雞血藤ISSR反應體系的建立與優化

周敏+高慧新+王孝勛+蔣嫦月+封毅+田慧

摘要：為建立雞血藤ISSR-PCR的優化反應體系，通過選用DNA模板量、Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物濃度等5個因素中各單因素的適宜濃度，利用正交試驗方法，在5個因素4個水平條件下進行優化。結果發現，雞血藤ISSR-PCR的最佳25 μL PCR反應體系中含10×PCR buffer 2.50 μL、DNA模板量70.00 ng、Mg2+ 1.50 mol/L、Taq DNA聚合酶1.50 U、dNTP 0.30 mmol/L，引物濃度0.35 μmol/L。為雞血藤種質資源遺傳多樣性的進一步研究奠定分子基礎，也為同科屬植物的種質資源遺傳多樣性研究提供參考。

關鍵詞：雞血藤；ISSR 反應體系；單因素試驗；正交試驗

中圖分類號： S567.901文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）17-0054-03

作者簡介：周敏（1991—），女，江西贛州人，碩士研究生，研究方向為中藥品種鑒定與質量評價。E-mail：zmlww1020@163.com。

通信作者：田慧，碩士，教授，研究方向為中藥品種鑒定與質量評價。E-mail：377244732@qq.com。《中國藥典》2015版規定雞血藤來源于豆科植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn.）的干燥藤莖[1]。雞血藤為我國常用中藥，具有補血活血、調經止痛、舒筋活絡的功效，用于治療月經不調、痛經、經閉、風濕痹痛、麻木癱瘓、血虛萎黃等。雞血藤主要分布于廣西壯族自治區、廣東省、云南省、越南等地，由于近年來雞血藤生境遭受了嚴重破壞及用藥需求不斷增長，其野生資源日益減少，價格也不斷攀升。雞血藤的引種栽培受到了高度重視，目前在廣西壯族自治區、廣東省等地已建成一些雞血藤野生撫育或規范化生產示范基地，但不同產地及人工栽培造成藥材質量良莠不齊，因此選擇栽培地雞血藤顯得十分必要。雖然近年來國內學者對雞血藤的性狀、顯微、理化等方面進行了較多的研究，在雞血藤種質資源方面也有少數學者進行了分子方面的研究[2-4]。如翟明等從110條RAPD引物中篩選出9條RAPD隨機引物，對不同產地的雞血藤進行了研究[5]；安冉等利用26S DNA D1-D3區序列差異鑒別雞血藤及其混偽品[6]；筆者所在課題組田輝等采用RAPD與ISSR標記的方法初步對廣西省產雞血藤進行了遺傳多樣性的比較分析研究[7]。但目前尚未見有建立穩定的ISSR反應體系的報道，故本試驗對雞血藤ISSR反應體系進行建立與優化，運用單因素試驗和正交試驗建立一套準確性高、穩定性強且適用于大批量雞血藤種質材料微衛星標記的ISSR-PCR反應體系，不僅為雞血藤種質資源遺傳多樣的進一步研究奠定了分子基礎，也為同科屬植物的種質資源遺傳多樣性研究提供了參考。

1材料與方法

1.1供試材料

試驗材料為雞血藤嫩葉，采自廣西藥用植物園栽培基地，由廣西中醫藥大學田慧教授鑒定為豆科植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn.）。

1.2主要試劑與儀器

1.2.1試劑DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA marker、5×TBE購自天根生化科技（北京）有限公司，瓊脂糖（西班牙），GelRed核酸凝膠染料（美國），其他試劑均為國產分析純，ISSR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2儀器Eppendorf移液槍（德國）、SIGMA Sartorius臺式冷凍離心機（德國）、T-Gradient型梯度PCR儀（德國）、Bio-rad電泳儀（美國）、ChemiDoc XRS凝膠成像系統（美國）、MILIPORE超純水機（法國）、渦旋振蕩儀器（上海青浦滬西儀器廠）、微量分光光度計（日本島津）。

1.3試驗方法

1.3.1雞血藤DNA的提取根據天根生化科技（北京）有限公司植物基因組DNA提取試劑盒的操作步驟進行試驗材料總DNA的提取，同時采用微量分光光度法定量檢測其質量及濃度，并稀釋至10 ng/μL以供后續試驗。

1.3.2單因素試驗根據相關文獻[8-9]，本試驗ISSR基本反應體系的組成為總體積25 μL，其中DNA模板30.00 ng、Mg2+ 1.50 mmol/L、dNTP 0.15 mmol/L、Taq DNA聚合酶 1.50 U，引物濃度0.30 μmol/L，10×反應buffer 2.5 μL，其余用滅菌超純水補齊。擴增程序為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，36 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環；最后 72 ℃ 延伸5 min。待反應結束后，將產物置于4 ℃冰箱中保存。根據筆者所在課題組前期試驗結果，選用43號引物（引物序列為5′-3′GATGATGATGATTC）。反應選用DNA模板、Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物為考察因素，反應體系中單因素梯度設計見表1，即在單一因素變化的條件下，保持其他因素不變，從而篩選出比較適宜的濃度范圍。取擴增產物8 μL，點樣于1.0%瓊脂糖凝膠的上樣孔中，以1 500 bp DNA ladder marker為對照分子質量標準，在0.5×TBE緩沖液中電壓 75 V 電泳45 min，在凝膠成像系統中觀察、拍照、記錄、分析檢測結果。

宜范圍為參考依據，選用L16（45）正交表，在4個水平上進行試驗（表2）。

2結果與分析

2.1DNA模板添加量對ISSR-PCR反應的影響

試驗結果見圖1，添加DNA模板20 ng時，擴增出來的條帶暗且少，說明添加量低對ISSR-PCR擴增影響較大。隨著添加量的增加，擴增條帶增多，因此正交試驗中選用的模板添加量為40、50、60、70 ng。

2.2Mg2+濃度

試驗結果見圖2，當Mg2+濃度為0.5 mmol/L時，擴增的條帶最少，且不清晰，當濃度為1.0 mmol/L時，條帶逐漸增多，當濃度為3.0 mmol/L時，擴增條帶減少。由于Mg2+是Taq DNA聚合酶的輔助因子，其濃度影響Taq DNA聚合酶的活性，又兼在保證特異性條帶和清晰度的情況下，故確定

ISSR體系中Mg2+適宜濃度為1.0～2.0 mmol/L。

2.3dNTP濃度

試驗結果見圖2，當dNTP濃度為0.05～0.10 mmol/L時，PCR的產率較低，擴增出來的條帶模糊。隨著濃度的升高，非特異性條帶增多，堿基的錯配率增加。故正交試驗中dNTP適宜濃度為0.15～0.30 mmol/L。

2.4Taq DNA聚合酶添加量

試驗結果見圖3，隨著Taq DNA聚合酶添加量的增加，特異性條帶增加，亮度也增加。Taq DNA聚合酶是PCR反應中重要的影響因素，量太少不能擴增出特性條帶，Taq DNA聚合酶價格高，量太多增加成本。故正交試驗中選用Taq DNA聚合酶添加量為1～2 U。

2.5引物濃度

試驗結果見圖3，引物濃度對PCR產生的影響很大，濃度過低時PCR產物會大大降低，影響正常的擴增；濃度過大時，PCR擴增的條帶變得模糊，非特異性增加。故正交試驗中選用引物濃度為0.2～0.4 μmol/L。

2.6正交試驗

試驗結果見圖4，條帶穩定、清晰、豐富的最佳產物記為16分，最差的記1分。編號1～16打分結果依次為1、2、4、6、5、3、7、8、16、14、15、13、10、12、11、9。根據打分結果算出每個因素同水平下的均值和極差（表3）。極差值反映出影響因子對反應體系的影響，而且極差值越大，影響越明顯。由表3可知，各因素對雞血藤ISSR-PCR反應影響大小的先后次序為TaqDNA聚合酶添加量>Mg2+濃度>引物濃度>DNA模板添加量>dNTP濃度。每個因素同水平下的均值反映出影響因子各水平對反應體系的影響情況，均值越大，反應水平越好[10]。因此，雞血藤最優反應體系為TaqDNA聚合酶 1.50 U，DNA模板為 70 ng，Mg2+為1.5 mmol/L，dNTP為030 mmol/L，引物 0.35 μmol/L。

4結論與討論

ISSR分子標記技術在親緣關系、品種鑒定及遺傳多樣性檢測等方面得到了廣泛應用[11-13]。ISSR分子標記技術容易受外界環境因素的影響，如PCR體系的配置、引物、退火溫度等。目前常用單因素試驗和正交試驗對ISSR試驗進行優化，單因素試驗可選定單個因素最佳試驗條件的范圍，如張福生等運用單因素試驗建立與優化了金線蓮的ISSR反應體系[14]。正交試驗可平衡分析各個因素對試驗的綜合影響，可更加準確地得到最佳優化條件，如曹嵩曉利用單因子和正交設計雙重試驗方法優化了廣藿香ISSR-PCR試驗體系，從而得到最佳反應體系[15]。本研究綜合運用單因素和正交試驗2種方法，克服單一試驗方法的局限性。

本研究結果表明，ISSR反應體系中，Taq DNA聚合酶添加量對結果的影響極大，Taq DNA聚合酶在水中不易溶解完全，稀釋時須溶解在2×反應buffer中。篩選合適的引物，有利于結果的判斷，合適的退火溫度可使目的條帶最大程度地擴增，也可使目的條帶更亮。因此，本試驗選出雞血藤的最佳反應體系為TaqDNA聚合酶1.50 U，DNA模板70 ng，Mg2+ 1.5 mmol/L，dNTP 0.30 mmol/L，引物0.35 μmol/L，最佳退火溫度36 ℃。本試驗確定了雞血藤的最佳ISSR-PCR反應體系，也為同科屬植物的種質資源遺傳多樣性研究提供了參考，為后續雞血藤種質多態性研究提供了科學依據。

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