海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物抗氧化和抗疲勞活性

何傳波，魏好程，熊何健,*，吳國(guó)宏，吳建勇

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021；2.香港理工大學(xué)應(yīng)用生物與化學(xué)科技學(xué)系，香港 999077）

海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物抗氧化和抗疲勞活性

何傳波1，魏好程1，熊何健1,*，吳國(guó)宏1，吳建勇2

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021；2.香港理工大學(xué)應(yīng)用生物與化學(xué)科技學(xué)系，香港 999077）

以海參內(nèi)臟為原料，通過(guò)中性蛋白酶水解，結(jié)合超濾和冷凍干燥工藝制備海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物，利用高效液相色譜法測(cè)定酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量。結(jié)果表明，海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量為73.02%，以分子質(zhì)量分布在187～998 D的小分子肽為主，該部分峰面積占總面積的77.9%。酶解產(chǎn)物具有一定的抗氧化活性，不同劑量（200、400、800 mg/（kg·d））的酶解產(chǎn)物均能降低小鼠肝臟的丙二醛含量，增加超氧化物歧化酶活力和還原型谷胱甘肽含量，且與模型對(duì)照組相比，差異均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），說(shuō)明海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物能有效恢復(fù)氧化損傷機(jī)體抗氧化指標(biāo)。海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物具有一定的抗疲勞功效，3 個(gè)劑量組均能極顯著延長(zhǎng)小鼠的力竭游泳時(shí)間和提高運(yùn)動(dòng)小鼠的肝糖原含量，降低其血清乳酸和血清尿素氮含量（P＜0.01）。

海參內(nèi)臟；酶解；抗氧化；抗疲勞

海參（sea cucumber，Holothuians）屬無(wú)脊椎動(dòng)物棘皮動(dòng)物門(mén)（Echinodermata），是其中海參綱（Holothuroidea）的總稱(chēng)。由于其獨(dú)特的食療和藥用價(jià)值，海參在我國(guó)一向被視為珍貴食材和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)品，位列“海八珍”之一。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在海參的生物活性物質(zhì)及其藥理作用等方面取得了豐碩的研究成果，相繼從10多種海參中分離提取了多種功能性活性物質(zhì)，包括海參多糖[1]、海參皂苷[2-3]、海參蛋白質(zhì)及多肽[4]、脂類(lèi)（包括脂肪酸[5]、神經(jīng)節(jié)苷脂[6-8]和腦苷脂[9]等）、凝集素、神經(jīng)肽和糖肽以及多種微量元素等，它們具有抗疲勞、抗氧化、降血脂、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、促細(xì)胞生長(zhǎng)和抗血栓等諸多生理活性[10]。

由于需求的不斷增加，我國(guó)海參養(yǎng)殖和加工產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，而作為海參加工過(guò)程中的主要下腳料——海參內(nèi)臟則很少得到利用。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，海參內(nèi)臟含有與海參體壁相似的活性成分，有些成分的含量甚至高于體壁，如必需氨基酸中的賴(lài)氨酸。在國(guó)外，特別是日本、韓國(guó)，將海參腸卵譽(yù)為“海參花”，可生吃，可沏茶泡酒，也可將其鹽漬發(fā)酵成參花醬[11-12]，而在我國(guó)，海參內(nèi)臟基本被丟棄，造成了很大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。

隨著生活節(jié)奏的加快和工作壓力的增大，人們?cè)诠ぷ魃钪械钠诟腥找婕觿。鞣N抗疲勞功能的保健食品應(yīng)運(yùn)而生。由于海洋生物生存的環(huán)境與陸地生物完全不同，生長(zhǎng)在這一特殊環(huán)境中的海洋生物，在其生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中，產(chǎn)生并積累了大量特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)并具有獨(dú)特生理活性和功能的物質(zhì)，是開(kāi)發(fā)新型海洋藥物和功能食品的重要資源。本實(shí)驗(yàn)采用蛋白酶酶解海參內(nèi)臟，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討酶解產(chǎn)物的抗氧化、抗疲勞活性，為海參內(nèi)臟的高值化綜合利用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、動(dòng)物與試劑

新鮮海參內(nèi)臟采自福建霞浦，清理后凍干備用；SPF級(jí)雄性昆明小鼠，體質(zhì)量（18±2） g，合格證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司；小鼠維持飼料，A級(jí)，合格證號(hào)：SCXK（京）2014-0010，購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

中性蛋白酶（134 000 U/g） 諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；丙二醛（malonaldehyde，MDA）試劑盒、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）試劑盒、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）試劑盒、乳酸（lactic acid，LA）試劑盒、血清尿素氮（serum urea nitrogen，BUN）試劑盒、肝糖原試劑盒 南京建成生物工程研究所；細(xì)胞色素c、抑肽酶、生長(zhǎng)抑制素（均為色譜純） 美國(guó)Sigma公司；氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）、GSH（均為色譜純） 美國(guó)Amresco公司。其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-8000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；BS-124S電子天平、M35電子水分測(cè)定儀 德國(guó)賽多利斯股份有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；JDG-0.2T真空凍干機(jī) 蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司；TDL-5離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；3K3D高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；pH211臺(tái)式酸度測(cè)定儀 北京哈納科技有限公司；RNF0460-011多功能卷式膜小試設(shè)備 廈門(mén)福美科技有限公司；Ultimate3000高效液相色譜儀 美國(guó)Dionex公司；MSI微型漩渦振蕩器 廣州科技實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；SX2-10-13馬弗爐 上海石研電爐有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器 金壇市國(guó)旺儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解產(chǎn)物制備

取海參內(nèi)臟粉300 g，按照12∶1（V/m）的液料比加入去離子水，中性蛋白酶用量2 000 U/g，pH 7，50 ℃酶解5 h后，95 ℃加熱15 min鈍化滅酶，酶解液過(guò)10 kD的超濾膜，收集濾液凍干，得到50.46 g海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物。

1.3.2 酶解產(chǎn)物理化指標(biāo)測(cè)定

多糖含量測(cè)定：苯酚硫酸法[13]；粗蛋白含量測(cè)定：參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；水分含量測(cè)定：參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》；脂肪含量測(cè)定：參照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測(cè)定》；灰分含量測(cè)定：參照GB 5009.4—2010《食品中灰分的測(cè)定》。

1.3.3 酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量測(cè)定

采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法進(jìn)行測(cè)定。色譜條件：凝膠柱為T(mén)SKgel G2000SWXL（7.8 mm×300 mm）；流動(dòng)相為乙腈/超純水/三氟乙酸（體積比為45∶55∶0.1），流速為0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；柱溫30 ℃。校正曲線所用的標(biāo)準(zhǔn)品為GSH（MW＝307 D）、GSSG（MW＝613 D）、生長(zhǎng)抑制素（MW＝1636.7 D）、抑肽酶（MW＝6 512 D）、細(xì)胞色素c（MW＝12 384 D）。

1.3.4 體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 動(dòng)物分組及給藥

SPF級(jí)雄性昆明小鼠50 只，每天光照12 h，動(dòng)物房環(huán)境溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，自由進(jìn)食進(jìn)水，每天更換飼料、飲用水和墊料，進(jìn)行7 d適應(yīng)性喂養(yǎng)。小鼠適應(yīng)環(huán)境后，隨機(jī)分為5 組，每組10 只，分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物低、中、高劑量組（酶解產(chǎn)物200、400、800 mg/（kg·d））[14]，以體質(zhì)量計(jì)，下同），空白對(duì)照組和模型對(duì)照組每天灌胃等體積的生理鹽水。

1.3.4.2 氧化損傷模型建立

連續(xù)灌胃30 d后，除空白對(duì)照組外，其他各組小鼠禁食16 h，然后1 次性灌胃給予50%乙醇12 mL/kg，6 h后脫頸椎處死取材。

1.3.4.3 肝臟生化指標(biāo)測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取各組小鼠肝臟0.5 g，加4.5 mL生理鹽水，冰水浴用組織碾磨器碾磨5～8 min，肝勻漿在4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min，移取上清液，分別用MDA試劑盒、GSH試劑盒和T-SOD試劑盒測(cè)定肝勻漿上清液中的MDA和GSH含量及SOD活力，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.5 抗疲勞活性實(shí)驗(yàn)

1.3.5.1 動(dòng)物分組及給藥

SPF級(jí)雄性昆明小鼠40 只，7 d適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)分為4 組，每組10 只，分別為空白對(duì)照組、海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物低、中、高劑量組（酶解產(chǎn)物200、400、800 mg/（kg·d））。24 d開(kāi)始，每次灌胃30 min后，讓小鼠在游泳箱（水溫（25±1） ℃，水深不低于30 cm）中游泳訓(xùn)練30 min。

1.3.5.2 小鼠力竭游泳時(shí)間測(cè)定

在實(shí)驗(yàn)28 d給藥30 min后，將小鼠尾根部負(fù)重5%體質(zhì)量的鉛絲或者回形針，用膠布粘繞，置于游泳箱中游泳，觀察小鼠游泳狀況，記錄小鼠游泳力竭時(shí)間，即小鼠自游泳開(kāi)始至小鼠全身沉沒(méi)于水中8 s沒(méi)有抬頭的累積時(shí)間，每5 只小鼠一組，秒表計(jì)時(shí)。游泳結(jié)束后，將小鼠快速撈起，用吹風(fēng)機(jī)吹干后放回原來(lái)籠中正常飼養(yǎng)。

1.3.5.3 血清中LA和BUN含量測(cè)定

小鼠末次灌胃30 min后，不負(fù)重游泳60 min，摘眼球取血，肝素抗凝，制備血清，分別用利用LA試劑盒和BUN試劑盒測(cè)定血清LA和BUN含量，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.5.4 肝糖原含量測(cè)定

小鼠末次灌胃后休息30 min，頸椎脫臼將其處死，準(zhǔn)確稱(chēng)取肝臟100 mg，加入5 g/100 mL的三氯乙酸2 mL，勻漿1 min后，3 000 r/min離心15 min將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)試管中，在沉淀內(nèi)再加入5 g/100 mL的三氯乙酸2 mL，再次勻漿1 min后離心15 min，合并兩次的上清液，混勻，參照肝糖原試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定肝糖原的含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），各項(xiàng)數(shù)據(jù)結(jié)果用 ±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解產(chǎn)物的理化指標(biāo)

酶解產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量最高，為73.02%，其次是灰分（13.09%），灰分主要來(lái)源于原料自身，水分和多糖含量分別為7.20%和5.96%。因此，酶解產(chǎn)物中主要成分為蛋白及多肽，其總得率為12.28%（m終產(chǎn)物/m原料）。

2.2 酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布

為了研究酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布，本實(shí)驗(yàn)選用了5 種標(biāo)準(zhǔn)品，分別為GSH、GSSG、生長(zhǎng)抑制素、抑肽酶和細(xì)胞色素c。標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的洗脫時(shí)間分別為細(xì)胞色素c 11.63 min、抑肽酶13.57 min、生長(zhǎng)抑制素15.69 min、GSSG 18.39 min、GSH 19.59 min。在相同的色譜條件下測(cè)定海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量，其分布從圖1可以看出，海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量主要分布在187～998 D，這部分的峰面積占總面積的77.9%。

圖1 海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布Fig. 1 Molecular mass distribution of sea cucumber visceral protein hydrolysate

2.3 體內(nèi)抗氧化活性分析

2.3.1 內(nèi)臟酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

表1 海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of sea cucumber visceral protein hydrolysate on body weight of mice

小鼠體質(zhì)量的變化反映了海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠健康狀況的影響，小鼠體質(zhì)量增加或者減少過(guò)快，都不利于其健康。由表1可知，隨著灌胃時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠體質(zhì)量逐漸增加，且各組小鼠體質(zhì)量每周增加幅度差異不顯著（P＞0.05），其中酶解產(chǎn)物各劑量組與空白照組相比均沒(méi)有達(dá)到顯著性差異（P＞0.05）。觀察小鼠行為特征，未發(fā)現(xiàn)異常或死亡現(xiàn)象，表明灌胃海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物并不會(huì)影響小鼠正常生長(zhǎng)，對(duì)小鼠無(wú)毒副作用。

2.3.2 酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠肝臟MDA含量的影響

肝臟中的MDA是機(jī)體自由基攻擊肝細(xì)胞生物膜中的不飽和脂肪酸而產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化物，MDA及其分解產(chǎn)物均能導(dǎo)致細(xì)胞損傷，其含量與細(xì)胞氧化損傷的程度呈正相關(guān)[15]。因此，測(cè)定MDA含量可以反映機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。由表2可知，模型對(duì)照組的肝臟MDA含量為5.03 nmol/mg pro，比空白對(duì)照組增加了17.80%，差異極顯著（P＜0.01），說(shuō)明造模過(guò)程對(duì)小鼠造成了顯著的氧化損傷，造模良好。酶解產(chǎn)物低、中、高劑量組的肝臟MDA含量分別比模型對(duì)照組降低了15.71%、35.79%和20.28%，且都與模型對(duì)照組具有極顯著性差異（P＜0.01）。說(shuō)明海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物具有良好的清除MDA的能力，能較好地保護(hù)肝臟細(xì)胞免受自由基攻擊，具有一定的抗氧化活性。

表2 海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物對(duì)肝臟MDA含量的影響Table 2 Effect of sea cucumber visceral protein hydrolysate on MDA contents in mouse liver

2.3.3 酶解產(chǎn)物小鼠對(duì)肝臟SOD活力的影響

表3 海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物對(duì)肝臟SOD活力的影響Table 3 Effect of sea cucumber visceral protein hydrolysate on SOD activity in mouse liver

SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，可以有效清除機(jī)體產(chǎn)生的氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受自由基攻擊[16-17]。因此，其在體內(nèi)活力的高低可以反映機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱。從表3可以看出，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠肝臟內(nèi)SOD活力極顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明利用乙醇氧化損傷造模成功。酶解產(chǎn)物的3 個(gè)劑量組SOD活力較模型對(duì)照組極顯著升高（P＜0.01），分別比模型對(duì)照組上升了18.46%、54.12%和38.36%。酶解產(chǎn)物中劑量組SOD活力最高，且與低、高劑量組存在顯著差異（P＜0.05），過(guò)量的海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物會(huì)影響到SOD的活力，這可能是因?yàn)檫^(guò)量的海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物表現(xiàn)出一定的副作用所致。

2.3.4 酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠肝臟GSH含量的影響

GSH在生物體內(nèi)作為一種還原劑，具有清除體內(nèi)氧自由基、抗氧化、解毒等重要生理活性[18-20]。因此，測(cè)定體內(nèi)GSH的含量，可以作為評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化能力大小的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。由表4可知，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組肝臟GSH含量極顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明造模成功。酶解產(chǎn)物低、中劑量組小鼠肝臟中GSH含量與空白對(duì)照組相近，而高劑量組則比空白對(duì)照組提高了約50%。3 個(gè)劑量組的GSH含量均極顯著高于模型對(duì)照組（P＜0.01），分別提高了122.42%、128.48%和223.74%。說(shuō)明海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物具有提高肝臟中GSH含量的作用，并且能夠幫助氧化損傷機(jī)體GSH含量恢復(fù)正常水平。

表4 海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠肝臟GSH含量的影響Table 4 Effect of sea cucumber viscera protein hydrolysate on GSH contents in mouse liver

2.4 抗疲勞活性分析

2.4.1 酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響

表5 海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響Table 5 Effect of sea cucumber visceral protein hydrolysate on exhaustive swimming time of mice

運(yùn)動(dòng)耐力的下降是疲勞最直觀、最主要的表現(xiàn)，在持續(xù)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗以及代謝廢物的積累都會(huì)加快疲勞的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)用小鼠力竭游泳實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠抗疲勞運(yùn)動(dòng)指標(biāo)，結(jié)果如表5所示，酶解產(chǎn)物中劑量組的小鼠平均力竭游泳時(shí)間最長(zhǎng)，為81.28 min，相當(dāng)于空白對(duì)照組的2.08 倍，低、高劑量組小鼠的平均力竭游泳時(shí)間分別相當(dāng)于空白對(duì)照組的1.81和1.66 倍，3 個(gè)劑量組與空白對(duì)照組之間均有極顯著差異（P＜0.01），說(shuō)明海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物能夠顯著延長(zhǎng)小鼠的力竭游泳時(shí)間，具有一定的抗疲勞效果。另外，3 個(gè)劑量組之間也存在差異，隨著酶解產(chǎn)物攝入量的增加，小鼠負(fù)重游泳時(shí)間先延長(zhǎng)后縮短，說(shuō)明海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物與抗疲勞活性并不是呈線性關(guān)系，適宜的濃度具有最大化的抗疲勞活性，濃度太大可能會(huì)適得其反。

2.4.2 酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠血清LA含量的影響

表6 海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠血清LA含量的影響Table 6 Effect of sea cucumber visceral protein hydrolysate on LA contents in serum of mice

“LA假說(shuō)”認(rèn)為，在劇烈運(yùn)動(dòng)的情況下，肌肉耗氧量增加導(dǎo)致機(jī)體缺氧，糖酵解反應(yīng)加速，產(chǎn)生大量的LA，造成機(jī)體pH值下降，肌肉中LA/H+濃度是造成肌肉疲勞的主要原因[21]。由表6可知，空白對(duì)照組的LA含量最高，為16.17 mmol/L，3 個(gè)劑量組分別比空白對(duì)照組的LA含量降低了22.51%、23.19%和21.58%，且與空白對(duì)照組之間具有極顯著差異（P＜0.01），說(shuō)明海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物可以顯著降低運(yùn)動(dòng)小鼠血清中LA的含量，對(duì)緩解或者消除LA在小鼠體內(nèi)的堆積，具有一定的抗疲勞效果。

2.4.3 酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠BUN含量的影響

表7 海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠BUN含量的影響Table 7 Effect of sea cucumber visceral protein hydrolysate on BUN contents of mice

劇烈運(yùn)動(dòng)之后，蛋白質(zhì)逐漸分解產(chǎn)生NH3和CO2，使肝臟中尿素氮水平明顯增加。BUN含量直接代表了血液中尿素氮的水平。體內(nèi)BUN水平和運(yùn)動(dòng)耐受力呈顯著負(fù)相關(guān)[22]。由表7可知，空白對(duì)照組具有最高的BUN含量，為6.71 mmol/L，低、中、高3 個(gè)劑量組的BUN含量分別比空白對(duì)照組下降了12.67%、13.11%和17.14%，且都與空白對(duì)照組具有極顯著性差異（P＜0.01）。說(shuō)明海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物能夠顯著降低運(yùn)動(dòng)小鼠BUN的含量，具有一定的抗疲勞活性。這可能是海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物在小鼠體內(nèi)參與能量代謝，減緩小鼠體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝造成的。

2.4.4 酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠肝糖原含量的影響

表8 海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠肝糖原含量的影響Table 8 Effect of sea cucumber visceral protein hydrolysate on liver glycogen contents of mice

長(zhǎng)時(shí)間緊張運(yùn)動(dòng)，會(huì)使肝糖原分解為葡萄糖，將其轉(zhuǎn)化為能量，維持血糖水平以滿(mǎn)足機(jī)體需要，因此，肝糖原含量高低是衡量機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐受力的重要標(biāo)志，也是測(cè)定疲勞是否發(fā)生的一項(xiàng)重要指標(biāo)[23]。由表8可知，空白對(duì)照組肝糖原含量最低，為5.50 mg/g，3 個(gè)劑量組的肝糖原含量分別比空白對(duì)照組提高了30.73%、58.36%和26.91%，且都與空白對(duì)照組具有極顯著性差異（P＜0.01）。說(shuō)明海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物能夠增加肝糖原的儲(chǔ)備，提高機(jī)體的運(yùn)動(dòng)耐受能力，增強(qiáng)機(jī)體抗疲勞能力，具有很好的抗疲勞活性，這可能與內(nèi)臟酶解產(chǎn)物能夠改善機(jī)體的能量代謝體系有關(guān)。

3 討 論

運(yùn)動(dòng)性疲勞是一個(gè)綜合的癥狀，不僅與機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)的消耗相關(guān)，還與神經(jīng)、內(nèi)分泌以及免疫系統(tǒng)的平衡調(diào)節(jié)相關(guān)[24]。在近100 年的研究中，多種有關(guān)運(yùn)動(dòng)性疲勞的理論被提出[25]，其中自由基理論逐漸被大多數(shù)人接受。高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后產(chǎn)生過(guò)多的自由基，會(huì)對(duì)機(jī)體內(nèi)的大分子物質(zhì)和組織器官產(chǎn)生損傷，并氧化產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物等物質(zhì)，危害人體健康[26-27]。有研究表明，外源性抗氧化物質(zhì)能與內(nèi)源性自由基相互作用，減少機(jī)體氧化損傷、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化防御能力、減少疲勞產(chǎn)生[28-30]。本研究通過(guò)對(duì)海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物體內(nèi)抗氧化和抗疲勞活性的分析，試圖為兩種活性間關(guān)系的深入探究提供數(shù)據(jù)支持。

通過(guò)中性蛋白酶酶解，結(jié)合10 kD的超濾膜純化和冷凍干燥工藝得到了海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物。產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量最高，占比73.02%，總得率為12.28%。通過(guò)進(jìn)一步HPLC檢測(cè)，酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量主要分布在187～998 D，該部分峰面積占總面積的77.9%，說(shuō)明酶解產(chǎn)物以小分子肽為主。

使用昆明種雄性小鼠連續(xù)灌胃給藥30 d，末次灌胃后利用乙醇氧化損傷的方法進(jìn)行造模處理，通過(guò)小鼠體質(zhì)量、肝臟SOD活力、MDA含量、GSH含量4 項(xiàng)指標(biāo)對(duì)海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物體內(nèi)抗氧化活性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，各劑量組小鼠體質(zhì)量間無(wú)明顯差異（P＞0.05），說(shuō)明海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物不會(huì)影響小鼠體質(zhì)量的正常增長(zhǎng)。與氧化損傷模型對(duì)照組相比，不同劑量的海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物均能降低小鼠肝臟的MDA含量，增加其SOD活力和GSH含量，且均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。說(shuō)明海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物能幫助氧化損傷機(jī)體抗氧化指標(biāo)的有效恢復(fù)。根據(jù)保健食品抗氧化功能評(píng)價(jià)方法結(jié)果判定，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物、蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物、抗氧化酶、抗氧化物質(zhì)4 項(xiàng)指標(biāo)中3 項(xiàng)陽(yáng)性，可判定該受試樣品抗氧化功能動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性，可知海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物具有一定的抗氧化活性。

給小鼠灌胃不同劑量的海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物30 d，檢測(cè)小鼠力竭游泳時(shí)間，血清LA含量、BUN含量以及肝糖原含量，對(duì)海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物的抗疲勞活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物的3 個(gè)劑量組均能極顯著延長(zhǎng)小鼠的力竭游泳時(shí)間并提高運(yùn)動(dòng)小鼠的肝糖原含量，降低其血清LA和BUN含量（P＜0.01），說(shuō)明海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物能有效降低運(yùn)動(dòng)疲勞物質(zhì)的產(chǎn)生，提高機(jī)體的運(yùn)動(dòng)耐受能力，減緩疲勞的發(fā)生。根據(jù)《保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法》[31]，若1 項(xiàng)以上（含1 項(xiàng)）的運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)和2 項(xiàng)以上（含2 項(xiàng)）的生化指標(biāo)為陽(yáng)性，可判定該受試物具有抗疲勞作用，因此，可以判定海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物具有一定的抗疲勞功效。另外，在上面兩項(xiàng)活性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同劑量對(duì)各指標(biāo)的影響無(wú)規(guī)律，劑量-效應(yīng)關(guān)系不明顯，很多指標(biāo)都是中劑量組具有最佳效果，這可能需要進(jìn)一步通過(guò)更精確的劑量設(shè)置進(jìn)行驗(yàn)證。

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Antioxidant and Antifatigue Activities of Enzymatic Protein Hydrolysate from Sea Cucumber Viscera

HE Chuanbo1, WEI Haocheng1, XIONG Hejian1,*, WU Guohong1, WU Jianyong2

(1. College of Food and Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China;2. Department of Applied Biology and Chemical Technology, The Hong Kong Polytechnic University, Hongkong 999077, China)

Protein hydrolysate from visceral waste proteins of sea cucumber was prepared by hydrolysis with neutral protease, followed by ultrafiltration and freeze drying. The protein content in the protein hydrolysate was 73.02%,which was composed mainly of small peptides. The results of high performance liquid chromatography analysis showed that the relative molecular weight of the hydrolysate was mainly distributed in the range of 187-998 D, accounting for 77.9% of the total peak area. In vitro antioxidant experiments showed that the protein hydrolysate had significant antioxidant activity. The hydrolysate at various dosages (200, 400 and 800 mg/(kg·d)) could significantly reduce the malonaldehyde content in mouse livers, and also increase the activity of superoxide dismutase, and glutathione contents(P 〈 0.01). The results illustrated that the hydrolysate could effectively restore antioxidant indexes. The experiments of antifatigue activity proved that the hydrolysate had high antifatigue activity. All three dosages of the hydrolysate could significantly increase the exhaustive swimming time and liver glycogen contents of mice, and reduce the contents of lactic acid and urea nitrogen in the serum of mice (P 〈 0.01).

sea cucumber viscera; enzymatic hydrolysis; antioxidant; antifatigue

10.7506/spkx1002-6630-201721032

TS254.9

A

1002-6630（2017）21-0201-06

何傳波, 魏好程, 熊何健, 等. 海參內(nèi)臟酶解產(chǎn)物抗氧化和抗疲勞活性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(21): 201-206.

10.7506/spkx1002-6630-201721032. http://www.spkx.net.cn

HE Chuanbo, WEI Haocheng, XIONG Hejian, et al. Antioxidant and antifatigue activities of enzymatic protein hydrolysate from sea cucumber viscera[J]. Food Science, 2017, 38(21): 201-206. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721032. http://www.spkx.net.cn

2016-07-28

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015J01141）；廈門(mén)市科技計(jì)劃項(xiàng)目（3502Z20153014）；廈門(mén)市海洋漁業(yè)局（南方海洋中心）項(xiàng)目（14GZP007NF07）

何傳波（1978—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槎嗵俏镔|(zhì)及其綜合利用。E-mail：hcbcc@jmu.edu.cn

*通信作者：熊何健（1968—），男，研究員，碩士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：hjxiong@jmu.edu.cn