鱘魚硫酸軟骨素對結直腸癌細胞抑制作用

武瑞赟，劉 蕾，張金蘭，陳貴林*，李平蘭,*

（1.內蒙古大學生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010021；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

鱘魚硫酸軟骨素對結直腸癌細胞抑制作用

武瑞赟1,2，劉 蕾2，張金蘭2，陳貴林1,*，李平蘭2,*

（1.內蒙古大學生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010021；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

探究鱘魚硫酸軟骨素對結直腸癌細胞的生長抑制能力，并初步確定影響結直腸癌細胞生長的主要原因。選取3 株具有代表性的結直腸癌細胞Caco-2、HCT-116、SW480，采用CCK-8法測定細胞生長曲線、硫酸軟骨素對癌細胞增殖的抑制能力；以其中一株結直腸癌細胞HCT-116為模型，用流式細胞儀測定其周期和凋亡情況，用細胞核染色法觀察處理前后細胞形態，結合caspase-3凋亡酶活力的測定，考察鱘魚硫酸軟骨素對結直腸癌細胞的促凋亡能力，并初步確定作用途徑。研究結果表明，鱘魚硫酸軟骨素對結直腸癌細胞Caco-2、HCT-116、SW480的增殖具有一定抑制作用，最高抑制率分別為70.94%、90.00%和75.00%，明顯高于陽性對照處理組；處理后，細胞周期G1/G0期比例升高至88.56%，S期比例降低至4.47%，阻滯細胞G1/G0期；同時，使用鱘魚硫酸軟骨素處理細胞后，細胞形態發生變化，出現細胞核固縮以及細胞破碎等現象，細胞主要的凋亡酶活力顯著升高，酶活力可達1 645 IU/μg，使細胞發生凋亡，凋亡率可達63.73%。研究結果證明，鱘魚硫酸軟骨素具有促進結直腸癌細胞凋亡、抑制細胞增殖的能力。

鱘魚硫酸軟骨素；結直腸癌；細胞增殖；凋亡

硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是存在于人和動物軟骨、結締組織中的具有特殊生物活性的酸性黏多糖[1]，由于CS具有顯著的親軟骨性，當其進入機體后，可優先進入軟骨組織，起到保護軟骨的作用；此外，CS可以通過抑制某些有害的溶酶體酶和蛋白水解酶（如N-乙酰胺基葡萄糖苷酶、彈性酶等）的活性[2]，降低酶對關節組織的損傷，通過促進機體對鈣的吸收和沉淀，增加機體骨骼強度，促進骨骼生長；當CS在血液中達到一定濃度時，可競爭性地與脂蛋白發生結合，降低發生動脈硬化的幾率。因此，CS臨床上主要用于預防和治療關節炎、免疫調節、調脂、降脂、抗動脈粥樣硬化以及神經元的保護和修復作用[3-8]。

市面上較常見的CS多提取自鯊魚軟骨[9]，隨著人們的過度捕撈，鯊魚資源日趨匱乏，鯊魚CS的取得難度增加[10]。素有“活化石”之稱的鱘魚是現在世界上最大、最原始的軟骨硬磷魚類[11]。其營養豐富，富含多種氨基酸，蛋白含量高[12]，尤其是它的頭、脊索、鰭中軟骨占魚體的10%左右，近年來，鱘魚養殖業不斷興起，我國現已成為世界上第一鱘魚養殖大國，且鱘魚軟骨中CS含量豐富[13-14]，因此，鱘魚可以作為CS的新來源。

隨著經濟的發展，人們生活水平的提高，生活習慣及飲食結構的改變，使得腸道紊亂、慢性腸道疾病以及腸道癌癥等問題不斷出現，并且影響著人們的健康[15-16]。在漫長的治療過程中，治療效果不理想、藥物毒性的積累等問題日益突出[17]，因此，尋找具有預防、治療或輔助治療腸道疾病的生物活性物質已成為急需解決的問題。前期的研究中，對鱘魚CS的提取和純化工藝進行了優化，提取工藝簡單，提取后，CS得率、純度高，為后續實驗開展提供了很好的原材料。本研究選用從鱘魚脊骨中提取純化CS，對結直腸癌細胞增殖、周期和凋亡進行了測定，研究結果可為水生生物活性物質的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人結直腸癌細胞Caco-2、SW480、HCT-116 中國醫學科學院基礎醫學研究所；人工養殖鱘魚 北京懷柔區鱘魚養殖基地。

DMEM培養基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 美國Corning公司；胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液（0.25%） 北京索萊寶科技有限公司；細胞增殖Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒、細胞周期檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒、Hoechst 33258染色液、caspase-3活力檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；堿性蛋白酶 北京奧博星生物技術有限責任公司；CS提取專用酶 諾維信中國生物技術有限公司；三氯乙酸、無水乙醇、氯化鈉 北京化學試劑公司；氯化十六烷基吡啶 國藥集團化學試劑有限公司；魚CS酶聯免疫試劑盒 上海酶聯生物科技有限公司；5-氟脲嘧啶 武漢制藥集團股份有限公司。

1.2 儀器與設備

倒置顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限責任公司；流式細胞分析儀 美國BD公司；激光共聚焦顯微鏡德國Zeiss公司；Imark酶標儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 鱘魚CS制備

將鱘魚脊柱放入鍋中水煮1 h，取出冷卻后剔除脊索軟骨上殘留的肌肉、脂肪和其他結締組織，切碎后轉移至燒杯中，加95%乙醇浸泡2 h，移出乙醇，重復浸泡一次。冷卻干燥后的軟骨稱質量，粉碎，備用。

將制得的軟骨粉按1∶25（m∶V）溶于pH 7的碳酸鈉溶液中，加入75 mL的CS提取專用酶，溫控60 ℃，攪拌2～3 h后煮沸使酶失活，待溶液冷卻后向其中加入125 mg的堿性蛋白酶，溫控60 ℃，攪拌2～3 h后煮沸使酶失活。

將上述步驟中的酶解液過濾，冷卻濾液后加入6.1 mol/mL的三氯乙酸靜置3 h后，10 000 r/min離心10 min去蛋白質，向所得上清液中加入75%乙醇，靜置1 h后10 000r/min離心10 min收集沉淀，80 ℃烘干制得CS粗品。

將所得CS粗品溶于水后加氯化十六烷基吡啶，室溫靜置2 h，10 000 r/min離心10 min收集沉淀，并將沉淀溶于氯化鈉溶液中，加入乙醇，10 000 r/min離心10 min收集沉淀，去離子水溶解沉淀后經透析袋透析純化24 h后冷凍干燥，制得CS純品。CS得率根據式（1）計算。

CS純度的測定按照魚CS酶聯免疫試劑盒說明書進行。

1.3.2 細胞復蘇培養

Caco-2、HCT-116、SW480細胞從液氮管中取出，迅速置于37 ℃水浴中，不斷搖動細胞凍存管快速解凍。將解凍后的細胞快速轉移至15 mL的離心管中，加入DMEM培養液重懸細胞后，轉移至無菌的細胞培養瓶中，37 ℃、5% CO2條件下培養，待細胞長至80%以上，進行傳代，傳至3 代以上后用于實驗。

1.3.3 細胞生長曲線的測定

細胞經胰蛋白酶消化后，輕輕吹打使其分散成單個細胞，進行細胞計數，稀釋到5×104個/mL；將細胞懸液加入96 孔細胞培養板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養箱中，每2 h取出后加入10 μL的CCK-8，于37 ℃避光反應4 h；用酶標儀測定OD450nm，繪制細胞生長曲線。

1.3.4 細胞增殖檢測

細胞經胰蛋白酶消化后，輕輕吹打使其分散成單個細胞，進行細胞計數，稀釋到5×104個/mL；將細胞懸液加入96 孔細胞培養板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養箱中貼壁過夜培養；棄去原細胞培養液，處理組每孔加入100 μL不同質量濃度的鱘魚CS（50、100、200、400、800、1 000 μg/mL），另設不添加任何受試物只加有細胞的對照組和不加細胞的空白組，同時設置50 μg/mL 5-氟脲嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）為陽性對照組。每個質量濃度設6 個平行，繼續培養24 h。藥物處理結束，每孔添加10 μL的CCK-8試劑，于37 ℃避光反應4 h；用酶標儀于450 nm波長處測定吸光度，根據式（2）計算細胞抑制率。

1.3.5 細胞周期的測定

細胞以1×106個/mL接種于6 孔細胞培養板，置于37 ℃、5% CO2培養箱中貼壁過夜培養。吸去原細胞培養液，每孔加入1 mL不同質量濃度的鱘魚CS（100、200、400 μg/mL），另設不添加任何受試物只加有細胞的對照組，處理24 h后，做如下處理：每孔添加0.5 mL胰蛋白酶消化貼壁細胞，并使細胞成單個細胞，收集細胞于15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min；加入1 mL 4 ℃預冷的PBS重懸細胞；再次1 000 r/min離心5 min后，加入1 mL 4 ℃預冷的70%乙醇固定細胞，4 ℃過夜；1 000 r/min離心5 min，棄去乙醇，加入1 mL 4 ℃預冷的PBS洗滌細胞2 次，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液；每管中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，37 ℃避光孵育30 min，使用激發波長為488 nm的流式細胞儀檢測。

1.3.6 細胞凋亡的測定

細胞以5×105個/mL接種于6 孔細胞培養板，置于37 ℃、5% CO2培養箱中貼壁過夜。吸去原細胞培養液，每孔加入1 mL不同質量濃度的鱘魚CS（100、200、400 μg/mL），另設不添加任何受試物，只加有細胞的對照組，處理24 h后，做如下處理：每孔添加0.5 mL胰蛋白酶消化貼壁細胞，并使細胞成單個細胞，收集細胞于15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min；加入1 mL 4 ℃預冷的PBS洗滌細胞2～3 次；加入195 μL Annexin V-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）結合液輕輕重懸細胞，并轉移至1.5 mL無菌離心管中；加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫條件下孵育15 min；加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，室溫條件下避光孵育10 min，用流式細胞儀進行檢測。

1.3.7 細胞核Hoechst染色

細胞以5×105個/mL的密度接種于20 mm玻璃細胞培養皿中，37 ℃、5% CO2貼壁過夜培養。每孔加入1 mL不同質量濃度的鱘魚CS（100、200、400 μg/mL），另設不添加任何受試物只加有細胞的對照組，處理24 h后，棄去培養液，每皿中加入1 mL預冷的70%乙醇，室溫固定10 min；棄去固定液，PBS洗去殘留的乙醇溶液；加入1 mL Hoechst 33258染色液，室溫避光孵育20 min；棄去染色液，PBS洗滌細胞2 次；選擇激發波長為350 nm，發射波長為460 nm，激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。

1.3.8 caspase-3活力測定

細胞以5×105個/mL種于6 孔培養板中，在DMEM完全培養基中培養，待細胞貼壁12 h后，加入不同質量濃度的CS，另設不加任何刺激物的對照組。培養24 h后，胰蛋白酶消化細胞，經PBS洗滌一次后，裂解細胞測定caspase-3活力。在冰浴條件下，加入細胞裂解液，冰浴裂解15 min后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液。向收集好的上清液中加入底物乙酰天冬氨酸-硝基苯胺（acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilide，Ac-DEVD-pNA），37 ℃孵育2 h，用酶標儀測定A405nn。最終的caspase-3酶活力單位定義為每微克蛋白樣品在37 ℃、2 h內作用于底物Ac-DEVD-pNA所產生的pNA的物質的量。

1.4 數據統計分析

所有測試重復進行平行實驗3 次，用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 CS的純度

將經透析袋透析，冷凍干燥后的CS沉淀溶于DMEM培養基后，使用試劑盒測定其含量，繪制標準曲線，得回歸方程y＝0.014x+0.089 1，R2＝0.999 3，回歸性良好，說明采用此方法可以有效測定CS含量。使用酶標儀對提取CS的OD值進行檢測并計算相應的CS含量及純度，計算所得鱘魚CS得率為19.1%、純度為96.39%，純度較高。

2.2 細胞生長曲線

圖1 3 株結直腸癌細胞生長曲線Fig. 1 Growth curves of three colorectal cancer cells

由圖1可知，細胞增生數隨培養時間延長呈現先增多后減少的趨勢。3 株結直腸癌細胞的增生數均在接種細胞20 h左右達到最大值，隨后細胞增殖狀態穩定，此后，細胞貼壁能力下降，細胞增生數開始呈下降趨勢。Albrektsen等[18]研究發現，一般細胞傳代之后，經過短暫的懸浮后，細胞沉降貼壁，隨后經過不同時間細胞大量發生分裂，細胞生長增殖。Kariagina等[19]為了準確地描述整個過程中細胞數目的動態變化，將典型的生長曲線劃分為生長緩慢的潛伏期、斜率較大的指數生長期、呈平臺狀的平頂期及退化衰亡4 個部分。研究結果表明細胞在0～10 h內恢復貼壁能力，10～24 h進入生長對數期，此時細胞活力最強，24～44 h為生長平穩期，之后細胞活力減弱，細胞退化死亡。這與Kariagina等[19]分析的細胞生長變化一致，該結果表明實驗細胞接種密度合適，細胞自身穩定生長，適合在觀察細胞生長變化等的實驗中應用，同時細胞生長曲線的測定為實驗給藥時間點以及藥物處理時間的選擇提供了依據。

2.3 鱘魚CS對結直腸癌細胞增殖的影響

圖2 鱘魚CS對結直腸癌細胞增殖的影響Fig. 2 Inhibitory effect of sturgeon chondroitin sulfate on the growth of colorectal cancer cells

利用CCK-8試劑盒測定并計算不同質量濃度頭骨、脊骨CS以及5-FU分別作用3 株結直腸癌細胞24 h后的細胞存活率，結果見圖2。不同質量濃度的CS均能夠在不同程度上降低結直腸癌細胞的存活率，且抑制率呈現劑量依賴效應。

鱘魚CS對結直腸癌細胞Caco-2的最大抑制率為70.94%；對結直腸癌細胞SW480的最大抑制率為75.00%；對結直腸癌細胞HCT-116的最大抑制率可達90.00%。同時對比陽性對照5-FU的抑制效果，結果發現鱘魚CS對結直腸癌細胞生長的抑制率均大于陽性對照5-FU的作用，陽性對照5-FU對3 種結直腸癌細胞的抑制能力分別為21.03%、18.03%和22.06%。說明鱘魚CS具有抑制結直腸癌細胞增殖的潛力。

2.4 鱘魚CS對結直腸癌細胞周期的影響

圖3 鱘魚CS對結直腸癌細胞HCT-116周期分布的影響Fig. 3 Effect of sturgeon chondroitin sulfate on cell cycle distribution of colorectal cancer HCT-116 cells

一個完整的細胞周期包括：間隔期（G1）、DNA合成期（S）、第二時間間隔期（G2）和細胞分裂期（M）[20-21]。結合前期細胞增殖實驗結果，選擇了抑制效果相對最好的一株具有代表性的結直腸癌細胞HCT-116，研究不同質量濃度鱘魚CS對結直腸癌細胞周期的影響，實驗結果如圖3所示。結果表明，與對照組相比，3 個質量濃度的鱘魚脊骨CS可以提高處于G0/G1期的細胞比例，結直腸癌細胞CT-116 G0/G1期細胞比例由36.31%提高至88.56%，S期比例由47.16%下降至4.47%，說明鱘魚CS處理細胞后，可以改變細胞周期分布，使細胞周期發生阻滯。Lee等[22]指出，G1～S期的檢測是細胞周期中重要的檢測，決定細胞是否可以進行DNA的合成。Mirjany等[23]研究表明，阿司匹林是通過誘導G1期阻滯來抑制細胞增殖的。因此，從實驗結果可以看出，G0/G1期的細胞比例增加，說明鱘魚CS使細胞發生G0/G1期阻滯，進而降低進入DNA合成期的細胞數量，從而抑制結直腸癌細胞增殖。

2.5 鱘魚CS對結直腸癌細胞凋亡活性的影響

采用流失細胞儀測定鱘魚CS（100、200、400 μg/mL）處理結直腸癌細胞HCT-116后細胞的凋亡情況，由圖4結果可知，鱘魚CS可以抑制結直腸癌細胞生長，與對照相比，3 個質量濃度的CS均可以提高結直腸癌細胞的總凋亡率，可由最初的10.01%升高到63.73%，晚期凋亡細胞增長比例大于早期凋亡細胞，說明鱘魚CS可以引起細胞凋亡的發生，且不會引起細胞壞死的發生。

圖4 鱘魚CS對結直腸癌細胞HCT-116的促凋亡作用Fig. 4 Sturgeon chondroitin sulfate induced apoptosis of colorectal cancer HCT-116 cells

2.6 細胞核形態

通過前面實驗，發現CS作用結直腸癌細胞后，引起細胞凋亡率增加，細胞凋亡可使細胞形態發生變化，采用Hoechst進行染色后，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞形態如圖5所示，與對照組相比，不同質量濃度處理后，細胞膜通透性改變，膜結構被破壞[24]，細胞核呈致密濃染或碎狀的致密濃染，表明這些細胞已經發生了凋亡或晚期凋亡。而且，濃染細胞數目隨CS質量濃度的增加而增加，貼壁細胞數目也有所減少。說明鱘魚CS作用結直腸癌細胞后，可以引起細胞形態發生改變、染色質固縮等變化，從而引起細胞的凋亡。

圖5 鱘魚CS處理后結直腸癌細胞HCT-116的細胞核Hoechst染色Fig. 5 Examination of chondroitin sulfate-treated HCT-116 cells by nuclear Hoechst staining

2.7 caspase-3活性

細胞內凋亡執行酶被激活，誘導細胞發生凋亡[25]。CS作用于結直腸癌細胞24 h后，測定caspase-3的活力，結果如圖6所示，與空白對照組相比，CS作用結腸癌細胞后可以顯著提高細胞的caspase-3活力，在鱘魚CS質量濃度為400 μg/mL時，酶活力達到1 645 IU/μg，且存在劑量效應關系，隨劑量的增加酶活力增加。細胞生長受抑制，表現為細胞凋亡的發生，細胞凋亡涉及細胞形態、生化特征、分子水平等一系列的變化[26-28]。caspase-3是caspase家族下游的關鍵效應分子，Holland-Nell等[29]指出，caspase-3通過剪切聚腺苷二磷酸核糖聚合酶導致細胞DNA發生裂解，促使細胞凋亡。Altonsy等[30]的研究中也有相似報道。酶活力檢測結果說明，鱘魚CS作用于結直腸癌細胞后，可以使細胞內凋亡酶caspase-3活力升高，誘導細胞凋亡的發生。

圖6 鱘魚CS對結直腸癌細胞HCT-116 caspase-3活力的影響Fig. 6 Effect of chondroitin sulfate on caspase-3 activity in Colorectal cancer HCT-116 cells

3 結 論

癌癥最典型的特征是異常細胞超越正常范圍的增殖，抑制癌細胞的增殖是許多抗癌藥物的主要作用機制。鱘魚CS可以使結直腸癌細胞的增殖能力下降，對癌細胞生長最大抑制率可達90%。通過對鱘魚CS處理后細胞周期、凋亡的測定發現，隨鱘魚CS質量濃度的增加，細胞周期S期變短，DNA合成期的細胞數減少，阻滯細胞周期，引起細胞內凋亡酶活力的增加，使細胞形態、結構發生改變，貼壁能力降低，從而引起了細胞凋亡現象的產生。本研究初步判定了鱘魚CS可以引起結直腸癌細胞的凋亡，為進一步開發CS的食用、藥用價值提供理論依據。

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Inhibitory Effect of Chondroitin Sulfate from Sturgeon Bone on Colorectal Cancer Cells

WU Ruiyun1,2, LIU Lei2, ZHANG Jinlan2, CHEN Guilin1,*, LI Pinglan2,*

(1. College of Life Sciences, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China;2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Objective: This study is aimed to investigate the inhibitory effect of chondroitin sulfate from sturgeon bone on the proliferation of colorectal cancer cells and to elucidate the underlying mechanism. Methods: Three representative colorectal cancer cells (Caco-2, HCT-116, and SW480) were used in this study. Cell growth and proliferation was tested by cell counting kit-8（CCK-8) method. Colorectal cancer cell line HCT-116 was used to further investigate the pro-apoptotic ability of sturgeon chondroitin sulfate. Cell cycle and apoptosis were determined by flow cytometry. Cell morphology was observed after cell staining. Apoptosis was evaluated by caspase-3 activity. Our study indicated that sturgeon chondroitin sulfate significantly inhibit the cell proliferation of Caco-2, HCT-116 and SW480 cells with a percentage suppression of 70.94%,90.00% and 75.00%, respectively. After sturgeon chondroitin sulfate treatment, the G1/G0 phase increased to 88.56% and the S phase declined to 4.47%. Meanwhile, sturgeon chondroitin sulfate-treated cells exhibited morphological changes, nuclear pyknosis and cell fragmentation, and significantly increased apoptotic enzyme activity (1 645 IU/μg) with an apoptosis rate of 63.73%.Sturgeon chondroitin sulfate showed potential anticancer activity, which will make it a new functional food ingredient.

sturgeon chondroitin sulfate; colorectal cancer; cell proliferation; apoptosis

10.7506/spkx1002-6630-201721036

Q255

A

1002-6630（2017）21-0223-07

武瑞赟, 劉蕾, 張金蘭, 等. 鱘魚硫酸軟骨素對結直腸癌細胞抑制作用[J]. 食品科學, 2017, 38(21): 223-229.

10.7506/spkx1002-6630-201721036. http://www.spkx.net.cn

WU Ruiyun, LIU Lei, ZHANG Jinlan, et al. Inhibitory effect of chondroitin sulfate from sturgeon bone on colorectal cancer cells[J]. Food Science, 2017, 38(21): 223-229. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721036.http://www.spkx.net.cn

2017-04-27

北京市鱘魚、鮭鱒魚創新團隊項目（SCGWZJ201711）

武瑞赟（1990—），女，碩士研究生，研究方向為生物技術。E-mail：wuruiyun814@163.com

*通信作者：陳貴林（1961—），男，教授，博士，研究方向為藥用植物化學。E-mail：guilinchen61@163.com李平蘭（1964—），女，教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：lipinglan@cau.edu.cn