產品安全重點實驗室，廣東 廣州 510640； 3.江西省糧油質量監督檢驗中心，江西 南昌 330046）

采用納米銀材料制備負載姜黃素（curcumin，Cur）的β-環糊精（β-cyclodextrin，β-CD）功能化納米銀——Ag@β-CD@Cur，并進一步對其抗腫瘤活性進行測定。運用透射電子顯微鏡和納米粒度儀鑒定Ag@β-CD@Cur的表面形貌、粒徑大小和穩定性。運用倒置熒光顯微鏡和3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽法檢測Ag@β-CD@Cur對人肝癌細胞HepG2形態和活性的影響，并進一步采用流式細胞術檢測細胞凋亡比例。實驗結果表明，所制備的Ag@β-CD@Cur是純度很高的單質銀，且大小均一、表面光滑，粒徑約為2 nm。同時，Ag@β-CD@Cur具有較好的穩定性，能在水中穩定存在30 d。經Ag@β-CD@Cur處理HepG2細胞24 h后，HepG2細胞的形態出現明顯的變圓、細胞核固縮等細胞凋亡特征，同時，細胞存活率從對照組的100%降低到24%，進一步的流式細胞術分析結果表明，細胞凋亡比例從對照組的2.5%增加到51.0%。實驗結果表明，納米化后的Cur具有較強的抗腫瘤活性效果，這為Cur在納米制劑的應用提供了一定的技術手段和理論數據參考。

姜黃素；β-環糊精；銀納米粒子；制備；抗腫瘤活性

姜黃素（curcumin，Cur）是從姜科姜黃屬植物姜黃根莖中提取的一種脂溶性酚類物質[1]。目前，在國內外的食品工業當中，姜黃素是一種重要的香料、色素和抗氧化劑，廣泛應用于咖哩、烤肉卷、芥菜醬、面食、糕點、糖果、罐頭、飲料、果酒、果汁及烹飪菜肴等[2-6]。研究表明，Cur的結構中含有酚羥基，在細胞膜發生脂質過氧化反應時，其酚羥基可以發生氧化反應，能有效終止自由基反應[4]，因而其表現出諸多生理活性，比如抗氧化[7-8]、抗腫瘤[9-10]、抗炎[11-12]、防止衰老等。然而，由于Cur的水溶性差，存在于食品中的Cur被人體攝入后生物利用度較低，難以發揮應有的抗氧化和抗腫瘤等活性作用，極大地限制了它在抗腫瘤臨床方面的應用范圍及應用價值。

目前，已有研究證實，可以運用多種方法來提高Cur的生物利用度，比如，將Cur制備成納米粒子[13-14]、脂質體[15-16]、微球[17]、磷脂復合物[18]和各種Cur的結構衍生物等[19-20]。其中，納米技術是近年來發展的一種新型技術，納米銀（nano sliver，AgNPs）粒子作為一種新興的功能納米材料，在生物學領域有著廣泛的應用[21]。AgNPs是指粒徑在1～100 nm之間的金屬銀微粒，是金屬銀的一種特殊形態。AgNPs具有體積小、比表面積大、物理化學性質獨特、對人體細胞毒性低等優點，廣泛用作抗癌藥物的載藥體系[22-23]。然而，目前還未見有關采用AgNPs材料制備Cur納米粒子的研究報道。為此，本實驗采用AgNPs作為藥物載體對Cur進行負載制備Cur納米粒子并進一步考察其抗腫瘤活性。為了提高AgNPs的穩定性，本實驗首先采用β-環糊精（β-cyclodetrin，β-CD）對AgNPs進行功能化修飾，然后對Cur進行負載從而制備負載Cur的環糊精功能化銀納米粒子——Ag@β-CD@Cur，并對其抗腫瘤活性進行評價。研究結果對于指導Cur在臨床上的合理應用、優化給藥方案、改進藥物劑型以及質量控制等方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Cur（質量分數≥99.9%）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料 美國Sigma公司；β-CD（食品級） 山東新大精細化工有限公司產品；硝酸銀、VC、無水乙醇（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT）、改良杜氏伊格爾培養基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清、青霉素和鏈霉素 美國Hyclone公司；人肝癌細胞HepG2 美國ATCC公司。

1.2 儀器與設備

BP301S電子天平 德國Sartorius公司；Nano-ZS納米粒度儀 英國Malvern公司；TEANAI-10透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM） 荷蘭Philips公司；Centrifuge 5804R離心機 德國Eppendorf公司；倒置顯微鏡 日本Olympus公司；Versamax酶標儀美國Molecular Devices公司；FACS Aria流式細胞儀美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 AgNPs的合成

AgNPs的合成參照文獻[23]。稱取AgNO3粉末16 mg溶于40 mL Milli-Q水中配成400 μg/mL AgNO3溶液。稱取16 mg VC溶于40 mL Milli-Q水中配成400 μg/mL VC儲備溶液。在磁力攪拌的條件下，取0.1 mL 400 μg/mL VC溶液逐滴加入到4 mL AgNO3（400 μg/mL）溶液中，攪拌2 h后，在水中透析24 h除去過量的VC和AgNO3。AgNPs溶液經超聲2 min后，用0.2 μm的多孔濾膜進行過濾制得AgNPs。最后，采用電感耦合等離子體原子發射光譜法（inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry，ICP-AES）對AgNPs濃度進行測定。

1.3.2 Ag@β-CD及Ag@β-CD@Cur和Ag@Cur的制備

將0.1 mL VC儲備溶液逐滴加入到4 mL AgNO3溶液中，經磁力攪拌2 h后，加入3.792 mg β-CD，磁力攪拌6 h，然后經透析后獲取純化后的AgNPs負載體系。取上述溶液，于10 000 r/min離心10 min，去離子水洗3 遍，樣品冷凍干燥得到Ag@β-CD。

將0.1 mL VC儲備溶液逐滴加入到4 mL AgNO3溶液中，經磁力攪拌2 h后，加入3.792 mg β-CD和80 μL 1 mmol/L Cur，磁力攪拌6 h，然后經透析后獲取純化后的AgNPs負載體系。取上述溶液，于10 000 r/min離心10 min，去離子水洗3 遍，樣品冷凍干燥得到Ag@β-CD@Cur。

將0.1 mL VC儲備溶液逐滴加入到4 mL AgNO3溶液中，經磁力攪拌2 h后，加入80 μL 1 mmol/L Cur，磁力攪拌6 h，然后經透析后獲取純化后的AgNPs負載體系。取上述溶液，于10 000 r/min離心10 min，去離子水洗3 遍，樣品冷凍干燥得到Ag@Cur。

1.3.3 Ag@β-CD@Cur物理性質測定

1.3.3.1 TEM觀察Ag@β-CD@Cur形貌

將樣品Ag@β-CD@Cur均勻分散滴在銅網上，TEM測定樣品微粒的大小、形貌和均勻性。同時，采用能量色散X射線光譜儀（energy dispersive X-ray spectroscopy，EDX）掃描分析Ag@β-CD@Cur的元素組成。

1.3.3.2 納米粒度儀測定Ag@β-CD@Cur的粒徑及穩定性

用Nano-ZS納米粒度儀測定Ag@β-CD@Cur的粒徑變化及相應Zeta電位，與AgNPs和Ag@β-CD相比較。測試條件：入射光為氦氖激光，波長λ為633 nm，入射角為90°，測量穩定溫度為（25.0±0.1）℃。

1.3.4 Ag@β-CD@Cur抗腫瘤活性測定

1.3.4.1 細胞培養

HepG2細胞復蘇后培養在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和50 U/mL鏈霉素的DMEM完全培養液中，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，根據細胞的生長狀態傳代，取對數生長期細胞用于以下MTT實驗。

1.3.4.2 MTT法測定細胞存活率

細胞存活率的測定根據Chen Tianfeng[24]、Chen Jianping[25]等的方法進行操作。取對數生長期的細胞進行實驗，經細胞傳代后，調整細胞密度。將HepG2細胞以2×104個/孔接種于96 孔培養板，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養24 h。向不同的96 孔板中分別加入2.5 μg/mL AgNPs工作液、Ag@β-CD工作液、Ag@Cur工作液、Ag@β-CD@Cur工作液處理HepG2細胞，以不添加工作液的細胞培養液作為對照組。經不同方式處理的HepG2細胞分別培養24 h后，采用倒置顯微鏡觀察細胞的形態變化。然后，往96 孔細胞培養板中加入5 mg/mL MTT，每孔20 μL，放入37 ℃培養箱中孵育4 h后除去上層清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，在搖床上振蕩10 min，待紫色結晶物充分溶解后，用酶標儀在570 nm波長處測定各孔OD值。以對照組的OD值為100%，計算不同處理組中的細胞存活率。

式中：ODi表示不同處理組的OD值；OD0表示對照組的OD值。

1.3.4.3 流式細胞術檢測細胞凋亡比例

細胞凋亡率的測定根據Su Jianyu等[26]的方法進行操作。取對數生長期的HepG2細胞，經消化離心、計數，接種到6 cm的培養皿中，細胞密度為6×104個/mL，培養箱中孵育24 h后，分別用2.5 μg/mL AgNPs工作液、Ag@β-CD工作液、Ag@Cur工作液、Ag@β-CD@Cur工作液處理HepG2細胞24 h，以不添加工作液的細胞培養液作為對照組。然后用0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，用磷酸鹽緩沖液洗2 次，離心后得到的細胞用-20 ℃預冷的75%乙醇固定，吹打均勻后置于-20 ℃過夜，次日1 000×g離心5 min，倒掉上清液，加入500 μL PI染料，置于4 ℃中避光染色20 min后上機待測。流式細胞儀激發波長為488 nm，發射波長為630 nm，每個樣品至少分析10 000 個細胞，用軟件Multi Cycle分析細胞周期。

2 結果與分析

2.1 Ag@β-CD@Cur的鑒定

圖1 AgNPs（A）、Ag@β-CD（B）和Ag@β-CD@Cur（C）的TEM結果圖Fig. 1 TEM images of AgNPs (A), Ag@β-CD (B) and Ag@β-CD@Cur (C)

用TEM觀察所制備的Ag@β-CD@Cur，實驗結果如圖1所示。Ag@β-CD@Cur大小均一，粒徑約為2 nm，且表面光滑，說明Ag@β-CD@Cur是粒徑均勻的納米球。

圖2 Ag@β-CD@Cur的EDX元素分析Fig. 2 EDX analysis of Ag@β-CD@Cur

對Ag@β-CD@Cur表面元素進行分析。由圖2可知，Ag是主要元素，占了21%，而C、O分別占了18%和11%，后兩者很可能來自于β-CD和Cur，此外無其他元素的信號（所檢出Cu為銅網所致），表明Ag@β-CD@Cur純度很高。

對Ag@β-CD@Cur的穩定性進行分析后發現，Ag@β-CD@Cur在水溶液中保持穩定，在30 d內粒徑維持在2 nm左右，提示所合成的納米載藥體系是穩定的納米溶膠系統，有利于貯存和使用（圖3A）。對Ag@β-CD@Cur體系的Zeta電位分析結果（圖3B）顯示，AgNPs的Zeta電位為-15 mV，在納米粒子表面連接了β-CD后Ag@β-CD的Zeta電位變為50 mV。在體系中負載了Cur后，Ag@β-CD@Cur的Zeta電位減至36 mV，說明β-CD和Cur存在于AgNPs納米體系中。

圖3 Ag@β-CD@Cur穩定性Fig. 3 Stability of Ag@β-CD@Cur

2.2 Ag@β-CD@Cur的抗腫瘤活性

圖4 Ag@β-CD@Cur對HepG2細胞生長的影響Fig. 4 Effect of Ag@β-CD@Cur on the growth of HepG2 cells

從圖4A的倒置熒光顯微成像可以看出，對照組細胞均呈不規則多邊形貼壁生長，經過2.5 μg/mL AgNPs、2.5 μg/mL Ag@β-CD、2.5 μg/mL Ag@Cur和2.5 μg/mL Ag@β-CD@Cur處理HepG2細胞24 h后，HepG2細胞的生長狀態均受到了抑制。然而，相比AgNPs、Ag@β-CD和Ag@Cur，Ag@β-CD@Cur抑制HepG2細胞生長更明顯，表現為細胞形態出現了明顯的變化，細胞出現更多的變圓、細胞核固縮等細胞凋亡的生物學特征。為了驗證這一實驗結果，進一步采用MTT法檢測細胞的存活率，實驗結果如圖4B所示。當用2.5 μg/mL AgNPs和2.5 μg/mL Ag@β-CD處理HepG2細胞24 h后，其細胞存活率分別為80%和72%。而當2.5 μg/mL的Ag@Cur處理HepG2細胞24 h后，其細胞存活率降低到51%。然而，用2.5 μg/mL的Ag@β-CD@Cur處理HepG2細胞24 h后，其細胞存活率達到最低，為24%。這一實驗結果與觀察到的細胞形態的實驗結果（圖4A）相一致。由此可知，相比AgNPs、Ag@β-CD和Ag@Cur，Ag@β-CD@Cur表現出更強的抗腫瘤活性。

2.3 細胞凋亡比例

圖5 Ag@β-CD@Cur對HepG2細胞中細胞凋亡比例的影響Fig. 5 Effect of Ag@β-CD@Cur on the population of Sub-G1 cells in HepG2 cells

為了驗證MTT的結果，進一步采用細胞流式術檢測細胞凋亡比例，結果如圖5所示。當用2.5 μg/mL AgNPs和Ag@β-CD處理HepG2細胞24 h后，SubG1細胞凋亡比例分別從對照組的2.5%提高到12.6%和27.1%。而當2.5 μg/mL Ag@Cur處理HepG2細胞24 h后，SubG1細胞凋亡比例增加到34.7%。然而，相比Ag@Cur，用2.5 μg/mL的Ag@β-CD@Cur處理HepG2細胞24 h后，SubG1細胞凋亡比例為51.0%，這表明Ag@β-CD@Cur抑制腫瘤細胞增殖主要是通過誘導細胞凋亡而實現的。

3 結 論

原發性肝癌，俗稱“肝癌”，是世界上第5大常見的惡性腫瘤，且其死亡率高居所有癌癥中第3位[27]。目前，治療肝癌的常用化療藥物有表柔比星、絲裂霉素、5-氟尿嘧啶、順鉑等。近年來，大量研究表明，Cur對肝癌細胞具有較強的抑制效果[28]。然而，相比化療藥物，Cur對正常細胞卻表現出較低的毒副作用[29-30]。這為Cur作為一種理想的抗癌藥物提供了可能，然而由于其水溶性低，限制了其在臨床方面的應用。本實驗通過銀納米技術提高了Cur的水溶性，發現Ag@Cur能夠很好地溶解在水中，并且，在水中能夠穩定存在30 d，這為Cur的臨床應用提供了可能。同時，Ag@β-CD@Cur處理HepG2細胞后，能極顯著抑制HepG2細胞的生長（P＜0.01），且抑制率達到了76%（由于細胞存活率僅為24%），且SubG1細胞凋亡比例達到了51%，表明Ag@β-CD@Cur具有較強的抗腫瘤活性效果。然而，關于Ag@β-CD@Cur抑制HepG2細胞增殖及誘導其細胞凋亡的機制還有待于進一步的研究。

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Preparation and Anticancer Activity of Cyclodextrin-Functionalized Curcumin-Loaded Silver Nanoparticles

CHEN Jianping1,2, YU Miao3, QIN Xiaoming1, CHEN Suhua1, ZHONG Saiyi1,*
(1. College of Food and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China; 2. Guangdong Province Key Laboratory for Green Processing of Natural Products and Product Safety, Guangzhou 510640, China; 3. Grain and Edible Oil Products Quality’s Supervision and Inspection Center in Jiangxi Province, Nanchang 330046, China)

In this study, cyclodextrin-functionalized curcumin-loaded silver nanoparticles (Ag@β-CD@Cur) were prepared with silver nanomaterials and its anticancer activity was also studied. The surface morphology, particle size and stability of Ag@β-CD@Cur were detected by transmission electronic microscopy and Zetasizer Nano. Moreover, the effect of Ag@β-CD@Cur on morphological and viability changes of HepG2 cells were detected by phase-contrast microscopy and(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide assay. Moreover, the population of apoptotic cells was detected by flow cytometric analysis. The experimental results showed that Ag@β-CD@Cur was obtained as highly pure,uniformly sized silver nanoparticles with a smooth surface. The average size of Ag@β-CD@Cur was 2 nm. Moreover,Ag@β-CD@Cur had good stability in water for 30 days. After treatment of HepG2 cells with Ag@β-CD@Cur for 24 h,apoptosis characteristics appeared such as cell swelling and cell nuclei pyknosis. At the same time, the cell viability reduced to 24% of the control group. Further flow cytometric analysis showed that the population of apoptotic cells increased from 2.5% (control) to 51.0%. The results demonstrated that after nanoparticlization, curcumin has stronger anticancer activity,which will provide a technical means and theoretical data for curcumin nano-formulation.

curcumin; β-cyclodextrin; silver nanoparticles; preparation; anticancer activity

10.7506/spkx1002-6630-201721006

TS201.2

A

1002-6630（2017）21-0038-05

2016-09-28

國家自然科學基金青年科學基金項目（21602034）；廣東省自然科學基金博士啟動項目（2016A30310332）；廣東省公益研究與能力建設項目（2015A020209166）；廣東省天然產物綠色加工與產品安全重點實驗室開放基金項目（201617）

陳建平（1986—），男，講師，博士，研究方向為天然產物活性物質及其生物利用。E-mail：cjp516555989@126.com

*通信作者：鐘賽意（1979—），男，副教授，博士，研究方向為天然產物活性物質及其生物利用。E-mail：zsylxc@126.com

陳建平, 余苗, 秦小明, 等. 環糊精功能化修飾納米銀負載姜黃素的制備及其抗腫瘤活性[J]. 食品科學, 2017, 38(21):38-42.

10.7506/spkx1002-6630-201721006. http://www.spkx.net.cn

CHEN Jianping, YU Miao, QIN Xiaoming, et al. Preparation and anticancer activity of cyclodextrin-functionalized curcumin-loaded silver nanoparticles[J]. Food Science, 2017, 38(21): 38-42. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721006. http://www.spkx.net.cn