長三角地區兼用型鴨全基因組遺傳多樣性分析

章雙杰+王靖+楊建生+李慧芳+宋衛濤+許金根+華國浩+葉彩芳+林雨鑫+劉怡

摘要：為了全面了解長三角地區兼用型鴨的遺傳多樣性，對該地區婁門鴨、昆山麻鴨、巢湖鴨和高郵鴨的血液進行全基因組重測序分析。4個樣本平均的測序深度和覆蓋率分別為11.91×、97.19%；通過與北京鴨的基因組進行比對，婁門鴨、昆山麻鴨、巢湖鴨和高郵鴨分別檢測到7 733 429、8 161 310、7 324 728、7 986 534個SNP，1 145 846、1 239 348、958 379、1 121 697個Indel以及1 777、1 949、1 556、1 088個CNV，這些變異大部分坐落在基因間或基因內的內含子區；通過群體系統進化樹分析和CNV交集分析發現婁門鴨和昆山麻鴨為一類，巢湖鴨和高郵鴨為一類。

關鍵詞：長三角地區；鴨；全基因組；重測序；系統進化樹；拷貝數變異

中圖分類號： S834.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）17-0032-03

通信作者：楊建生，碩士，高級畜牧師，主要從事動物遺傳育種研究。E-mail：ksxmsyz@aliyun.com。畜禽遺傳資源及其多樣性是畜牧業可持續發展的種質基礎，也是滿足未來市場需求的重要基因庫。當前，全球畜禽遺傳資源的多樣性正日益減少，而我國地方種資源的保種狀況也不容樂觀[1]。我國地方鴨在世界鴨品種資源庫中占據了非常重要的位置，由于我國特有的地理條件（多泥灘、海涂、湖泊），養鴨業已成為我國重要的養殖產業[2]。地方鴨種質資源是鴨育種和生產的物質基礎，開展地方鴨品種資源評價和種質特性研究等工作，不但保護了品種的遺傳多樣性，還可以保證鴨育種工作能對環境、疾病和市場需求的變化作出及時有效的反應[3]。要成功有效地保護我國地方鴨品種遺傳資源，為我國地方鴨品種的育種提供有價值的遺傳素材，必須要了解這些資源的遺傳特性，并以此為依據采取相應的保護措施。

遺傳特性的研究涉及到多門學科，特別是近年來生物組學對其產生了深遠影響，其中，基因組學帶來的顛覆性技術之一是基因型鑒定（又稱基因分型）技術，其手段就是利用分子標記。目前，隨著高通量檢測和測序技術的發展，除簡單序列重復（SSR）和單核苷酸多態（SNP）標記在廣泛使用外，其他類型的標記已用得越來越少。而SNP 標記具有覆蓋全基因組、高通量、位點特異、共顯性遺傳、誤檢率低、開發和檢測成本急劇降低等優點，將成為未來基因型鑒定的主要標記類型[4]。與此同時，拷貝數變異（CNV）的研究也逐漸成為了動植物基因組研究的熱點，CNV 普遍存在于動植物基因組中，在家養動物中也發現了大量的 CNV，且CNV片段長度大，覆蓋了更大范圍的基因組序列，并已在豬[5]、牛[6]、羊[7]、雞[8]上鑒定出一些與重要性狀相關的變異，因此，CNV也可以作為一種強有力的分子標記應用于畜禽遺傳特性研究中。然而，目前關于中國地方鴨基因組的研究較為匱乏，目前國內僅對北京鴨進行了全基因組測序[9]。長三角地區是我國水禽生產最發達的地區，由于各地生態條件和社會經濟條件差異，逐漸形成了不同的地方種群或生態種群[10]。鑒于以上幾點，本研究通過第二代測序技術，對長三角地區的婁門鴨、昆山麻鴨、巢湖鴨和高郵鴨這4種兼用型鴨的全基因組進行了重測序，旨在為建立我國地方鴨品種或資源群的基因組檔案，并從分子水平上揭示了鴨品種遺傳變異的現狀，為地方鴨品種的保護與開發利用提供可靠的基礎資料和理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

本研究所用的4個鴨品種分別為婁門鴨、昆山麻鴨、巢湖鴨、高郵鴨。婁門鴨和昆山麻鴨來自昆山麻鴨原種場（婁門鴨和昆山麻鴨保種場），巢湖鴨來自安徽省廬江縣種鴨場（巢湖鴨保種場），高郵鴨來自江蘇省高郵市高郵鴨良種繁育中心（高郵鴨保種場）。試驗儀器和試劑見表1、表2。

表1試驗儀器

儀器生產商型號Qubit 2.0 FluorometerInvitrogenQ32866Magnetic Stand-96Life TechnologiesAM10027GeneAmp PCR System 9700Life Technologies4314878MicroCentrifugeEppendorf5418Agilent 2100 BioanalyzerAgilent G2939AAThermalStat PlusEppendorf5352 000.088cBot Clonal Amplification SystemIlluminaSY-301-2002HiSeq 2500 Sequencing SystemIlluminaSY-401-2501

1.2試驗方法

1.2.1血樣收集每種試驗鴨隨機選取3羽母鴨進行翅下靜脈采血，采集血量約2 mL并置于含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的離心管中，混勻后放入-80 ℃冰箱保存，用于后續基因組的提取。

1.2.2DNA的抽提與純化試驗采用DNeasy Blood & Tissue Kit， 根據生產廠商提供的標準操作流程進行樣本的 DNA 抽提及純化。純化后的DNA 經Qubit 20 Fluorometer和

表2試驗試劑

試劑生產商型號NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit

for Illumina NEB

E7370S/L

Agencourt AMPure XP BeadsBeckmanA63881DNeasy Blood & Tissue KitQiagen69506QubitTM dsDNA HS Assay KitInvitrogenQ32854Agilent High Sensitivity DNA KitAgilent5067-4626HiSeq PE Cluster Kit v4 IlluminaPE-401-4001HiSeq SBS Kit v4IlluminaFC-401-4003

08%瓊脂糖凝膠電泳進行質量檢測，合格的DNA可進行后續的測序試驗。

1.2.3文庫構建將每個品種鴨的3個基因組DNA混合，按照試驗說明書（NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumin）對基因組DNA進行片段化、末端修復、3′末端加A、連接接頭、富集等步驟，完成測序樣本文庫構建。所建文庫使用Qubit 2.0 Fluorometer檢測其濃度，使用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測文庫的大小。

1.2.4上機測序按照cBot User Guide （https：//support.illumina.com/downloads/cbot_user_guide_15006165.html） 所示相應流程，在Illummina HiSeq 2500 測序儀配套的 cBot 上完成簇生成和第一向測序引物雜交。按照HiSeq 2500 User Guide （https：//support.illumina.com/downloads/hiseq_2500_user_guide_15035786.html）準備測序試劑，將攜有簇的含有大量Cluster的芯片上機（儀器型號：HiSeq 2500 Sequencing System，Illumina）。選用paired-end 程序，進行2×125 nt 雙端測序。測序過程由 Illumina 提供的數據收集軟件進行控制，并進行實時數據分析。測序結果應用測序質量Q值進行評估，Q值與測序錯誤E值之間關系為Q=-10lgE。

1.2.5數據分析對4個樣本的全基因組測序數據進行常規基因組分析，包括數據預處理、基因組序列比對、SNP檢測及注釋、插入缺失標記（Indel）檢測及注釋、CNV檢測及注釋、SNV檢測及注釋、群體系統進化樹分析。其中序列比對是與北京鴨的基因組序列進行比對，采用的基因組版本為BGI_duck_1.0.81，參考基因組下載鏈接為ftp：//ftp.ensembl.org/pub/release81/fasta/anas_platyrhynchos/dna/Anas_platyrhynchos.BGI_duck_ 1.0.dna.toplevel.fa.gz。

2結果與分析

2.1測序質量評估

選擇4個品種的母鴨（每個品種3個個體）作為試驗材料，首先提取其基因組進行質量檢測。經檢測，所有樣本的濃度D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm均滿足全基因組重測序的建庫要求。將每個品種母鴨的基因組DNA樣本進行混合，并對這4個混合基因組DNA樣本測序。測序完成后，首先對所得的測序片段（reads）進行質量控制。由表3可知，經質量控制后，4個樣本reads數量的平均值為102.8 M（95.9～111.6 M），且錯誤率小于1%的測序數據（Q20）均高于95%。在進行序列比對和去除PCR重復之后，每個個體比對到基因組上的reads數平均值為100.6 M（94.8～110.1 M）。4個樣本平均的測序深度（指測序得到的總堿基數與待測基因組大小的比值）和覆蓋率分別為11.91×、9719%。因此，以上質量評估結果表明該數據能夠滿足后期分析的需要。表34個樣本的序列質量

品種Q20（%）reads的數量比對后reads數量比對率（%）覆蓋率（%）測序深度婁門鴨95.4195 913 24494 771 60198.8196.9111.73×昆山麻鴨95.77111 617 432110 094 46198.6497.1612.49×巢湖鴨95.2898 304 39095 063 50396.7097.2911.17×高郵鴨95.80105 406 198102 684 84997.4297.4012.24×

2.2SNP和Indel檢測

為了使比對的SNP和Indel的結果更加準確，對測序結果進行3步處理，第一步通過生物信息分析軟件Picard的Markdulicates工具標記重復PCR的reads，這樣可以去除因為PCR錯誤而導入的假陽性突變；第二步通過基因組分析軟件 Genome Analysis Toolkit（GATK）的IndelRealigner 工具對測序結果中存在的Indel位點或已知的Indel位點附近進行局部的多序列比對，減少因為插入缺失導致reads邊緣的假SNP位點；第三步是通過 GATK的BaseRecalibrator工具根據已知的突變信息對reads的堿基質量進行校正，使堿基質量符合實際，進一步減少假陽性。通過運用GATK UnifiedGenotyper軟件對這4個樣品的測序結果與北京鴨的基因組進行比對，得到了婁門鴨、昆山麻鴨、巢湖鴨和高郵鴨的SNP和Indel結果的vcf文件，婁門鴨、昆山麻鴨、巢湖鴨和高郵鴨分別檢測到 7 733 429、8 161 310、7 324 728、7 986 534個SNP，1 145 846、1 239 348、958 379、1 121 697個Indel。由表4、表5可知，這4個樣品的變異大部分坐落在基因間或基因內的內含子區。

2.3群體系統進化樹分析

通過SNPhylo軟件對測序后的變異文件（vcf文件）構建系統進化樹。該軟件工作流程為分析vcf文件，去除低質量位點，形成GDS 文件，根據連鎖不平衡選擇代表位點，根據所選位點構建比對序列，采用MUSCLE軟件進行比對，最后采用最大似然法構建系統進化樹。本試驗只篩選長度大于3 Mbp 的37個片段變異位點的vcf文件構建系統進化樹。其中測序深度控制值為5；最小等位基因頻率（maf）為 0.05；連鎖不平衡（LD）為 0.1。由圖1可知，婁門鴨和昆山麻鴨聚為表44種鴨全基因組SNP的分布情況個

品種外顯子基因上游基因下游基因間區內含子非翻譯區剪接區域其他婁門鴨65 749328 152298 9543 573 7552 425 9014 89632 5661 003 456昆山麻鴨68 470344 108312 6323 773 1632 564 3095 22134 3601 059 047巢湖鴨74 560391 167341 3893 360 3492 148 1064 58636 354968 217高郵鴨71 662353 911321 3723 700 2842 542 3595 06835 848956 030

表54種鴨全基因組Indel的分布情況個

品種外顯子基因上游基因下游基因間區內含子非翻譯區剪接區域其他婁門鴨3 76946 59346 573529 877362 2438623 151152 778昆山麻鴨4 00149 63849 857575 123390 9669303 268165 565巢湖鴨4 97754 77051 409433 254283 3367163 709126 208高郵鴨4 17049 32848 362515 746362 9838253 456136 827

一類，巢湖鴨和高郵鴨聚為一類。

2.4CNV檢測

通過與北京鴨的基因組進行比對，由表6可知，婁門鴨、昆山麻鴨、巢湖鴨和高郵鴨分別檢測到1 777、1 949、1 556、1 088 個CNV，拷貝數變異大部分坐落在基因間區。針對這些CNV，進一步做了這4種鴨的韋恩圖，由圖2可知，婁門鴨和昆山麻鴨共有的CNV達到了1 059個， 遠遠高于其他鴨所共有的CNV。因此，僅從CNV的檢測結果也能推斷出婁門鴨和昆山麻鴨具有較近的血緣關系。表64種鴨全基因組CNV的分布個

品種外顯子基因上游基因下游基因間區內含子非翻譯區剪接區域其他婁門鴨16516011681520891303昆山麻鴨19218311090222291330巢湖鴨20516612087235570101高郵鴨134946446812271198

3討論

當前種質資源的遺傳多樣性評價主要是通過利用分子標記限制性內切酶片段長度多態性（RFLP）、隨機擴增多態性DNA標記（RAPD）、簡單重復序列標記（SSR）等來檢測生物個體的基因型，雖然克服了形態學標記易受環境影響等缺點，但仍存在可供檢測的位點少、標記開發成本較高和通量小等不足[11]。雖然基因芯片的出現彌補了分子標記通量小的不足，但檢測成本依然過高，同時芯片上標記的數量仍受限制[12]。而本研究利用第二代測序技術，以北京鴨基因組作為對照，將 Illumina 測序產生的短片段與其比對，可快速獲取目標個體單核苷酸分辨率的變異位點數據，這種策略不僅更加全面、精確，而且通量高、準確度高。保證SNP 、Indel和CNV的準確性是評價種質資源遺傳多樣性最重要的前提，為了達到這一目標，應盡量提高測序的深度。測序深度（sequencing depth）是指測序得到的堿基總量與基因組大小的比值，它是評價測序量的指標之一。測序深度與基因組覆蓋度之間呈正相關，而與測序的錯誤率或假陽性結果呈負相關。在采用雙末端（paired-end）方案的情況下，當測序深度為10×至15×時，基因組覆蓋度和測序錯誤率均能夠得到保證[13]。本試驗中4個樣本的測序深度均大于11×，從而很大程度上降低了測序錯誤，保證了鑒定SNP 、Indel、CNV 的準確性。

為了進一步評估這4種鴨的遺傳多樣性，采用最大似然法將鑒定后的SNP和Indel構建了系統進化樹。進化樹又稱為系統發育樹，是一種用來描述各種生命實體之間進化關系的樹型結構。目前常見的進化樹構建方法有距離法、最大簡約法和最大似然法3種。而最大似然法是一種建立在進化模型上的統計方法，具有統計一致性、健壯性，能夠在一個統計框架內比較不同的樹以及充分利用原始數據等優點[14]，且大量研究表明，最大似然法比其他方法更準確[15]。

系統進化樹以及CNV鑒定結果均表明婁門鴨和昆山麻鴨為一類，巢湖鴨和高郵鴨為一類。婁門鴨和昆山麻鴨原產地均為江蘇省蘇州市，且昆山麻鴨是由婁門鴨導入北京鴨血統培育而成的[16]。巢湖鴨原產地為安徽省巢湖市，高郵鴨原產地為江蘇省高郵市，這2個鴨群體相比，婁門鴨和昆山麻鴨的地理位置分布較近。因此，系統進化樹和CNV的結果均與這4個鴨群體的生態地域分布和育成歷史相一致。目前，巢湖鴨和高郵鴨已被列入我國畜禽遺傳資源名錄，而婁門鴨和昆山麻鴨作為兼用型鴨，其產蛋性能和肉用性能也毫不遜色于其他鴨種[17]，且本研究發現這2個鴨品種與其他鴨品種的遺傳距離也較遠。因此，昆山麻鴨和婁門鴨作為長三角地區的優良兼用型鴨品種，應當加大其保種和開發利用力度。

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