玉米品種抗粗縮病人工接種鑒定方法研究

杜琳琳+呂建穎+曹曉燕+饒鳴帥+施文娟+蘭瑩+孫楓+程兆榜+孟慶長+袁建華+周益軍+周彤

摘要：為建立科學有效的玉米品種抗玉米粗縮病人工接種鑒定方法，分別研究了玉米接種苗齡、接種強度及接種時間3個因素對鑒定效果的影響。結果顯示，玉米接種苗齡在芽鞘期、2葉1心期和4葉1心期接種無顯著差異；在有效接種強度為3頭/苗條件下，鑒定效果優于1～2頭/苗處理；接種12～48 h條件下，鑒定效果優于6 h處理。由此構建了玉米粗縮病人工接種鑒定方法：在玉米芽鞘期至4葉1心期接種，接種時間12～48 h，有效接種強度3頭/苗。在此條件下對玉米品種蘇951進行接種鑒定，鑒定結果與重病區田間鑒定無顯著性差異，表明所建立的人工接種鑒定方法能客觀地反映玉米品種對玉米粗縮病的抗性水平。

關鍵詞：玉米粗縮病；水稻黑條矮縮病毒；人工接種；抗性鑒定

中圖分類號： S435.131.4+9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）17-0093-02

通信作者：周彤，博士，研究員，主要從事植物抗病性研究。E-mail：zhoutong@jaas.ac.cn。玉米粗縮病（maize rough dwarf disease，MRDD）是由灰飛虱[Laodelphax striatellus （Fallén）]（SBPH）以持久性不經卵方式傳播的一種惡性病毒病[1]，通常表現為葉色深綠，植株嚴重矮化，節間變短、變粗，葉背出現白色蠟狀突起，籽粒較少或者不結籽粒[2]。引起MRDD的病毒目前有3種：Rice black streaked dwarf virus（RBSDV）、Mal de Rio Cuarto virus（MRCV）和Maize rough dwarf virus（MRDV），我國玉米粗縮病病原為水稻黑條矮縮病毒（RBSDV），除侵染玉米外，還可以侵染水稻、小麥、大麥等禾本科植物[3]。該病害于1954年傳入我國以來，20世紀70年代和90年代該病曾在我國大范圍長時間流行，至今已擴展到河北、陜西、山東、江蘇、湖北、遼寧等十余省市[4]。近年來，隨著氣候環境變化和玉米種植面積的擴大，玉米粗縮病的發生進一步趨重，已上升為玉米生產上最為嚴重的病毒病害[5]，據統計，僅2008年山東省發病面積就達 1 110.82萬hm2，其中重病田塊病株率達50%以上，而春播、套種玉米病株率可高達80%以上，山東省因為粗縮病造成 1.667萬hm2 玉米絕產[6]，嚴重影響了玉米的安全生產。

目前生產上采用的治蟲防病方法只能作為一種應急防治策略，而選育和應用抗病品種無疑是一種更為經濟環保的防治策略。目前，玉米粗縮病抗性鑒定主要依靠重病區田間鑒定和人工接種鑒定[7]。田間鑒定易受田間灰飛虱數量、灰飛虱帶毒率等環境因素的影響，鑒定結果重演性與準確性較差，往往需要多年、多點的重復試驗，極大地延緩了抗粗縮病育種的進程[8]。而現有人工接種鑒定方法均直接以接蟲數量作為接種強度的指標，忽略了僅有攜帶RBSDV的灰飛虱才能傳毒這一因素。為此，本課題組引入灰飛虱有效接種量（有效接種量=接種蟲數×帶毒率）的概念，并從接種苗齡、接種強度和接種時間3個方面研究玉米粗縮病人工接種鑒定的最佳條件，以期為玉米抗玉米粗縮病的品種選育提供切實可行的鑒定技術。

1材料與方法

1.1玉米材料和接種體的準備

以感病玉米品種蘇951為接種對象。于江蘇省重病區采集植株矮縮、葉色濃綠、分蘗略有增多、心葉有缺刻、葉片質厚等表現出小麥綠矮病典型癥狀的小麥植株[9]，參照周彤等的方法[10]將灰飛虱在RBSDV毒源上飼喂獲毒，之后移入育有武育粳3號秧苗的燒杯中飼養13 d，度過循回期，每批次飼毒蟲中隨機取100頭，參照周彤等的方法檢測灰飛虱帶毒率，并測算有效接種蟲量（有效接種蟲量=接種蟲量×帶毒率）[11]。

1.2人工接種鑒定最佳條件篩選

1.2.1接種時間對鑒定的影響接種時間設置6、12、24、48 h 4個處理，重復3次。將感病玉米品種蘇951播種于裝有蛭石與營養土1 ∶1混配土的500 mL燒杯中，每杯播4株苗，用40目網紗制成防蟲紗罩。待玉米苗長至2葉1心時進行接種鑒定，接種前2 d淘汰病弱苗，挑選生長一致的幼苗 25～30株進行接種，有效接種強度2頭/苗。每天趕蟲2次，以確保被鑒定的玉米苗均勻獲毒。接種2 d后清除全部灰飛虱，將玉米苗移栽至大田。30 d后開始調查發病情況，每7 d調查1次，連續調查3次。參照玉米粗縮病典型癥狀[2]調查病害發生情況，計算發病率。

1.2.2接種強度對鑒定的影響有效接種蟲量設置1、2、3頭/苗3個處理，重復3次。播種方式同“1.2.1”節的方法。待玉米苗長至2葉1心期進行接種鑒定，接種時間為2 d，接種后處理及調查方法同“1.2.1”節的方法。

1.2.3玉米接種苗齡對鑒定的影響接種苗齡設置芽鞘期、2葉1心期和4葉1心期3個處理，重復3次。播種方式同“1.2.1”節的方法，按有效接種強度2頭/苗進行接種，接種時間為2 d，接種后處理及調查方法同“1.2.1”節的方法。

1.3人工接種鑒定與重病區田間鑒定效果的比較

選擇大豐稻麥原種場和豐縣歡口鎮沙莊村常年重病區作為鑒定圃，兩地分別于2012年5月下旬和2014年6月上旬播種玉米品種蘇951。于鑒定圃灰飛虱一代成蟲峰期調查灰飛虱蟲量并采集500頭高齡若蟲，隨機取100頭檢測帶毒率[10]，于田間第1次發病高峰期調查發病情況，每7 d重復調查1次，計算發病率。玉米整個生長期間不噴灑任何殺蟲劑和抗病毒劑。

1.4數據統計分析

數據采用SPASS 16.0軟件處理，Duncans新復極差法進行差異顯著性分析。

2結果與分析

2.1人工接種鑒定方法的最佳條件篩選

各批次獲得接種用灰飛虱經ELISA檢測，帶毒率在 15%～42%之間，轉換為有效接種蟲量后將獲毒灰飛虱用于人工接種鑒定。病毒在介體體內的接種時間、接種強度、水稻接種苗齡3個因素對鑒定效果的影響如表1所示。endprint

接種時間：隨著接種時間的增加玉米粗縮病的發病率不斷升高。接種6、12、24、48 h后，玉米粗縮病的發病率分別為60.97%、85.63%、86.87%、90.17%，接種12、24、48 h處理顯著高于6 h處理（P<0.05），且這3個處理間差異不顯著，表明玉米粗縮病人工接種鑒定適宜接種時間為12～48 h。

接種強度：當有效接蟲量為1、2、3頭/苗時，玉米粗縮病發病率分別為87.73%、87.75%、98.67%。其中有效接種蟲量3頭/苗的發病率顯著高于另外2個處理（P<0.05），但有效接種蟲量每苗為1頭和2頭2個處理間差異不顯著，表明玉米粗縮病人工接種鑒定適宜接種蟲量為3頭/苗。

接種苗齡：在玉米芽鞘期、2葉1心、4葉1心期接種，玉米粗縮病發病率分別為83.95%、87.65%、80.64%。3個處理間發病率差異不顯著（P>0.05），表明適宜玉米粗縮病人工接種鑒定的接種苗齡為芽鞘期至4葉1心期。

2.2人工接種鑒定與重病區田間鑒定效果的比較

大豐稻麥原種場和豐縣歡口鎮沙莊村一代灰飛虱成蟲峰期總蟲量分別為1 303.5萬、390萬頭/hm2，帶毒率分別為200%和3.00%，有效接種蟲量分別為26.1萬、11.7萬頭/hm2。玉米品種蘇951在2個重病區田間鑒定的結果分別為100%和93.50%。人工接種鑒定與重病區田間鑒定結果間無顯著差異，表明本研究建立的人工接種鑒定方法能夠模擬重病區田間鑒定效果，它的抗性評價結果可靠。

3討論

20世紀以來，國內很多學者開展了玉米抗玉米粗縮病材料的篩選工作，但鑒定結果發現抗病材料較少。目前生產上急需建立科學、準確的抗性鑒定方法。田間自然傳毒鑒定方法雖方便快捷，但受環境條件、灰飛風發生及遷飛數量等因素制約，難以保證鑒定效果的準確性和重演性。如張海燕等研究表明登海3622、邦玉358、金海5號和農大108表現為感病[12]，而王延玲等得到的結果為抗病[13]，楊興飛等和薛林等均鑒定為高抗[14-15]。因此，人工接種鑒定無疑是更為科學和可靠的方法。針對玉米粗縮病的人工接種鑒定方法，前人已做了許多嘗試。但在接種強度的指標方面，往往直接使用接蟲數量，忽略了只有攜帶RBSDV的灰飛虱才能侵染玉米使其發病這一因素。這使不同研究結果間出現了較大差異，影響了抗性鑒定效果，如邸墊平等的網箱集團接種試驗結果表明，約1.7頭/苗時發病率達92.31%～100%[16]；而Wang等和張愛紅等分別以10頭/苗和5頭/苗接種，發病率分別為35.00%和27.67%[17-18]。本研究通過ELISA方法檢測灰飛虱帶毒率，并引入灰飛虱有效接種蟲量作為接種強度的量化指標。為驗證建立的人工接種鑒定方法的可靠性，我們對重病區抗性鑒定圃大豐稻麥原種場和豐縣歡口鎮沙莊村進行了蟲量和帶毒率的調查，以1 hm2 67 500株苗折算，其有效接種蟲量折算分別為3.86頭/苗和1.73頭/苗，這與人工接種鑒定的接種強度基本一致。

在稻—麥或玉—麥輪作區，來自小麥的第1代攜帶RBSDV的灰飛虱是玉米粗縮病的主要侵染源[19-21]，這一田間傳毒規律啟發我們把小麥作為病毒來源。本世紀初之前RBSDV侵染小麥后常表現隱癥，但隨著全球氣候變暖導致小麥生育期延長，以及田間病害發生程度的日趨嚴重，田間開始出現小麥綠矮病危害[22]，便于大量獲得飼毒灰飛虱用病毒樣本，有利于提高抗性鑒定的效率和規模。此外，本試驗以小麥綠矮病株為初始毒源飼喂灰飛虱，是在最大程度地模擬田間實際的基礎上建立的人工鑒定方法。以抗感水平已知的玉米品種蘇951為研究對象，采用多年多地重病區田間鑒定和人工接種鑒定方法進行分析，二者結果一致，表明本研究構建的人工接種鑒定方法能客觀地反映玉米品種對玉米粗縮病的抗性水平，希望為玉米品種的抗性評價、抗玉米粗縮病品種的選育等提供切實可行的鑒定技術。

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