IBDV超強毒株NJ09株在DF—1細胞上的增殖工藝

鴻英1，+朱亞露1，+揭畢志香+趙陽+何家惠+于漾+侯繼波

摘要：為完善現有雞傳染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，簡稱IBDV）滅活疫苗生產工藝，形成適用于批量生產的抗原制備技術流程，對IBDV NJ09株病毒在DF-1細胞上的增殖工藝進行研究。通過培養基篩選、血清最適濃度比較、接毒量測定等相關試驗，明確了規模化生產工藝，即將DF-1細胞以1 ∶3、1 ∶4比例分瓶（0.85×105～1.2×105個/mL）傳代培養，細胞生長36～48 h后按體積分數0.1%～0.2%接種IBDV NJ09株毒種，接毒后 36～48 h收毒；同時篩選出適宜IBDV NJ09株病毒增殖的MD611培養基及小牛血清，既可以滿足高滴度抗原增殖的生長需要，又降低了疫苗生產成本，形成了適用于規模化生產的抗原接種、收獲、處理工藝技術指標，按上述工藝所增殖的IBDV NJ09株抗原病毒含量穩定在108.0 TCID50/mL以上，可滿足含IBDV組分的系列滅活疫苗生產需要，為該病毒滅活疫苗大規模生產提供了技術支持。

關鍵詞：雞傳染性法氏囊病毒；NJ09株；DF-1細胞；生產工藝

中圖分類號： S858.315.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）17-0152-03

收稿日期：2017-02-24

基金項目：公益性行業（農業）科研專項（編號：201303046）。

作者簡介：揭鴻英（1978—），女，福建三明人，碩士，助理研究員，主要從事獸用生物制品研究。E-mail：hongying6090@163.com。

通信作者：于漾，碩士，助理研究員，主要從事獸用生物制品研究。Tel：（025）84392058；E-mail：yangyu1719223@163.com。DF-1細胞是一種可以持續傳代的雞胚成纖維細胞系，由美國明尼蘇達大學的Himly等于1998年用10日齡EV-0雞胚胎制備而成[1]。與傳統的雞成纖維（chicken embryo fibroblast，簡稱CEF）細胞相比，該細胞系在產業化生產中有著明顯的優勢，目前已廣泛應用于禽類病毒的增殖研究及疫苗的規模化生產中[2-3]，其中在雞傳染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，簡稱IBDV）的增殖研究上也有相關報道[4-9]。IBDV是雞傳染性法氏囊病（infectious bursal disease）的致病病原，雞感染該病毒不僅會引起雛雞發病死亡，更重要的是會破壞雛雞法氏囊組織，導致免疫抑制，誘發機體對其他病原的敏感性，威脅禽養殖業的健康發展[10-13]。在IBDV的疫苗研究中，近年來也有利用傳代細胞培養病毒的報道，但由于IBDV包含多個株系，受毒源株系差別、培養體系等因素的影響，IBDV在DF-1等傳代細胞上的增殖條件也各不相同[14-18]。為提高IBDV NJ09株在DF-1細胞上增殖的病毒含量，同時考慮大規模培養的生產成本，筆者所在實驗室對IBDV NJ09株細胞適應毒在DF-1細胞上的增殖進行不同條件的篩選，擬確定IBDV NJ09株在DF-1細胞上的最佳生產工藝。

1材料與方法

1.1材料

25 cm2細胞瓶、細胞計數板、96孔細胞培養板，均購自美國Corning Coster公司；DMEM培養基、DMEM/F12培養基、胰蛋白酶、小牛血清、胎牛血清，均購自GIBCO公司；MD611培養基，購自北京清大天一科技有限公司；DF-1細胞，從美國ATCC公司購入，由國家獸用生物制品工程技術研究中心傳代、建庫和保存；雞傳染性法氏囊病毒NJ09株細胞適應毒F3代，病毒含量為108.0 TCID50/mL（TCID50表示半數組織感染量），由筆者所在實驗室培育和保存。

1.2DF-1細胞傳代比例篩選

選擇細胞生長良好、致密度為95%以上的25 cm2細胞瓶，棄去培養液，用0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（PBS）輕輕蕩洗2次，加入0.1%胰酶-乙二胺四乙酸（EDTA）液2 mL進行消化。當細胞面呈毛玻璃狀，棄去消化液，利用瓶內殘留的0.5 mL消化液繼續消化，當細胞面出現松散脫落時，加入不同比例含5%小牛血清的MD611培養液輕輕吹打，懸浮細胞，進行細胞計數，使細胞生長液中DF-1細胞數分別為 0.5×105～0.7×105個/mL（傳代比例1 ∶6）、0.67×105～083×105個/mL（傳代比例1 ∶5）、0.85×105～1.0×105個/mL（傳代比例 1 ∶4）、1.0×105～1.2×105個/mL（傳代比例1 ∶3），在25 cm2細胞瓶中加入10 mL細胞懸液，在37 ℃條件下培養，觀察細胞的貼壁情況、生長狀態及細胞的密度。

1.3IBDV NJ09株在DF-1細胞上的最佳接毒量的確定

取已長滿單層的25 cm2細胞瓶12個，分4組，每組3個重復，分別按0.1%、0.2%、0.5%、1.0%接毒量（體積分數）接毒。接毒后，觀察細胞病變出現情況，待80%以上細胞出現病變時，收獲細胞毒。收獲的細胞毒反復凍融3次后，12 000 r/min 離心 10 min，取上清測定病毒含量。

1.4不同營養液對擴繁DF-1細胞的影響

DF-1細胞分別用3種細胞生長液（DMEM+5%小牛血清、DMEM/F12+5%小牛血清、MD611+5%小牛血清）連傳3代后，消化細胞，進行細胞計數。

1.5不同營養液擴繁DF-1細胞對IBDV增殖的影響

取分別用3種細胞生長液（DMEM+10%小牛血清、DMEM/F12+10%小牛血清、MD611+5%小牛血清）連傳細胞長滿單層的25 cm2細胞瓶9個，3個1組，每個細胞瓶按 0.1%（體積比）接毒。第1組維持液為DMEM培養基（DMEM+2%小牛血清），第2組維持液為DMEM/F12培養基（DMEM/F12+2%小牛血清），第3組維持液為MD611培養基（MD611+2%小牛血清）。接毒后觀察細胞病變情況，各組均在接毒后細胞病變數量超過80%時收毒，收獲的細胞毒反復凍融3次后，12 000 r/min離心10 min，取上清測定病毒含量。endprint

1.6不同血清對IBDV增殖的影響

取已長滿單層細胞的25 cm2細胞瓶6個，3個1組，按 0.1%（體積比）接毒。第1組維持液為含2%小牛血清的培養基，第2組為含2%胎牛血清的培養基。接毒后觀察細胞病變情況，各組均在接毒后細胞病變數量達到80%以上時收毒，-20 ℃凍存，12 000 r/min離心10 min，取上清測定病毒含量。

1.7IBDV收毒時凍融次數對病毒含量的影響

取已長滿單層細胞的25 cm2細胞瓶6個，3個1組。按0.1%（體積比）接毒。接毒后觀察細胞病變情況，當細胞病變數量超過80%時收毒，第1組將所取的3個方瓶細胞毒懸液混勻，反復吹打，不凍融，收獲病毒液。第2組將細胞置于 -20 ℃ 凍融，分別在凍融1、2、3次時取樣。所有樣品經 12 000 r/min 離心10 min，取上清測定病毒含量。

1.8毒價測定方法

已長滿單層細胞的96孔細胞板，棄去培養液，每孔用PBS洗滌1次。將病毒用無血清的培養液作10倍系列稀釋，從最低稀釋度的病毒液開始接種細胞，每個稀釋度接4個孔，每孔100 μL，在37 ℃ CO2培養箱中吸附1 h之后，每孔加入100 μL維持液（血清終濃度為2%）。放入37 ℃ CO2培養箱中培養，每天觀察并記錄細胞病變情況，連續觀察7 d，計算TCID50。

2結果與分析

2.1DF-1細胞傳代比例篩選

由表1可以看出，將DF-1細胞按1 ∶3～1 ∶6不同比例分瓶傳代，在一定時間內均能長成致密單層。但隨著分瓶比例的加大，長成致密單層的時間延長。DF-1細胞按1 ∶3、1 ∶4 比例分瓶傳代時，接種后24～48 h能長成致密單層，培養 48 h 時細胞數較多；而按1 ∶5～1 ∶6分瓶培養48 h細胞數少于1 ∶3、1 ∶4比例分瓶試驗組，且于接種后60～84 h才長成致密單層。因此，以1 ∶3、1 ∶4的傳代比例培養36～48 h 為最佳。

2.2IBDV在DF-1細胞上的最佳接毒量的確定

IBDV NJ09株在DF-1細胞上按0.5%～1.0%的量接毒，細胞在接毒后24 h出現病變，24～36 h細胞全部脫落，由表2可見，接種量0.5%～1.0%條件下，收毒時間為28～30 h，病毒含量為107.4～107.8 TCID50/mL。按0.1%～0.2% 的量接毒，細胞在接毒后24～36 h開始出現病變，36～48 h 80%的細胞出現病變，病毒含量為108.0～108.2 TCID50/mL。因此，按0.1%～0.2%接毒量接毒時，36～48 h收毒的病毒含量最高。

2.3不同營養液對DF-1細胞增殖的影響

由表3可知，培養48 h時，含DMEM培養基的營養液中的細胞數為67萬個/mL，DMEM/F12培養基中的細胞數為70萬個/mL，而MD611培養基中的細胞數為100萬個/mL，高于另2種培養基；在生產成本上，MD611培養基增殖DF-1細胞的生產成本明顯低于DMEM、DMEM/F12培養基，因此MD611培養基是經濟又適宜的DF-1細胞培養基。

2.4不同營養液對IBDV增殖的影響

由表4可知，3種營養液中，含DMEM培養基的營養液中IBDV的增殖效價最低，病毒含量為107.67 TCID50/mL，而含DMEM/F12、MD611培養基的營養液中IBDV病毒含量分別為108.20、108.27 TCID50/mL，兩者IBDV的增殖量相當，而在生產成本上，DMEM/F12生產成本大約是MD611的3倍（表3），因此MD611是一種適宜IBDV NJ09株病毒在DF-1上增殖的培養基。

3討論與結論

DF-1作為一種重要的禽傳代細胞，目前已在多種禽病毒增殖研究中被應用，如IBDV、H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、馬立克氏病病毒等[19-20]。筆者所在實驗室前期已經馴化獲得1株DF-1細胞適應毒——IBDV NJ09株，基于該細胞毒，本研究對其在DF-1細胞上進行增殖培養時的接毒量、營養液、血清、收毒方法等方面進行了條件優化，為進一步完善該毒株的疫苗生產工藝提供支持。

從不同分瓶傳代比例看，DF-1細胞按1 ∶3～1 ∶6傳代，細胞都能長成單層，但長成單層需要的時間不同。因此可以根據不同的目的，選擇不同的分瓶比例。當需要接毒時，可以選擇1 ∶3～1 ∶4的比例傳代，細胞在培養24～48 h時可以長成致密單層。如果僅是維持細胞的傳代需要，可以選擇 1 ∶5～1 ∶6的比例分瓶，這樣既保存了細胞，又減輕了工作量。

不同營養液對DF-1細胞的增殖結果顯示，DMEM、DMEM/F12培養基培養細胞48 h，細胞數約增殖2倍，用MD611培養DF-1 48 h后，細胞數增殖3倍左右，而且MD611價格便宜，僅為DMEM價格的1/2左右、DMEM/F12價格的1/3左右。

病毒接毒量研究結果顯示，IBDV NJ09株在DF-1細胞上按1.0%的接毒量接毒，毒價并不是最高，這一結果說明了1.0%的接毒量過大，導致細胞病變出現過早，毒價亦未因接種量的增加而更高。病毒接毒量不是越大越好，細胞接毒量太大會造成細胞病變提前，導致細胞迅速圓縮脫落，毒價反而不高；而接毒量過少時又會造成細胞病變出現延遲，細胞衰老、狀態差也會影響病毒增殖的毒價，前人研究IBDV在細胞上的增殖時也有類似的發現[21-22]。最佳接毒量應該用每個細胞的病毒感染復數（MOI）表示更科學，而本試驗中，由于細胞培養工藝比較成熟，細胞數也比較穩定，且毒種的病毒含量是穩定的，故接毒量用占維持液的百分比表示，在具體操作中更便捷。

不同血清對IBDV增殖影響的研究結果顯示，胎牛血清中IBDV NJ09株的病毒增殖后的含量比小牛血清略高，而成本比小牛血清高300元/L，結合生產實際，選擇性價比高的小牛血清。endprint

IBDV收毒時，凍融次數對病毒含量影響的研究結果顯示，不凍融雖然對病毒含量影響不大，但有一部分細胞未脫壁，不能完全收清，而凍融1、2次后少量未脫璧的細胞也能脫落，利于完全收獲。

通過系列試驗對DF-1的培養及IBDV NJ09株細胞毒生產工藝條件進行了研究，確定了培養基及血清，同時制定了適用于規模化生產的抗原接種、收獲、處理工藝技術指標：（1）DF-1細胞在傳代時，以1 ∶3、1 ∶4比例傳代，培養36～48 h后能長成致密單層，適合接毒；（2）選用MD611培養基+2%小牛血清濃度維持液增殖IBDV病毒，既可以確保增殖抗原的高滴度，又降低了生產成本；（3）IBDV NJ09株最適接毒量為0.1%～0.2%（體積分數），接毒時間為細胞生長36～48 h后，收毒時間為接毒36～48 h（80%以上細胞出現細胞病變）后，可確保病毒含量不低于108.0 TCID50/mL；（4）IBDV NJ09株在DF-1細胞上增殖收毒時的凍融次數，對抗原病毒含量影響不明顯，為確保病毒收獲完全，建議選擇凍融1～2次。

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