黑熊線粒體12S rRNA基因的克隆及序列分析研究

袁昕慧 袁慧艷 王 妍鞠 銘

(延邊大學農學院，延吉，133000)稿件運行過程

黑熊線粒體12S rRNA基因的克隆及序列分析研究

袁昕慧 袁慧艷 王 妍1鞠 銘

(延邊大學農學院，延吉，133000)稿件運行過程

東北亞種黑熊；12S rRNA；克隆；序列分析

為了解東北長白山黑熊線粒體基因的遺傳學特點，本研究利用已報道的部分熊科動物的線粒體基因的保守序列。本文采用PCR技術，首次從延邊圈養的黑熊的全血總DNA中擴增出了線粒體12S rRNA基因，基因長度為967 bp。將PCR產物純化回收后克隆于 pMD18-T Vector，成功構建了重組克隆質粒。并與已報道的四川黑熊、日本黑熊進行了序列比較分析，結果表明，長白山黑熊與四川黑熊的親緣關系比較近，在序列上具有較高的相似性。該研究為長白山黑熊遺傳物種鑒定和多樣性研究提供了重要的參考依據，也為更深入的研究亞洲黑熊分子生物學提供了重要的參考。

熊科(Ursidae)動物世界上共有6個屬(不含大熊貓Ailuropodamelanoleuca)，中國有3個屬，即棕熊屬(Ursus)，黑熊屬(Selenarctos)和馬來熊屬(Helarctos)。黑熊屬中，我國的為亞洲黑熊(Selenarctosthibetanus)，被列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》附錄Ⅰ、國家Ⅱ級保護野生動物及《中國瀕危動物紅皮書》物種 Ⅴ 中，該種全部分布于亞洲，共分 8 個亞種，中國有5個亞種，即指名亞種(S.t.thibetanus)、喜馬拉雅亞種(S.t.laniger)、四川亞種(S.t.mupinensis)、臺灣亞種(S.t.formosanus)、東北亞種(S.t.ussuricus)[1-3]。延邊地區位于吉林省東南部，是黑熊資源比較豐富的地區。目前人工養殖數達3 147頭，占全國養殖數的27.4%[4]，圈養的黑熊來源多為長白山野生黑熊繁殖而來。

多年來，國內外的相關學者和專家從不同學科不同領域對黑熊進行了廣泛而深入的研究，已經在美洲熊類基因組方面做了廣泛的研究，此外對大熊貓的研究也持續進行著[4-8]，國內亞洲黑熊也逐漸成為研究重點，研究報道陸續出現，如血型檢測、染色體組型分析、COI序列變異及其DNA條碼的應用等[9]；在亞洲黑熊四川亞種方面有線粒體 DNA cytb基因、ND3_ND4L和tRNA_Arg基因、細胞色素 C氧化酶亞基Ⅰ基因、ATP 8和ATP 6序列分析等基因組的序列研究[10-17]，但在東北長白山黑熊除了流行病學調查、黑熊基因 DNA 中部分微衛星位點的探討等小數量的文獻可查，線粒體基因的研究還未見報道。但是，以這些卓有成效的研究為參考，我們利用哺乳動物線粒體基因的保守序列設計引物，通過 PCR 克隆技術對東北亞黑熊線粒體的12S rRNA 基因進行克隆、測序，并分析其序列特點，為長白山黑熊的遺傳特點及多樣性分析研究提供了基礎資料，也為其他物種線粒體基因的研究提供了可靠的依據與科學參考。

1 材料與方法

1.1 樣本

所用材料為東北黑熊的全血，取自吉林省延邊朝鮮族自治州地區3家黑熊養殖場(20只東北黑熊的血液樣本)。

1.2 載體與主要試劑

質粒pMD 18-T Vector、Trans5a 大腸桿菌感受態細胞、PCR 試劑和所用的Taq酶購自Takara工程有限公司；膠回收試劑盒購自大連寶生物。

1.3 方法引物設計與合成

根據已報道的美洲黑熊(Ursusamericanus)、棕熊(Ursusarctos)和北極熊(Ursusmaritimus)(登錄號依次分別為：AF303109，AF303110，AF303111)的12S rRNA基因序列，我們設計了引物來擴增東北黑熊的12S rRNA基因(引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成)，其引物如下：

12S-F，5-CAAAGGTTTGGTCCTGGCCTTCCTA-3；12S-R，5-GTTTATCCAAGCACACTTTCCAGTA-3。

1.4 東北亞種黑熊線粒體12S rRNA基因的擴增與鑒定

應用基因組DNA提取試劑盒提取黑熊血液中線粒體基因組DNA，并以此為模板分別進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增結果。

PCR反應體系 50 μL，含dNTPs 0.2 mmol/L，MgCl21.5 mmol/L，ExTaqDNA聚合酶 2.5 U，DNA 提取物2μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性 5 min，然后95 ℃變性 1 min，退火溫度60 ℃ 1 min，72 ℃延伸 2 min，35個循環，最后 72 ℃延伸 10 min。

1.5 東北亞種黑熊線粒體12S rRNA基因的克隆與鑒定

將純化的東北亞種黑熊線粒體12S rRNA目的基因片段與pMD18-T Vector 連接，轉化至Trans5a感受態細胞，經氨芐青霉素 LB 平板篩選陽性克隆重組菌。用小量質粒提取試劑盒提取重組克隆質粒，進行PCR鑒定和EoR I、Sell I 雙酶切鑒定。

1.6 東北亞種黑熊線粒體12S rRNA基因的序列推導與分析

將PCR鑒定和EoR I、Sell I 雙酶切鑒定為陽性的對應菌液由英濰捷基(上海)貿易有限公司進行測序分析，并應用生物學軟件DNA star 與NCBI 上發表的序列比對分析。

2 結果與分析

2.1 東北亞黑熊線粒體12S rRNA 基因的擴增

12S rRNA 的預期目的片段長度為967 bp，黑熊樣本擴增產物12S rRNA正介于750～1 000之間(圖1)，與預期結果大小一致，說明 PCR 擴增成功。

圖1 PCR擴增結果Fig.1 Results of PCR amplification注：M.DL 2000 DNA marker；1～2.PCR擴增12S rRNA產物；3.PCR陰性對照Note：M.DL 2000 DNA marker；1-2.PCR amplification of 12S rRNA；3.Negative control

2.2 東北亞黑熊線粒體12S rRNA 基因克隆結果鑒定

克隆后，取菌液2μL進行PCR 擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示：所得條帶大小分別在967 bp左右(圖2)，與預期結果一致，說明克隆成功；將經過PCR 鑒定為陽性的重組質粒，分別應用EoR I、Sell I 進行雙酶切。經瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示：分別獲得大小為2 692 bp多和967 bp的條帶(圖3)，說明重組質粒中均含有目的基因。

圖2 克隆的PCR鑒定結果Fig.2 Results of clone identification by PCR注：M.DL 2000 DNA marker；1～5.黑熊樣本的克隆；6.PCR陰性對照 Note：M.DL 2000 DNA marker；1～5.Clone of black bear’s sample；6.Negative control

圖3 雙酶切鑒定結果Fig.3 Enzyme digestion identification注：M.DL 2000 DNA marker；1.PCR陰性對照；2～6.雙酶切產物Note：M. DL 2000 DNA marker；1.Negative control；2～6.Product of enzyme digestion

2.3 東北亞黑熊線粒體12S rRNA 基因測序結果

克隆的東北亞黑熊線粒體12S rRNA基因經英濰捷基(上海)貿易有限公司測定，東北亞黑熊線粒體

12S rRNA基因序列長度為967 bp，將GenBank中發表的美洲黑熊(Ursusamericanus)、眼鏡熊(Tremarctosornatus)、大熊貓、四川黑熊和狗(Canislupusfamiliaris)的12S rRNA與其進行比較，分析結果表明：與GenBank中發表的四川黑熊(DQ402478)12S rRNA基因的同源性最高，為98.7%(表1)，對角線以上為同源性比較，對角線以下為距離矩陣。利用MEGA 5.05 生成進化樹，東北黑熊與四川黑熊的Bootstrap值為91，可以認為這個分支是可靠的(圖4)。

本次測出的黑熊12S rRNA序列含341 個A，占35.30%；183 個G，占18.94%；224 個T，占23.19%；218 個C，占22.57%，G+C 含量為41.51%(圖5)。

圖4 6個物種12S rRNA的進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of 12S rRNA gene from six species注：12S-19-2：亞洲東北黑熊；AF303109：美洲黑熊；AY390363：大熊貓；AY729880：狗；DQ402478：亞洲黑熊四川亞種；L21883：眼鏡熊Note：12S-19-2：S.t.ussuricus；AF303109：Ursus americanus；AY390363：Ailuropoda melanoleuca；AY729880：Canis familiaris；DQ402478：S.t.mupinensis；L21883：Tremarctos ornatus

表1 6個物種的12S rRNA基因同源性比較結果

Tab.1 Homology comparison of 12S rRNA gene from six species

注：*為同源性最高的一組數值

Note：*The highest homology of a set of values

圖5 6個物種的序列比較Fig.5 Sequence comparison of 12S rRNA from six species

3 討論

我們根據已報道部分黑熊各亞種的線粒體基因組的信息設計了1對引物，成功擴增出了東北亞種黑熊長白山黑熊的線粒體12S rRNA基因序列，并成功構建了該基因的克隆載體，經序列測定分析，結果顯示，我們所擴增的基因序列與已報道的四川黑熊12S rRNA基因序列同源性高達98.7%，聚類于同一支，說明東北黑熊與四川黑熊親緣關系更接近。發現東北黑熊12S rRNA與四川黑熊基因全序列共有12個位點呈現變異，8個位點是轉換，占變異總數的66.7%，其中有4個C?T轉換，占總轉換位點的50%；A?G轉換有4個，占總轉換位點的50%，無顛換位點。此外，有1處堿基缺失，為A 缺失；3處堿基增添，為2個A 插入和1個T 插入。

東北黑熊12S rRNA與美洲黑熊基因序列相比共有41個位點變異，其中36個位點是轉換，A?G轉換有20個，占總轉換位點的55.6%，C?T轉換有16個，占總轉換位點的44.4%；1個位點為A?T顛換。此外，有1處堿基缺失和3處堿基插入。

為保證實驗結果的準確與可靠，實驗分4次對圈養的黑熊進行采血并提取其總DNA，每次提取5支，并對提取的DNA進行3次的PCR擴增與鑒定，最終選取最為理想的擴增產物進行測序比對，所獲得的結果相同，證明了本實驗的準確性與可靠性。

本實驗首次成功克隆出東北黑熊的線粒體12S rRNA的序列，并對其進行了初步的分析，填補本研究領域一項空白的同時也為探究黑熊線粒體基因組的遺傳特點、物種進化關系及物種多樣性分析提供了科學參考。

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Black bear；12S rRNA；Cloning；Sequence analysis

Cloning and Sequence Analysis of 12S rRNA Gene of Mitochondria of Asian Black Bear (Selenarctos thibetanus ussuricus)

Yuan Xinhui Yuan Huiyan Wang Yan*Ju Ming

(College of Agriculture，Yanbian University，Yanji，133000，China)

To understand the genetic characteristics of mitochondrial DNA of black bears at Changbai Mountain in northeast China，we designed primers according to published mitochondrial DNA sequences of some ursidae species.We amplified 12S rRNA genes by PCR method for the first time from the whole blood of captive black bears in Yanbian.The amplicon was purified，cloned into pMD18-T vector and sequenced.A 967 bp sequence of 12S rRNA was obtained.We compared the obtained sequences with published sequences of Sichuan and Japan black bears.Results showed that black bears at Changbai mountain have closer genetic relationships and high similarity in sequence with Sichuan black bears.Our results provide a reference for bear species identification，for study of the genetic diversity of the Changbai Mountain ecosystem，and for study of the molecular biology of Asiatic black bears.

2017-03-20

修回日期：2017-04-24

發表日期：2017-11-10

Q959.838

A

2310-1490(2017)04-569-06

袁昕慧，女，24歲，碩士研究生；主要從事寄生蟲分子生物學研究。E-mail：853786640@qq.com

*通訊作者：王妍，E-mail：2676806621@qq.com