丹參CYP76AH1轉(zhuǎn)基因毛狀根的建立及其蛋白的分離

齊夢蝶　王健　馬曉晶　張權(quán)　王方方　康瑩　劉勇 林慧馨

[摘要]蛋白質(zhì)復(fù)合物參與植物多種次生代謝物的合成，其分離對闡明植物次生代謝及提高體外催化效率至關(guān)重要。該研究構(gòu)建了過表達丹參酮合成途徑關(guān)鍵酶CYP76AH1的轉(zhuǎn)基因毛狀根株系，通過Western雜交篩選得到高表達CYP76AH1蛋白的丹參轉(zhuǎn)基因毛狀根，并以此作為后續(xù)提取丹參酮合成途徑中蛋白質(zhì)復(fù)合物的組培材料。通過優(yōu)化蛋白提取緩沖液中的去污劑種類和濃度，篩選出含05% Triton X100的緩沖液為最佳提取緩沖液，并分離得到相對大量的可溶性CYP76AH1蛋白質(zhì)。該研究為后續(xù)進一步分離純化與CYP76AH1相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合物奠定了基礎(chǔ)，也為深度解析丹參酮合成代謝通路提供思路。

[關(guān)鍵詞]蛋白質(zhì)復(fù)合物； 次生代謝物； 丹參酮； CYP76AH1； 轉(zhuǎn)基因毛狀根； 去污劑

[Abstract]Protein complexes are involved in the synthesis of multiple secondary metabolites in plants， and their separation is essential to elucidate plant secondary metabolism and improve in vitro catalytic efficiency In this study， the transgenic hairy roots of CYP76AH1， a key enzyme of tanshinone synthesis pathway， was constructed and the transgenic hairy roots of Danshen overexpressing CYP76AH1 protein were screened by Western blotting and used as a tissue culture material for the subsequent extraction of protein complex in tanshinone synthesis pathway By optimizing the type and concentration of the detergent in the protein extraction buffer， the buffer containing 05% Triton X100 was selected as the best extraction buffer， and a relatively large amount of soluble CYP76AH1 protein was isolated This study lays the foundation for the further separation and purification of protein complexes interacting with CYP76AH1， and provides the idea for deep analysis of tanshinone metabolic pathway.

[Key words]protein complexes； secondary metabolism； tanshinone； CYP76AH1； transgenic hairy root； detergent

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰之功效，是最常用的活血化瘀類中藥之一[1]。丹參的主要成分丹參酮[2]是松香烷型二萜化合物，不僅具有抗腫瘤活性[34]，同時具有治療心腦血管疾病的作用[5]，在臨床上應(yīng)用廣泛。丹參在我國分布廣泛，但是隨著丹參需求量劇增，野生丹參資源已不能滿足市場需求，而各地栽培的丹參質(zhì)量參差不齊，有效成分含量低，這已成為丹參作為高品質(zhì)植物藥大規(guī)模進軍國際市場的一個最大障礙。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，研究丹參酮等次生代謝物的生物合成途徑，分離參與該途徑的蛋白質(zhì)復(fù)合物，闡明相關(guān)蛋白之間相互作用，利用合成生物學(xué)手段，實現(xiàn)丹參酮異源高效生產(chǎn)將是大量獲取丹參酮，緩解供給壓力最有潛力的方法之一。

研究表明在包括多胺類[6]、黃酮類[7]、苯丙素類[8]等多種次生代謝物生物合成途徑中，催化酶類可以相互作用形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，共同催化產(chǎn)物合成。在丹參酮合成途徑中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SmCPS和SmKSL相互作用催化次丹參酮二烯的合成[9]。丹參CYP450蛋白CYP76AH1為丹參酮合成的關(guān)鍵酶[10]（圖 1）。利用CYP76AH1作為誘餌，將可能分離到與該關(guān)鍵酶相互作用的其他催化酶類。為了探索丹參酮合成途徑下游的蛋白質(zhì)復(fù)合物，本研究擬利用標簽抗體，通過親和純化方法分離與丹參酮合成關(guān)鍵酶CYP76AH1的相互作用蛋白，進而分離參與丹參酮合成的蛋白質(zhì)復(fù)合物。而上述研究的基礎(chǔ)是獲得高表達CYP76AH1融合蛋白的轉(zhuǎn)基因植株及可溶性CYP76AH1融合蛋白。

本研究將CYP76AH1克隆進包含F(xiàn)lag表達標簽的雙元載體，轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1，侵染紫花丹參葉片外植體，獲得多個轉(zhuǎn)基因毛狀根株系。通過Western雜交篩選出高表達CYP76AH1的轉(zhuǎn)基因毛狀根。在進行親和純化的過程中，所有的蛋白必須以可溶的形式存在于緩沖液里，否則難以進行分離純化。為了得到可溶性的CYP76AH1融合蛋白，作者對蛋白提取緩沖液的去污劑種類及去污劑濃度進行了優(yōu)化，最終獲得了適合CYP76AH1蛋白分離的提取緩沖液。本研究為后續(xù)分離與CYP76AH1相互作用蛋白奠定了基礎(chǔ)。

1材料

丹參來自中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心實驗室保存株系，中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心郝近大研究員鑒定為丹參S miltiorrhiza。所有的大腸桿菌菌株均購自全式金生物科技公司。KOD聚合酶購自日本TOYOBO公司，瓊脂糖膠回收試劑盒，Page Ruler Prestained Protein Ladder購自Thermo Fisher公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司，pEASYBlunt Zero Cloning Kit，pEASYUni Seamless Cloning and Assembly Kit，DNA marker，AntiDYKDDDDK Mouse mAb，Goat AntiMouse lgG購自全式金生物科技公司，Protease Inhibitor Cocktail購自Roche公司，ECL Plus Detection Reagent購自蘭博利德公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。引物合成和測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。endprint

2方法

21CYP76AH1Flag雙元載體的構(gòu)建根據(jù)CYP76AH1基因和載體pCAMBIA1300cFlag序列設(shè)計引物，1300cFlagAH1F：cggggtcgacatttaaataATGGATTCTTTTCCTCTC，1300cFlagAH1R： gtccatggtaccggatccactagAGACTTAACTATTGGGAT，以實驗室保存的pESCHisCYP76AH1質(zhì)粒為模板進行擴增，用pEASYUni Seamless Cloning and Assembly Kit進行連接，構(gòu)建重組載體，具體實驗步驟根據(jù)試劑盒說明書操作進行。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans1T1感受態(tài)細胞上，在含有卡納霉素的LB培養(yǎng)板（終濃度為50 mg·L-1）上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆進行菌落PCR檢測，經(jīng)測序驗證，命名為CYP76AH1cFlag。

22農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒CYP76AH1cFlag轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1感受態(tài)細胞。取100 μL凍融的感受態(tài)細胞，加入cFlagCYP76AH1重組質(zhì)粒1 μg，輕輕混勻，冰浴30 min。液氮速凍1 min，37 ℃水浴5 min，冰浴2 min。加入600 μL LB液體培養(yǎng)基，28 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)4 h，使細胞復(fù)蘇，培養(yǎng)結(jié)束后將菌液涂布于含有利福平和卡納霉素的固體LB培養(yǎng)基，28 ℃溫箱培養(yǎng)2 d，挑取農(nóng)桿菌單克隆進行PCR驗證。

23丹參轉(zhuǎn)基因毛狀根的誘導(dǎo)選取幼嫩的丹參無菌苗葉片，將葉片剪成1 cm2的小塊，置于包含CYP76AH1cFlag質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液中，浸染8 min。將侵染后的葉片用無菌濾紙吸去農(nóng)桿菌菌液，置于MS固體培養(yǎng)基上，于暗處共培養(yǎng)。48 h后將共培養(yǎng)后的外植體用無菌水清洗5次，吸干水后移至含5 mg·L-1潮霉素和400 mg·L-1頭孢菌素的MS固體培養(yǎng)基上，于黑暗條件篩選培養(yǎng)。每2星期更換1次培養(yǎng)基，將長至3 cm以上抗性毛狀根切下單獨標號繼代培養(yǎng)，多次繼代后轉(zhuǎn)移至6，7V培養(yǎng)液中搖瓶培養(yǎng)。

24高表達轉(zhuǎn)基因毛狀根株系的篩選選取生長健壯的丹參毛狀根株系，稱取01 g材料，徹底粉碎后加入200 μL 1×SDS蛋白上樣緩沖液，混勻后，沸水浴10 min，離心后取上清進行SDS聚丙烯凝膠電泳。蛋白經(jīng)電泳分離后，電轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用常規(guī)免疫雜交程序進行Western blotting檢測，一抗為AntiDYKDDDDKMouse mAb，二抗為HRP標記的山羊抗小鼠。雜交結(jié)束后，用ECL Plus 發(fā)光液孵育1 min，置于Biorad檢測儀中檢測。

25非變性CYP76AH1cFlag融合蛋白提取緩沖液的優(yōu)化根據(jù)發(fā)表文獻[10]，配制蛋白提取緩沖液（10 mmol·L-1TrisHCl pH 74，150 mmol·L-1 NaCl，2 mmol·L-1 EDTA，05% NP40，1×protease inhibitor）。在此基礎(chǔ)上首先優(yōu)化不同種類的去污劑，即將提取緩沖液中的05% NP40換成2% NP40，2% Triton x100，2% SDS，2% Tween20；最后進行05%，1%，2% 3個梯度的優(yōu)化。

3結(jié)果與分析

31CYP76AH1cFlag雙元載體的構(gòu)建以本實驗室保存的pESCHisCYP76AH1為模板，特異擴增出1條1 500 bp左右的DNA片段，與CYP76AH1基因的大小一致（圖2 A）。將此DNA片段以重組的方法構(gòu)建至雙元載體pCAMBIA1300Flag的Super 啟動子下游。測序結(jié)果顯示與目的基因的序列一致，并且和下游的Flag標簽序列正確融合，說明CYP76AH1基因已經(jīng)構(gòu)建到pCAMBIA1300cFlag載體上（圖2 B），命名為CYP76AH1cFlag。

ACYP76AH1cFlag的菌落PCR鑒定；MDNA Marker；1CYP76AH1基因片段；B質(zhì)粒CYP76AH1cFlag的圖譜。

32CYP76AH1轉(zhuǎn)基因毛狀根的獲得用分別轉(zhuǎn)入空載體pCAMBIA1300Flag和CYP76AH1cFlag的發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1，侵染健壯的丹參葉片外植體，大約1個月后，在抗性培養(yǎng)基上成功誘導(dǎo)出大量的丹參毛狀根（圖 3）。選擇粗壯且生長迅速的毛狀根轉(zhuǎn)入搖瓶培養(yǎng)，并對其進行Western雜交檢測融合蛋白的表達量。在轉(zhuǎn)空載體的對照樣品中檢測不到蛋白表達，而在轉(zhuǎn)CYP76AH1cFlag的多株毛狀根中都檢測了1個比55 kDa分子量略大的條帶（圖4）。CYP76AH1cFlag蛋白的預(yù)期相對分子質(zhì)量約為59 kDa。因此，本研究認為此條帶就是CYP76AH1cFlag的雜交信號，CYP76AH1在毛狀根中成功表達。其中選擇雜交條帶較強、表達量較高、生長迅速的毛狀根及對照株系擴大培養(yǎng)，進行后續(xù)研究。

ACYP76AH1轉(zhuǎn)基因毛狀根；B空質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因毛狀根。

1～8.不同株系毛狀根轉(zhuǎn)基因；9.轉(zhuǎn)空載體毛狀根；M.蛋白質(zhì)分子量標準。

33CYP76AH1蛋白提取緩沖液的優(yōu)化在上述研究中，CYP76AH1cFlag是以變性蛋白的形式被提取出來。這種提取方法只適合進行Western blotting檢測，并不適合后續(xù)擬進行的親和純化研究。為了在溫和條件下分離CYP76AH1Flag蛋白，根據(jù)文獻[10]中的實驗方法配制緩沖液，提取CYP76AH1cFlag蛋白，但通過Western并未檢測到目的蛋白。蛋白提取緩沖液中對蛋白溶解性影響最大的是去污劑的種類和濃度，因此本文在該方法基礎(chǔ)上，對緩沖液中的去污劑進行了一系列優(yōu)化。

首先選擇常用的4種去污劑SDS，Tween20，Triton X100，NP40，并都以2%的濃度替換原始緩沖液中的05% NP40。取等量的轉(zhuǎn)基因毛狀根，液氮速凍后打成細粉，分別加入等量的提取緩沖液，混合均勻后，于冰上放置15 min后，離心取上清，進行western blotting檢測，比較4種去污劑的效果。其中SDS，NP40和Triton X100在2%的濃度下都有較好的提取效果，Tween20只能提出少量目的蛋白。但是SDS具有較強的蛋白質(zhì)變性作用，不利于保持蛋白的空間結(jié)構(gòu)，不適合用于分離互作蛋白。于是選取NP40和Triton X100進行后續(xù)研究（圖5）。endprint

1～4.含2%SDS，2% Tween20，2% Triton X100，2% NP40緩沖液提取融合蛋白結(jié)果；M.蛋白質(zhì)分子量標準；CK.轉(zhuǎn)空質(zhì)粒毛狀根對照。

選擇3個濃度梯度，即05%，1%，2%的NP40和Triton X100替換原始提取緩沖液中的去污劑，嘗試提取效果。NP40的提取效果受濃度的影響很大。用包含05% NP40緩沖液提取的樣品中檢測不到目的蛋白；NP40濃度增加到1%時，目的蛋白能被檢測到，但是條帶很弱；而用包含2% NP40的緩沖液能夠得到最大量的目的蛋白（圖6）。和NP40不同的是，不同濃度的Triton X100提取效果變化不明顯，3個濃度都有較好的提取效果，即使05%的濃度也能分離出較多的目的蛋白。分離的目的蛋白主要準備用于下游的免疫親和純化以分離相互作用蛋白，而較低的去污劑濃度有利于維持蛋白的空間結(jié)構(gòu)及其與其他蛋白的相互作用。綜合上述實驗結(jié)果，篩選出05% Triton X100作為提取緩沖液的去污劑成分以分離CYP76AH1cFlag蛋白。

1～6.含05%Triton X100，1%Triton X100，2%Triton X100，05%NP40，1%NP40，2%NP40緩沖液提取融合蛋白結(jié)果；M.蛋白質(zhì)分子量標準；CK.轉(zhuǎn)空質(zhì)粒毛狀根對照。

4討論

基于比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)尋找差異表達基因，從中挖掘參與植物次生代謝的關(guān)鍵基因，已經(jīng)成為闡明植物次生代謝途徑的主要手段。但是上述方法也存在測序質(zhì)量不高、基因同源性低、基因注釋不準確、只能分離差異表達基因等局限性。近年來，利用免疫親和純化的方法，分離相互作用蛋白，尋找參與植物次生代謝關(guān)鍵酶得到了很大的發(fā)展[1113]。CYP76AH1是丹參酮合成途徑中的一個關(guān)鍵酶，用這個蛋白作為誘餌（Bait），分離相互作用蛋白，有可能分離到參與丹參酮合成的重要合成酶和調(diào)控因子[14]。因此構(gòu)建了高表達CYP76AH1的轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根。

CYP76AH1蛋白的N末端有一個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，因此CYP76AH1與細胞的膜系統(tǒng)結(jié)合較為緊密，不易得到可溶性蛋白，而可溶性蛋白是進行后續(xù)免疫親和純化的前提和必要條件。去污劑是蛋白提取緩沖液中的重要成分。常見的去污劑有離子型去污劑和非離子型去污劑。SDS是陰離子去污劑，幾乎可以溶解所有的蛋白。但是SDS會使蛋白質(zhì)變性、破壞蛋白間的相互作用。而非離子型去污劑可以破壞蛋白質(zhì)與脂質(zhì)間的連接，促進蛋白質(zhì)的溶解和分離，較好地維持蛋白質(zhì)間的相互作用。為此，本研究以SDS作為陽性對照，選擇了NP40，Triton X100，Tween20這3種非離子去污劑，優(yōu)化提取緩沖液。結(jié)果表明，含有較高濃度（2%）的NP40和Triton X100的緩沖液都有較好的提取效果。而較低的去污劑濃度更有利于保持蛋白的空間結(jié)構(gòu)及其與其他蛋白的相互作用，于是進一步篩選了去污劑的濃度。最終認為含有05% Triton X100的提取緩沖液最適于后續(xù)研究。本研究為利用免疫親和純化技術(shù)，分離CYP76AH1的相互作用蛋白，進而深入闡明丹參酮生物合成途徑奠定了基礎(chǔ)。

[參考文獻]

[1]馬丙祥，董寵凱丹參的藥理作用研究新進展[J]. 中國藥房，2014，25（7）：663.

[2]袁媛， 吳芹，石京山，等. 丹參及其主要成分保肝作用的研究進展[J]. 中國中藥雜志，2015，40（4）：588.

[3]Chen X，Guo J，Bao J， et al The anticancer properties of Salvia miltiorrhiza Bunge （Danshen）： a systematic review[J]. Med Res Rev， 2014，34：768.

[4]Zhang Y， Jiang P， Ye M， et al Tanshinones： sources， pharmacokinetics and anticancer activities[J]. Int J Mol Sci， 2012，13：13621.

[5]劉莉嘉，楊鑫，彭玉帥，等. 丹參酮生物合成的關(guān)鍵酶研究進展[J]. 中草藥，2015，46（1）：140.

[6]Winkel B S Metabolic channeling in plants[J]. Annu Rev Plant Biol，2004，55：85.

[7]Jorgensen K， Rasmussen A V，Morant M， et al Metabolon formation and metabolic channeling in the biosynthesis of plant natural products[J]. Curr Opin Plant Biol， 2005， 8：280.

[8]Sweetlove L J，F(xiàn)ernie A R The spatial organization of metabolism within the plant cell[J]. Annu Rev Plant Biol，2013，64：723.

[9]Zhou Y J， Gao W， Rong Q X，et al Modular pathway engineering of diterpenoid synthases and the mevalonic acid pathway for miltiradiene production[J]. J Am Chem Soc， 2012，134（6）： 3234.

[10]Guo J， Zhou Y J，Hillwig M L， et al CYP76AH1 catalyzes turnover of miltiradiene in tanshinones biosynthesis and enables heterologous production of ferruginol in yeasts[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2013， 110：12108.

[11]Lin H， Yang Y，Quan R， et al Phosphorylation of SOS3like calcium binding protein8 by SOS2 protein kinase stabilizes their protein complex and regulates salt tolerance in Arabidopsis[J]. TP Cell， 2009， 21：1607.

[12]Panicot M，Minguet E G，F(xiàn)errando A， et al A polyamine metabolon involving aminopropyl transferase complexes in Arabidopsis[J]. TP Cell， 2002， 14：2539.

[13]Lallemand B，Erhardt M，Heitz T， et al Sporopollenin biosynthetic enzymes interact and constitute a metabolon localized to the endoplasmic reticulum of tapetumcells[J]. Plant Physiol， 2013， 162：616.

[14]K wiatkowska M，Polit J T，Stepinski D， et al Lipotubuloids in ovary epidermis of Ornithogalum umbellatum act as metabolons： suggestion of the name ′lipotubuloid metabolon′[J]. J Exp Bot， 2015， 66：1157.

[15]樊同濤，樊小農(nóng)，麻聰聰，等. 免疫共沉淀技術(shù)的應(yīng)用研究[J]. 中華針灸電子雜志， 2014，3（4）：13

[責任編輯呂冬梅]endprint