狼尾草中草藥型青貯添加劑的篩選及優(yōu)化

李振武++陸烝++黃秀聲++林忠寧++應朝陽++韓海東

摘要 本研究旨在從10種中草藥中篩選出2～3種組成復方中草藥型青貯添加劑，使得該青貯添加劑能夠促進狼尾草自帶的乳酸菌生長，進而達到改善狼尾草青貯發(fā)酵品質(zhì)的目的。首先采用單因素試驗研究了不同濃度的5種補益類中草藥和5種清熱解毒類中草藥提取液對乳酸菌（從新鮮狼尾草葉片表面分離）生長的影響，以對乳酸菌生長的促進率為指標，篩選出黃芪、五味子和金銀花組成復方中草藥型青貯添加劑；再采用正交試驗對該復方中草藥型青貯添加劑各組分含量進行優(yōu)化。結(jié)果表明，狼尾草中草藥型青貯添加劑的最優(yōu)配方為2.00%黃芪提取液、1.00%五味子提取液、1.00%金銀花提取液。

關(guān)鍵詞 狼尾草；中草藥；青貯添加劑；優(yōu)化

中圖分類號 S816.5+3 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）20-0221-003

Screening and Optimization of Chinese Herbal Medicine Additives for Chinese pennisetum silage

LI Zhen-wu 1 LU Zheng 1 HUANG Xiu-sheng 1，2 LIN Zhong-ning 1 YING Zhao-yang 1，2 HANG Hai-dong 1 *

（1 Agricultural Ecology Institute，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou Fujian 350013； 2 Fujian Engineering and Technology Research Center for Circular Agriculture）

Abstract The purpose of this study was to screen out 2-3 kinds of Chinese herbal medicine composition from 10 kinds of Chinese herbal medicine to compose Chinese herbal medicine silage additives，which could promote the growth of lactic acid bacteria isolated from Chinese Pennisetum，so as to improve the quality of Chinese Pennisetum silage.Firstly，single factor experiments were conducted to evaluate the effects of different concentrations of 5 kinds of tonic Chinese herbal medicine and 5 kinds of heat clearing and detoxifying herbs extract on growth of lactic acid bacteria（isolated from fresh leaves of Chinese pennisetum）in vitro.The results showed that Astragali radix，Schisandrae chinensis fructus and Lonicerae japonicae Flos were the best components of the compound Chinese herbal medicine silage additive which promoted the growth of lactic acid bacteria.Furthermore，the orthogonal tests were used to optimize the doses of the compound Chinese herbal medicine silage additive.The results showed that the optimum doses of the compound Chinese herbal medicine additive for Chinese pennisetum silage were of 2.00% Astragali radix extract，1.00% Schisandrae chinensis fructus extract and 1.00% Lonicerae japonicae Flos extract.

Key words Chinese pennisetum；Chinese herbal medicine；silage additives；optimization

狼尾草（Chinese pennisetum）為多年生禾本科牧草，具有產(chǎn)量高、耐刈割、適口性好等特點，是草食家畜的優(yōu)質(zhì)青飼料，在南方紅壤地區(qū)得到了廣泛的推廣和應用[1]。狼尾草的盛產(chǎn)期集中在夏季，在夏季對狼尾草進行青貯有利于狼尾草季節(jié)性均衡供應和提高其利用效率。近年來科技工作者對狼尾草的青貯技術(shù)開展了大量的研究，主要集中在狼尾草低水分青貯、混合青貯和添加劑青貯等方面[2-4]。目前，狼尾草青貯應用較多的青貯添加劑為乳酸菌制劑，市場上乳酸菌制劑是通用型的青貯添加劑，所用乳酸菌主要分離自外界環(huán)境，這些菌株由于生活環(huán)境與狼尾草生長環(huán)境相差甚遠，致使乳酸菌在狼尾草青貯料中的適應力不強、生長性能差，導致青貯效果不理想。因此，篩選出價格便宜并可以改善狼尾草青貯品質(zhì)的專用青貯添加劑，對狼尾草在南方養(yǎng)牛業(yè)中的高效利用具有重要的意義。前人研究表明，許多補益類中草藥對乳酸菌的生長有促進作用，許多清熱解毒類中草藥有抑菌作用[5-6]。本研究正是利用中草藥的這一特性，從狼尾草中分離乳酸菌，以對乳酸菌生長的促進率為指標，篩選出3種中草藥組成狼尾草專用的中草藥型青貯添加劑。endprint

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供篩選作為狼尾草青貯添加劑的中草藥有黃芪、五味子、枸杞、當歸、熟地5種補益類中草藥以及金銀花、青蒿、瓜蔞、魚腥草、決明5種清熱解毒類中草藥。以上10種中草藥均購自福建醫(yī)藥大學國醫(yī)堂。乳酸菌由生長旺盛的閩牧2號雜交狼尾草葉片表面分離純化，閩牧2號雜交狼尾草由福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所牧草品種資源圃提供。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 單因素試驗。對以上10種中草藥添加劑分別進行單因素試驗，以對乳酸菌生長的促進率為指標，研究不同添加劑不同濃度對狼尾草葉片表面乳酸菌增殖的影響。從添加劑的成本考慮，添加劑的添加濃度不宜超過2.00%，因而選擇的添加劑濃度分別為0.25%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%。

1.2.2 正交優(yōu)化試驗。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，從補益類中草藥中篩選出黃芪、五味子，從清熱解毒類中草藥中篩選出金銀花組成復方中草藥型青貯添加劑。采用正交試驗對添加劑各組分添加量進行優(yōu)化。試驗采用3因素3水平5重復的正交設(shè)計，選用L9（33）正交表，試驗因素為五味子提取液、黃芪提取液、金銀花提取液。正交試驗各因素水平表如表1所示。

1.3 試驗方法

1.3.1 中草藥型青貯添加劑制備。將各供試中草藥置于60 ℃干燥箱中烘至恒重，稱取中草藥25 g，用250 mL去離子水浸泡30 min后煎煮，沸后文火煎煮30 min，用孔徑為1 mm的4層紗布進行第1次過濾得到第1次濾液和藥渣。然后在藥渣中加入150 mL去離子水，文火煎煮30 min后進行第2次過濾，棄掉濾渣。將2次所得濾液合并后，文火煎煮濃縮至25 mL，使藥液終濃度為1 g/mL，即為100%中草藥原液，將中草藥原液高壓滅菌后，置于4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆肹7]。

1.3.2 狼尾草乳酸菌提取純化及鑒定。稱取生長旺盛、新鮮的閩牧2號狼尾草葉片5 g，將其剪成長1 cm左右的小段，放入50 mL的MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃靜止培養(yǎng)72 h，取培養(yǎng)72 h的狼尾草MRS發(fā)酵液0.5 mL接種于9.5 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，室內(nèi)厭氧培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)5代后，用滅菌的移液器吸取0.2 mL培養(yǎng)液滴入HORIBA B-212型微量pH計測定pH值。將72 h之后pH值高于4.0的菌液淘汰，之后繼續(xù)繼代培養(yǎng)，隨時淘汰pH值高于4.0的菌液。經(jīng)過10代左右的繼代培養(yǎng)，選出一個菌系，其pH值繼代培養(yǎng)穩(wěn)定且低于4.0。取0.5 mL生長旺盛的菌液，轉(zhuǎn)入裝有4.5 mL無菌水的試管中，充分混勻，依照該方法稀釋直到10-8倍，然后取0.1 mL在含有瓊脂的MRS培養(yǎng)基平板上涂皿，30 ℃靜止厭氧培養(yǎng)。從平板中選擇典型的菌落在同樣的平板上劃線分離培養(yǎng)，直到得到純的單個菌株，保存?zhèn)溆肹8]。

根據(jù)凌代文[9]的方法對菌株進行鑒定。凡是革蘭氏陽性、過氧化氫酶試驗陰性的菌株初步確定為乳酸菌，然后進行乳酸菌屬的鑒定試驗。乳酸菌屬的鑒定需要做硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、H2S產(chǎn)生試驗、運動性試驗、15 ℃及45 ℃的生長試驗。

1.3.3 添加劑對乳酸菌生長的影響。從斜面上挑取適量菌苔，于MRS平板上劃線活化，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至菌體生長。挑取平板上的單菌落，接入MRS液體培養(yǎng)基中，靜置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌液渾濁，用生理鹽水對菌液進行106倍稀釋后，置于磁力攪拌器上攪拌30～40 min。用2×MRS液體培養(yǎng)基將受試藥物進行梯度稀釋，獲得4.00%、3.00%、2.00%、1.00%、0.50%的梯度溶液。在96孔板上加入梯度溶液100 μL（以2×MRS液體培養(yǎng)基為對照，藥物濃度為0.00%），并加入100 μL工作菌液，各藥物終濃度為0.00%、0.25%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%，每個濃度點設(shè)5個平行。由于有些中草藥提取液的顏色很深，恐有干擾，故另取一個96孔板，以100 μL生理鹽水代替工作菌液，用于對各濃點的體系進行監(jiān)控，并對各濃度體系的本底值進行檢測，各設(shè)2個平行。將96孔板靜置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，經(jīng)振蕩混勻，用酶標儀檢測OD600值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

將試驗組及對照組的OD600值扣除對應濃度點的本底值，即為各濃度點的OD600值。以促進率表征中草藥提取液對乳酸菌生長的影響，促進率（%）=（試驗組的OD600 ÷ 對照組的OD600 -1）×100。用Minitab16軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析[10]。單因素試驗數(shù)據(jù)采用Minitab16單因子方差分析，使用Tukey法對各組間平均數(shù)進行多重比較，結(jié)果表示為平均值+標準差；正交試驗數(shù)據(jù)的直觀分析采用Minitab16的田口分析得到均值響應表；正交試驗數(shù)據(jù)的方差分析采用Minitab16的一般線性模型，使用Tukey法配對比較，檢驗中使用校正的SS。

2 結(jié)果與分析

2.1 狼尾草葉片表面乳酸菌的鑒定

從狼尾草葉片表面分離的菌株革蘭氏染色為陽性、過氧化氫酶試驗為陰性、硝酸鹽還原試驗為陰性、不液化明膠、不產(chǎn)生硫化氫、無運動性都能在15 ℃和45 ℃條件下生長，根據(jù)乳酸菌定義[11]，確定為乳桿菌屬。

2.2 中草藥提取液對乳酸菌生長的影響

由表2、3可知，不同類型的中草藥提取液對乳酸菌的作用不同，即使是同一種中草藥提取液的不同濃度對乳酸菌的作用也不盡相同。5種補益類中草藥提取液中，各濃度的五味子、黃芪、當歸提取液均表現(xiàn)出對狼尾草乳酸菌生長有促進作用，當添加劑濃度越大時黃芪、當歸提取液對乳酸菌的促進作用越強，而五味子提取液則存在一個峰值，達到峰值以后，隨著添加劑濃度的提高，對乳酸菌的促進作用反而下降；枸杞提取液對狼尾草乳酸菌生長的作用不明顯，低濃度對乳酸菌生長有輕微的促進作用，高濃度對乳酸菌生長有輕微的抑制作用；熟地提取液在各濃度均表現(xiàn)出對狼尾草乳酸菌生長的抑制作用，添加劑濃度越大抑制作用越強。在試驗設(shè)定的添加濃度范圍內(nèi)，5種補益類中草藥中，1.00%五味子提取液對乳酸菌生長的促進作用最強，促進率為15.60%；2.00%黃芪提取液次之，對乳酸菌生長的促進率為13.88%。endprint