正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)方胃炎膠囊中藥材的水提工藝Δ

鄭姣妮，劉玲，何道惠（1.重慶市急救醫(yī)療中心/重慶市第四人民醫(yī)院藥劑科，重慶400014；.四川省中醫(yī)藥研究院分析測(cè)試中心，成都610041）

正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)方胃炎膠囊中藥材的水提工藝Δ

鄭姣妮1＊，劉玲1#，何道惠2（1.重慶市急救醫(yī)療中心/重慶市第四人民醫(yī)院藥劑科，重慶400014；2.四川省中醫(yī)藥研究院分析測(cè)試中心，成都610041）

目的：優(yōu)化復(fù)方胃炎膠囊中藥材的水提工藝。方法：采用正交試驗(yàn)，以干膏中芍藥苷含量、丹酚酸B含量與干膏質(zhì)量的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察加水量、煎煮時(shí)間和煎煮次數(shù)對(duì)水提工藝的影響，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：優(yōu)化的水提工藝為煎煮3次、每次120 min、每次加10倍量水；驗(yàn)證試驗(yàn)中綜合評(píng)分平均值為909.19（RSD＝1.84%，n＝3）。結(jié)論：優(yōu)化的水提工藝穩(wěn)定、可行，可用于復(fù)方胃炎膠囊中各藥材的提取。

復(fù)方胃炎膠囊；正交試驗(yàn)；提取工藝；芍藥苷；丹酚酸B

慢性胃炎是消化系統(tǒng)常見(jiàn)病、多發(fā)病[1]，根據(jù)病理組織學(xué)改變和胃的病變部位，再結(jié)合可能病因，一般將胃炎分成非萎縮性（以往稱(chēng)淺表性）、萎縮性和特殊類(lèi)型3大類(lèi)[2]。胃炎主要是胃黏膜上皮受到各種致病因子，如藥物、微生物、毒素和膽汁反流等的經(jīng)常、反復(fù)侵襲所致，其中幽門(mén)螺桿菌（HP）是胃炎的最主要病因，可造成慢性持續(xù)性的炎癥性病變。各類(lèi)型胃炎雖然病因不同，但病理過(guò)程基本相似[3-4]。

復(fù)方胃炎膠囊的處方來(lái)源于臨床經(jīng)驗(yàn)方，該方于2011年1月－2011年12月在重慶市急救醫(yī)療中心消化內(nèi)科進(jìn)行了前期的臨床療效觀察。109例胃炎患者給予復(fù)方胃炎膠囊處方的湯劑治療3個(gè)月后，92例治愈（治愈率達(dá)84.4%），15例好轉(zhuǎn)，2例無(wú)明顯療效，總有效率達(dá)到98.2%（觀察者為重慶市第四人民醫(yī)院消化科臨床醫(yī)師曾慶貴、臨床藥師鄭姣妮），提示該方對(duì)胃炎患者具有治療作用。復(fù)方胃炎膠囊處方由白芍、黨參、白術(shù)、茯苓、麥冬、丹參、香附、高良姜、甘草9味藥材組成，由于組成藥味較多，服用量大（每次需服用湯劑250 mL，每天需要服用3次），且患者感覺(jué)口感不佳，攜帶也不方便。

為解決上述不足，本課題組擬將該方制劑由湯劑改成膠囊。為制訂科學(xué)、合理的藥材提取工藝，筆者根據(jù)處方中各藥材的藥理作用及有效成分的理化性質(zhì)，結(jié)合中醫(yī)配伍原則及臨床用藥特點(diǎn)，以方中君藥白芍、丹參的有效成分芍藥苷和丹酚酸B[5]含量及干膏質(zhì)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)方胃炎膠囊的水提工藝。

1 材料

1.1 儀器

1200高效液相色譜（HPLC）儀（美國(guó)Agilent公司）；AUW220D電子分析天平（日本島津儀器制造所）；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；DA-2A真空干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市雙潔實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.2 藥材、對(duì)照品與試劑

白芍、黨參、白術(shù)、茯苓、麥冬、丹參、香附、高良姜、甘草（批號(hào)分別為：20130309、2013031、20130308、20130401、20130313、20130420、20130218、20130319、20130311）等9味藥材飲片均購(gòu)自四川省中藥飲片公司，經(jīng)四川省中醫(yī)藥研究院分析測(cè)試中心研究員何道惠鑒定為真品；芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201136）、丹酚酸B對(duì)照品（批號(hào)：110719-201133）均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均不低于98%；乙腈、磷酸為色譜純，水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 干膏中芍藥苷、丹酚酸B含量的測(cè)定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱：Phenomenex C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸鹽緩沖溶液，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm（芍藥苷）、286 nm（丹酚酸B）[6-9]；檢測(cè)溫度：室溫；進(jìn)樣量：10 μL。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Tab1 Gradient elution procedure

在上述色譜條件下，取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液（正交試驗(yàn)9號(hào)樣品）和陰性對(duì)照溶液進(jìn)樣分析。結(jié)果丹酚酸B和芍藥苷之間以及二者與相鄰峰之間的分離度均大于1.5。在陰性對(duì)照溶液的色譜圖中，在丹酚酸B和芍藥苷相對(duì)應(yīng)的位置上未見(jiàn)相應(yīng)的色譜峰。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig1 HPLC chromatograms

2.1.2 溶液的制備（1）混合對(duì)照品溶液：取芍藥苷、丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加水制備成質(zhì)量濃度分別為50、55 μg/mL的溶液，即得[7-9]。（2）供試品溶液：取“2.2.1”項(xiàng)下水提干膏5 g，精密稱(chēng)定，置于50 mL量瓶中，加水35 mL，超聲處理（功率：240 W，頻率：45 kHz）15 min[10]，放冷，加水至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。（3）缺丹參或白芍的陰性對(duì)照溶液：按處方量稱(chēng)取除丹參或白芍之外的其他藥材進(jìn)行提取，按“（2）”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.1.3 檢測(cè)限與定量限按信噪比為3計(jì)算，本法測(cè)得芍藥苷、丹酚酸B的檢測(cè)限分別為0.3、0.4μg/mL；按信噪比為10計(jì)算，本法測(cè)得芍藥苷、丹酚酸B的定量限分別為1.0、1.2μg/mL。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取混合對(duì)照品溶液各1、3、5、7、10、15、20 μL進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得芍藥苷、丹酚酸B的回歸方程分別為：y＝1 415.5x－0.16（r＝0.999 0）、y＝1 215.2x+1.06（r＝0.998 0）。結(jié)果表明，芍藥苷、丹酚酸B檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為4.01～81.03、5.14～102.76μg/mL。

2.1.5 精密度試驗(yàn)精密吸取混合對(duì)照溶液適量，重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定5次。結(jié)果，芍藥苷、丹酚酸B峰面積的RSD分別為1.31%、1.23%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液適量，分別于制備后0、2、4、6、8、24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，芍藥苷、丹酚酸B峰面積的RSD分別為1.33%、1.21%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批干膏（正交試驗(yàn)9號(hào)樣品）適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備成6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，芍藥苷、丹酚酸B含量的RSD分別為1.00%、1.05%（n＝6），表明方法重復(fù)性好。

2.1.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn)精密稱(chēng)取已知芍藥苷（4.78 mg/g）、丹酚酸B（6.21 mg/g）含量的干膏樣品5 g，共9份，精密加入相當(dāng)于樣品中各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%、100%、120%的芍藥苷、丹酚酸B對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算芍藥苷、丹酚酸B含量及加樣回收率。結(jié)果，丹酚酸B、芍藥苷的平均加樣回收率分別為99.78%、99.91%，RSD分別為1.28%、0.51%（n＝9），表明方法準(zhǔn)確度較好。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化水提工藝

2.2.1 因素、水平與指標(biāo)的確定根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，選擇煎煮次數(shù)（A）、煎煮時(shí)間（B）、加水倍數(shù)（C）為試驗(yàn)因素[10-11]，每個(gè)因素選取3個(gè)水平；以干膏中芍藥苷含量、丹酚酸B含量、干膏質(zhì)量的綜合評(píng)分為指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)篩選水提工藝條件[12-14]。中藥有效成分是中藥復(fù)方發(fā)揮治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，而干膏質(zhì)量可影響制劑的穩(wěn)定性[15]。故將干膏中芍藥苷含量、丹酚酸B含量的權(quán)重系數(shù)各設(shè)為0.4，干膏質(zhì)量權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.2，計(jì)算綜合評(píng)分[芍藥苷含量（mg）×40%+丹酚酸B含量（mg）×40%+干膏質(zhì)量×20%，其中各成分的含量指53 g生藥提取后所得干膏中各成分的含量]，因素與水平見(jiàn)表2。

表2 因素與水平Tab2 Factors and levels

2.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果按處方比例稱(chēng)取藥材53 g，按表2各水平進(jìn)行煎煮試驗(yàn)，得濾液，濾液濃縮蒸干，70℃減壓干燥，稱(chēng)質(zhì)量，得干膏質(zhì)量；按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定干膏中芍藥苷、丹酚酸B的含量，計(jì)算綜合評(píng)分。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab3 Test design and results

表4 方差分析結(jié)果Tab4 Results of variance analysis

由表3、表4可知，各因素對(duì)提取效果的影響大小順序?yàn)锳＞B＞C，煎煮次數(shù)有顯著影響。從生產(chǎn)實(shí)際及節(jié)約成本等出發(fā)，確定最優(yōu)工藝為A3B2C2，即最優(yōu)方案為煎煮3次、每次120 min、每次加水10倍。

2.3 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

按處方比例稱(chēng)取各藥材共530 g，平行3份，按上述優(yōu)化條件煎煮提取，濾過(guò)，合并濾液，濃縮蒸干，稱(chēng)量；測(cè)定芍藥苷含量、丹酚酸B含量和干膏質(zhì)量，并計(jì)算綜合評(píng)分。結(jié)果，綜合評(píng)分均值為909.19（RSD＝1.84%），表明優(yōu)化的工藝穩(wěn)定、可行。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab5 Results of verification test

3 討論

本處方中白芍和丹參為君藥。白芍有效成分主要有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷等，2015年版《中國(guó)藥典》（一部）將芍藥苷作為白芍質(zhì)量控制指標(biāo)。芍藥苷屬于單萜苷類(lèi)，溶于水，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒等作用[14]。丹參中有效成分主要有酚酸類(lèi)和脂溶性二萜類(lèi)，其中酚酸類(lèi)主要包括丹酚酸A、B和丹參素，均為水溶性，其中丹酚酸B含量高且檢測(cè)方法較成熟[15-16]，具有抗炎、抗氧化、抗癌等作用[17]。芍藥苷和丹酚酸B兩者都有抗炎作用，因此本研究以芍藥苷和丹酚酸B的含量為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)。

將本方開(kāi)發(fā)成膠囊劑時(shí)，還需進(jìn)一步對(duì)提取后的干膏進(jìn)行純化處理，尤其是水溶性成分提取得到的干膏量較大，故應(yīng)進(jìn)一步采用醇沉處理等方法以去除水不溶性雜質(zhì)。另外，本研究在實(shí)驗(yàn)室中完成，還需進(jìn)行中試和大生產(chǎn)驗(yàn)證，并依據(jù)生產(chǎn)實(shí)際條件進(jìn)一步優(yōu)化研究，以滿足生產(chǎn)要求。

[1] 侯政昆，劉鳳斌，李培武.劉鳳斌教授治療慢性萎縮性胃炎的病例系列挖掘分析和經(jīng)驗(yàn)總結(jié)[J].中國(guó)中藥雜志，2015，40（11）：2227-2234.

[2] 陸再英.內(nèi)科學(xué)[M].8版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：382-386.

[3] 陳灝珠.實(shí)用內(nèi)科學(xué)[M].14版.北京：高等教育出版社，2013：1976-1980.

[4] 殷玉靜，劉冬梅，王偉.從毒論治慢性萎縮性胃炎中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究進(jìn)展[J].山西中醫(yī)，2015，31（6）：61-62.

[5] 路珊珊，曾斌芳.慢性萎縮性胃炎中醫(yī)血瘀證現(xiàn)代進(jìn)展[J].新疆中醫(yī)藥，2014，32（1）：70-71.

[6] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：76-77、105.

[7] 王剛，杜士明，陳黎，等.高效液相色譜法測(cè)定活血通淤片中丹參素和丹酚酸B含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30（15）：1333-1335.

[8] 彭俊付，趙寶明，張書(shū)信.RP-HPLC測(cè)定廣通消中芍藥苷含量的方法[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36（23）：3268-3270.

[9] 黃文君，龍鳳榮，伍慶，等.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定痛經(jīng)寧膠囊中4種有效成分[J].中成藥，2012，34（11）：2133-2135.

[10] 張勇，紅梅，錫林通嘎拉嘎，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選消疹止癢膠囊藥材的提取工藝[J].中國(guó)藥房，2014，25（43）：4067-4068.

[11] 李柏群，劉駿，陳紹成，等.正交設(shè)計(jì)優(yōu)選風(fēng)芍六君子湯的提取工藝[J].中國(guó)藥業(yè)，2016，25（6）：26-29.

[12] 田潤(rùn).HPLC法同時(shí)測(cè)定婦炎康片中丹酚酸B、隱丹參酮和芍藥苷[J].中成藥，2013，35（1）：91-94.

[13] 徐文英，徐曉娜，李莎，等.正交法優(yōu)化益腎膠囊中的提取工藝[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2013，33（19）：1588-1590.

[14] 劉弘，王俊杰.均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)選通心舒顆粒中藥材的提取工藝[J].中國(guó)藥房，2014，25（11）：1015-1016.

[15] 王聰穎，曹蕾，賀寶瑩，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選盆炎康栓提取工藝[J].中藥與臨床，2015，6（2）：30-33.

[16] 周政，劉麗萍，劉海濤，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選薏苡附子敗醬散提取工藝[J].中藥材，2016，39（4）：829-832.

[17] 王風(fēng)霞，袁捷，謝良友，等.多指標(biāo)正交優(yōu)選丹參木耳降脂復(fù)方提取工藝[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，30（5）：564-568.

Optimization of Water Extraction Technology for the Medicinal Materials in Compound Gastritis Capsule by Orthogonal Test

ZHENG Jiaoni1，LIU Ling1，HE Daohui2（1.Dept.of Pharmacy，Chongqing Emergency Medical Center/the Forth People’s Hospital of Chongqing，Chongqing 400014，China；2.Analysis and Test Center，Sichuan Research Institute for TCM，Chengdu 610041，China）

OBJECTIVE：To optimize the water extraction technology for the medicinal materials in Compound gastritis capsule.METHODS：Orthogonal test was adopted.Using the comprehensive score of contents of paeoniflorin，salvianolic acid B and weight of dry extract as evaluation index，effects of adding water amount，decoction time and times on water extraction technology were investigated，and verification test was conducted.RESULTS：Optimized water extraction technology was as follows as decocting for 3 times，120 min each time and adding 10-fold water each time.In verification test，average comprehensive score was 909.19（RSD＝1.84%，n＝3）.CONCLUSIONS：Optimized water extraction technology is stable and feasible，and can be used for the water extraction for each medicinal material in Compound gastritis capsule.

Compound gastritis capsule；Orthogonal test；Extraction technology；Paeoniflorin；Salvianolic acid B

R284.2

A

1001-0408（2017）31-4438-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.31.30

重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目（No.2012-2-31）

＊主管藥師。研究方向：藥物治療學(xué)、新藥研發(fā)。電話：023-63692203。E-mail：zhengjiaoni123@163.com

#通信作者：主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)、新藥研發(fā)。電話：023-63692203。E-mail：nini842@163.com

2017-03-27

2017-07-31）

（編輯：劉萍）