宗地花豬BMPR—IB基因多態性與繁殖性狀的關聯性

林鵬飛+任麗群+李平+顧麗菊+李謙+燕志宏

實驗室/貴州大學動物科學學院，貴州貴陽 550025； 3.貴州省種畜禽種質測定中心，貴州貴陽 550018）摘要：為驗證BMPR-IB基因單核苷酸多態性（SNP）位點與宗地花豬繁殖性狀的關聯性，從而提高宗地花豬繁殖性能，提供有價值的分子輔助標記，推進宗地花豬的選育進程，以貴州宗地花豬經產母豬為試驗材料，利用DNA池和DNA直接測序方法檢測BMPR-IB基因的多態性，對各突變位點不同基因型個體與總產仔數、產活仔數、仔豬平均初生質量和母豬泌乳力性狀進行關聯性分析。在受試群體中發現，基因BMPR-IB有2個突變位點，G595C、C643T均位于第6外顯子，經產母豬總產仔數、產活仔數各基因型均表現為AA>AG>GG、BB>BT>TT，產活仔數為7頭的母豬泌乳力表現為AA基因型個體與AG、GG基因型個體間差異極顯著（P<0.01）；各基因型仔豬平均初生質量表現為 TT>BB>BT，但差異不顯著；母豬AA基因型總產仔數多于AG與GG基因型，AA基因型為優勢基因型，A為優勢等位基因；BB基因型在總產仔數、產活仔數的繁殖性狀中多于BT、TT基因型，BB為優勢基因型，B為優勢等位基因。推測等位基因A和等位基因B可能為宗地花豬總產仔數、產活仔數的有利等位基因，且AA基因型和BB基因型為有利基因型。

關鍵詞：宗地花豬；BMPR-IB基因；多態性；SNP位點；繁殖性狀；關聯性分析

中圖分類號： S828.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）17-0035-04

通信作者：燕志宏，教授，研究方向為動物遺傳育種與種質資源創新。E-mail：yzh611127@sina.com。骨形態發生蛋白受體（bone morphogenetic proteins receptor，簡稱BMPR）是骨形態發生蛋白（BMPs）發揮生理功能的基礎，BMPR屬于TGF-β受體超家族中的一個亞家族成員。BMPR可以分為Ⅰ和Ⅱ2種亞型，其中Ⅰ型受體可以分為BMPR-IA（ALK-3）、BMPR-IB（ALK-6）、ActR-IA（ALK-2），Ⅱ型受體則分為BMPR-Ⅱ、ActR-ⅡA、ActR-ⅡB等3種[1]。骨形態發生蛋白受體IB基因對繁殖性狀的影響最早是由Wilson等于1980年發現的，BMPR-IB基因突變后會引起母羊Booroola Merino高產。后來，BMPR-IB基因被改名為FecB基因[2]。

研究表明，BMPR-IB基因是與母豬的生殖系統、卵泡的生長發育、胚胎發育等密不可分的基因。試驗證明BMPR-IB基因在豬的顆粒細胞中有表達[3]。宋一萍對8個豬品種的BMPR-IB基因進行研究發現，在該基因的編碼區第 369 bp 處C突變成T，山東地方豬種中在該位點的AA基因型總產仔數、產活仔數分別比BB基因型多0.45、0.51頭/胎，但差異不顯著；在引進豬種中BB基因型母豬的總產仔數、產活仔數分別比AA型多1.05、 0.90頭/胎（P<0.05）[4]。孟洪莉以長白豬、大白豬、杜洛克豬、槐豬為研究對象，發現BMPR-IB基因在位點A1081C處，長白豬、大白豬和杜洛克豬的經產母豬的總產仔數和產活仔數均表現為AA>CC>AC，其中大白母豬AA基因型個體的總產仔數顯著高于AC基因型（P<0.05），AA基因型個體產活仔數極顯著高于AC基因型（P<0.01），杜洛克母豬AA基因型個體的產活仔數顯著高于CC基因型（P<0.05）；在該基因T19588A處，經產和初產長白母豬的TA基因型個體總產仔數和產活仔數顯著高于TT基因型（P<0.05）[5]。

宗地花豬是貴州省優良地方豬種之一，皮厚而糯、肉嫩味香，為人們所喜愛。但飼養周期長、產仔數少、生產效率低、成本高、養殖投入高、收益低等使宗地花豬養殖群體規模發展緩慢。針對宗地花豬的保種選育，相關機構和學者做了很多研究，推進了宗地花豬的開發利用。馮文豪等對宗地花豬的胴體肉質性狀進行測定，結果表明雖然宗地花豬瘦肉率明顯低于大白豬，但肉質性狀優于大白豬[6]。燕志宏等研究宗地花豬1世代的生長發育情況[7]，隨后在2011年研究了宗地花豬及其與長白豬、大白豬的雜種1代豬哺乳期和保育期的生長性能[8]。燕志宏等還對產區保種選育基礎群進行了繁殖性能的測定，隨后開始對宗地花豬繁殖性能的研究[9]。隨著分子生物學的蓬勃發展，燕志宏等分別對影響宗地花豬肉質和繁殖性狀的一些相關基因進行了研究，取得了一定的研究成果[10-14]。

1材料與方法

1.1試驗動物樣本

66頭宗地花豬經產母豬來自貴州紫薇畜牧業開發有限公司宗地花豬飼養場，各母豬均健康，在相同的環境和管理條件下進行飼養，用耳缺鉗采取每頭母豬耳根邊緣耳組織，放入裝有70%乙醇的1.5 mL離心管中，放入冰盒中帶回實驗室，于-20 ℃低溫冰箱中保存備用。

1.2試劑與儀器

主要試劑和儀器：Ezup柱式動物基因組DNA提取試劑盒、核酸染料、DL 2000 DNA Marker、 2×Taq Master Mix、瓊脂糖等，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；去離子水、無水乙醇、TAE緩沖液等試劑為實驗室自備。PCR擴增儀（PTC200，美國Bio-Rad公司）、凝膠成像系統（BioSens SC 710，美國Bio-Rad公司）、微量移液器（ACURA825，SOCOREX公司）。

1.3DNA提取

用基因組DNA提取試劑盒提取DNA，用含有核酸染料的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純度，并用紫外分光光度計測量每個樣品DNA濃度，共測3次，取其平均值，-20 ℃保存備用。

1.4引物設計及PCR擴增

參照美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI）提供的豬BMPR-IB基因序列（登錄號為NC-010450.3），利用Premier 5.0軟件結合Oligo 6.0軟件設計引物，應用NCBI Blast軟件檢測所設計引物的特異性（表1）。引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。1.5統計分析

利用DNAStar等軟件分析測序結果，篩選SNPs位點，分析不同位點在受試群體中的基因型頻率和遺傳特異性，并進行Hardy-Weinbery（哈迪-溫伯格）平衡檢測；根據最小二乘線性模型，分析不同基因型與樣本母豬繁殖性能[總產仔數、產活仔數、仔豬平均初生質量、泌乳力（即平均泌乳量）]的關聯效應。

2結果與分析

2.1PCR擴增

對66頭宗地花豬經產母豬進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均顯示為1條特異性條帶，其片斷長度分別為398、389 bp，與預期目標片段相符，且條帶清晰、整齊無拖尾（圖1），可用于測序。

2.2BMPR-IB基因DNA池PCR測序結果

將所得PCR產物送往北京諾賽基因組研究中心有限公司進行純化切膠回收測序，對所得序列運用SeqMan、BioXM等軟件進行分析比對，在BMPR-IB基因上發現2個SNPs位點，均位于第6外顯子上。測序峰如圖2所示。

2.3宗地花豬個體BMPR-IB基因測序結果分析

運用SeqMan軟件對所有樣品的測序結果分析發現，第6外顯子G595C位點處發生A→G堿基突變，由圖3可知，有3種基因型，分別命名為AA、AG、GG基因型。第6外顯子C643T位點處發生B→T堿基突變，發現3種基因型，分別命名為BB、BT、TT基因型，有2個等位基因B和T。通過序列比對發現，AA、BB基因型個體序列與GenBank上所提交的豬的基因序列一致，定義為野生型，GG、TT型則定義為突變型，AG、BT基因型定義為雜合型。

2.4基因型頻率及遺傳特異性分析

從群體遺傳學角度對宗地花豬BMPR-IB基因各SNP位點的基因型和等位基因頻率進行分析。由表2可見，在G595C位點上，AG 基因型頻率最高， 為優勢基因型， A等位基因頻率為52.27%，表現為優勢等位基因；對于C643T位點，優勢基因型為BB基因型，B為優勢等位基因。通過對

2.5不同基因型與繁殖性能的關聯分析

由表3可知，在宗地花豬母豬群中，總產仔數、產活仔數各基因型均表現為AA﹥AG﹥GG，AA基因型為優勢基因型，總產仔數和產活仔數均最多，A為優勢等位基因。方差分析結果表明，宗地花豬母豬總產仔數表現為AA基因型個體顯著高于AG、GG基因型個體，分別多產1.13、1.37頭/胎，AG基因型個體與GG基因型個體間總產仔數、產活仔數差異均不顯著；AA基因型個體產活仔數顯著高于AG、GG基因型個體，分別多產1.15、1.56頭/胎；GG基因型的仔豬平均初生質量最高，GG基因型為優勢基因型，3種基因型個體間仔豬平均初生質量差異不顯著；產活仔數為7頭/胎的母豬泌乳力表現為AA基因型個體與AG、GG基因型個體間差異極顯著，分別比AG、GG基因型高17.297、22.917 kg。由表3還可知，在宗地花豬母豬群中，總產仔數和產活仔數各基因型均表現為BB﹥BT﹥TT，BB基因型為優勢基因型，總產仔數和產活仔數均最多，B為優勢等位基因。方差分析結果表明，宗地花豬母豬總產仔數表現為BB基因型個體顯著高于BT、TT基因型個體，分別多產 1.06、2.06頭/胎，BT基因型個體顯著高于TT基因型個體，多產1.00頭/胎，BB基因型個體產活仔數顯著高于BT、TT基因型個體，分別多產1.04、1.56頭/胎；仔豬平均初生質量各基因型表現為TT﹥BB﹥BT，但各基因型間差異不顯著；產活仔數為7頭/胎的母豬泌乳力表現為BB基因型個體高于BT基因型個體，由于樣本數有限，無法判斷該位點TT基因型個體的平均泌乳力與BB、BT基因型之間的差異。

3討論

本試驗在宗地花豬母豬BMPR-IB基因第6外顯子上發現2個SNP位點，分別是分別是G595C和C643T，2個位點均為錯義突變，G595C導致編碼的天冬氨酸（aspartic acid，簡稱Asp）變為組氨酸（histidine，簡稱His），C643T位點導致編碼的精氨酸（arginine，簡稱Arg）變為色氨酸（tryptophan，簡稱Trp）。該基因G595C位點在宗地花豬群體中等位基因A、G的基因頻率分別為52.27%、47.73%，多態信息含量為 0.374 5，屬于中度多態（0.250.05）。結果表明，G595C位點在該試驗群體的選擇中均不易受到外界人為因素的干擾。同時這也表明，宗地花豬在該多態位點的遺傳變異較高，在以后的工作中應加強后備母豬基礎群的選育，進行有效的選擇與選育。該基因C643T位點在宗地花豬群體中等位基因B、T的基因頻率分別為83.33%、16.67%，等位基因B的頻率明顯高于等位基因T，該位點多態信息含量為 0.239 2，屬于低度多態（PIC<0.25），該位點在試驗群體中基因突變頻率低，該位點可提供的遺傳信息性較差，經卡方檢驗，該位點偏離了Hardy-Weinberg平衡（P<0.05），這可能是由該飼養場的宗地花豬群體樣本數不夠大引起的。C643T位點屬于低度多態，表明在以后宗地花豬繁殖性能的選種選育時，還須進一步擴大試驗群體進行試驗。

結果表明，在G595C位點上，宗地花豬母豬總產仔數、個體產活仔數均表現為AA基因型個體顯著高于AG、GG基因型個體，產活仔數為7頭/胎的母豬泌乳力表現為AA基因型個體與AG、GG基因型個體間差異極顯著（P<0.01）。綜合本試驗繁殖性狀指標，AA基因型母豬產仔數高，且哺乳能力強。在C643T位點上，宗地花豬母豬總產仔數表現為BB基因型個體顯著高于BT、TT基因型個體，BT基因型個體總產仔數又顯著高于TT基因型個體（P<0.05）；BB基因型個體產活仔數顯著高于BT、TT基因型個體。綜合本試驗繁殖性狀指標，BB基因型的母豬為高產母豬。

結果表明，BMPR-IB基因的G595C、C643T突變，均導致突變型經產母豬的產仔數下降，初步說明BMPR-IB基因的突變基因型可能會對經產母豬的產仔數有一定的抑制作用，這與宋一萍的研究結果[4]一致。Guan等研究表明，FecB基因對羔羊的初生質量沒有顯著影響[15]；楊華等對雜交羊的研究結果[16]與Guan等的結果一致。目前，還未見BMPR-IB基因對仔豬初生質量的影響報道，本試驗結果表明，BMPR-IB基因對仔豬初生質量沒有顯著影響。BMPR-IB基因對宗地花豬母豬泌乳力有顯著影響（P<0.05），但目前還未見BMPR-IB基因與母豬泌乳力關系的相關性報道。

由于母豬的繁殖性狀受到多方面因素的影響，在生產實踐過程中，除了品種、品系，母豬的斷奶時間、發情時間、配種時間、母豬的斷奶膘情、營養水平和飼養管理都會影響母豬的繁殖性狀[17-20]。本試驗雖在相同的營養水平和飼養管理條件下進行，但母豬自身的膘情、發情期、配種期，以及配種公豬的不同等均影響著試驗結果，這造成母豬繁殖性狀數據的收集存在很大差異，使結果不夠準確。下一步將繼續擴大試驗群體數據的采集，進一步提供宗地花豬母豬繁殖性能的有效標記。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.17.010