苯乳酸與食品防腐劑聯合抑菌效果

寧亞維 - 閆愛紅 - 王世杰 - 王志新 - 李興峰 - 朱 宏 賈英民 -

(1. 河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2. 石家莊君樂寶乳業有限公司，河北 石家莊 050221；3. 北京工商大學食品學院，北京 102488) (1. College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang, Hebei 050018, China; 2. Shijiazhuang Junlebao Dairy Co., Ltd., Shijiazhuang, Hebei 050221, China; 3. Beijing Technology and Business University, School of Food and Chemical Engineering, Beijing 102488, China)

苯乳酸與食品防腐劑聯合抑菌效果

寧亞維1NINGYa-wei1閆愛紅1YANAi-hong1王世杰2WANGShi-jie2王志新1WANGZhi-xin1李興峰1LIXing-feng1朱 宏2ZHUHong2賈英民3JIAYing-min3

(1. 河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2. 石家莊君樂寶乳業有限公司，河北 石家莊 050221；3. 北京工商大學食品學院，北京 102488) (1.CollegeofBioscienceandBioengineering,HebeiUniversityofScienceandTechnology,Shijiazhuang,Hebei050018,China; 2.ShijiazhuangJunlebaoDairyCo.,Ltd.,Shijiazhuang,Hebei050221,China; 3.BeijingTechnologyandBusinessUniversity,SchoolofFoodandChemicalEngineering,Beijing102488,China)

以食源性病原菌Escherichiacoli和Listeriamonocytogenes為指示菌，研究了苯乳酸與常用食品防腐劑的聯合抑菌作用。采用微量二倍稀釋法和棋盤法分別測定苯乳酸與6種防腐劑的最小抑菌濃度及聯合抑菌指數，并通過時間—殺菌曲線進一步考察復配較優組合的協同抑菌效果。結果顯示：苯乳酸與乳酸鏈球菌素聯用對E.coli和L.monocytogenes分別表現為無關和相加作用；苯乳酸與對羥基苯甲酸乙酯聯用對2株指示菌均為相加作用；與EDTA-Na2和ε-聚賴氨酸聯用對2株指示菌均為無關作用；苯乳酸分別與苯甲酸鈉和山梨酸鉀聯用對E.coli均表現為協同作用，對L.monocytogenes均表現為相加作用。苯乳酸分別與苯甲酸鈉和山梨酸鉀聯合使用后，苯乳酸使用劑量降低75%，苯甲酸鈉和山梨酸鉀的使用劑量均可以降低50%。

苯乳酸；食品防腐劑；協同抑菌

苯乳酸(Phenyllactic acid，PLA)是近年來發現的一種新型天然抑菌物質，存在于蜂蜜[1]、酸面團[2]、泡菜[3]等食品中，可由乳酸菌代謝產生[2,4]。苯乳酸具有廣譜抑菌性，不僅能夠抑制革蘭氏陽性菌(如Staphylococcusaureus、Listeriamonocytogenes)和革蘭氏陰性菌[5-6](如Escherichiacoli、Salmoellaenterica、Providenciaatuartii、Klebsiellaoxytoca)，而且能夠有效抑制多種真菌[7](如Colletotrichumgloeosporioides、Aspergillusflavus、Penicilliumexpansum、Botrytiscinerea等)。此外，苯乳酸具有溶解性好、易于在食品體系中擴散、酸與熱穩定性高[5]等優點。然而苯乳酸的抑菌效力較低，如對細菌的最小抑菌濃度為1.25～5.00 mg/mL，對真菌的最小抑菌濃度為5～10 mg/mL[8]，較Nisin、ε-聚賴氨酸等生物防腐劑對應的最小抑菌濃度高數十倍。因此苯乳酸作為生物防腐劑使用價格相對較高，限制了其商業化應用。

“柵欄技術”在食品防腐劑的應用，通常是通過使用少量、多種防腐劑以達到良好防腐效果。多項研究表明防腐劑之間存在協同抑菌效應。如Liu等[9]研究了ε-聚賴氨酸與Nisin的聯合抑菌作用，結果表明二者聯合作用于E.coli、B.subtillis和S.aureus均表現出協同抑菌作用；Manalh?es等[10]研究了鼠李糖脂與Nisin對L.monocytogenes的協同作用，研究結果顯示鼠李糖脂與Nisin聯用可分別降低2種抑菌劑的使用濃度；高玉榮等[11]研究了納他霉素與山梨酸鉀、苯甲酸鈉、對羥基苯甲酸、硝酸鈉和脫氫乙酸鈉5種化學防腐劑的聯合抑菌效果，發現納他霉素與除苯甲酸鈉之外的4種防腐劑之間存在協同抑菌作用；莫樹平等[12]研究了ε-聚賴氨酸與乳酸鏈球菌素和那他霉素三者復配對食品中常見的腐敗菌與致病菌的抑制效果，結果表明生物防腐劑的聯合使用可顯著增強ε-聚賴氨酸的抑菌效果。因此，通過多種防腐劑的聯用可以減少單一防腐劑的添加量，降低成本，提高食品安全性。

本研究擬以常見食源性病原菌大腸桿菌(E.coliATCC 44752)和單核細胞增生李斯特菌(L.monocytogenes10403s)為指示菌，考察了苯乳酸與常用食品防腐劑山梨酸鉀、苯甲酸鈉等的聯合抑菌效果，以期為苯乳酸與防腐劑在食品防腐中的聯合使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種

E.coliATCC 44752和L.monocytogenes10403s：河北科技大學食品生物技術與安全實驗室保藏。

1.2 試劑與培養基

苯乳酸：純度98%，美國Sigma公司；

苯甲酸鈉：純度99.9%，西隴化工股份有限公司；

山梨酸鉀：純度99.9%，國藥集團化學試劑有限公司；

EDTA-Na2：純度99%，天津博迪化工股份有限公司；

對羥基苯甲酸乙酯：純度99%，國藥集團化學試劑有限公司；

Nisin：≥900 IU/mg，上海麥克林生化科技有限公司；

ε-聚賴氨酸：生物試劑，美國AMRESCO公司；

TSB：生物試劑，北京索萊寶科技有限公司；

NB：生物試劑，北京奧博星生物技術責任有限公司。

1.3 儀器與設備

紫外分光光度計：Evolution 220型，美國Thermo公司；

酶標儀：SpectraMax Plus 384型，美國Molecular Devices公司；

恒溫搖床：ZHWY型，上海智城分析儀器制造公司；

恒溫培養箱：ZSD-A1160型，上海智城分析儀器制造公司；

超凈臺：ZHJH-C110913型，上海智城分析儀器制造公司。

1.4 方法

1.4.1 最小抑菌濃度 參照Wiegand等[13]的方法采用二倍稀釋法測定苯乳酸及6種食品防腐劑的最小抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)。向無菌96孔板的前11列中加入滅菌培養基，食品防腐劑從第1～10列依次進行二倍梯度稀釋；第11列不加入食品防腐劑，作為陽性對照；第12列只加入培養基，作為陰性對照；最后每孔加入等體積的指示菌，終濃度約為5×105CFU/mL，37 ℃培養24 h，用SpectraMax Plus 384酶標儀進行測定。

1.4.2 聯合抑菌作用 根據各防腐劑的MIC值，參考Segal等[14]的方法略作修改進行聯合抑菌活性測定。用微量移液器沿無菌96孔微孔板的X軸方向(從左到右)在第2～8列每列孔中依次加入8倍 MIC至1/8 MIC的苯乳酸(A)；同樣，沿Y軸方向(從上到下)在第B～F行每行孔中加入8倍MIC至1/8 MIC的食品防腐劑(B)；最終得到A(2倍MIC至1/32 MIC)× B(1/32 MIC至2倍MIC)49種聯用組合，第1列和第A行分別為單獨加入A/B的對照組；然后加入1.0×106CFU/mL的菌懸液，37 ℃培養24 h后，用酶標儀進行測定。

通過計算部分抑菌濃度指數(Fractional Inhibitory Concentration Index，FICI)判斷協同作用效果，計算方法為：

FICI=FICA+FICB=MICA聯用/MICA單獨+MICB聯用/MICB單獨，

(1)

式中：

FICI——苯乳酸與食品防腐劑聯用時的部分抑菌濃度指數；

FICA——苯乳酸和食品防腐劑聯合使用時苯乳酸的部分抑菌濃度指數；

FICB——苯乳酸和食品防腐劑聯合使用時食品防腐劑的部分抑菌濃度指數；

MICA聯用——苯乳酸和食品防腐劑聯合使用時苯乳酸的MIC，mg/mL；

MICA單獨——苯乳酸單獨使用時的MIC，mg/mL；

MICB聯用——苯乳酸和食品防腐劑聯合使用時食品防腐劑的MIC，mg/mL；

MICB單獨——食品防腐劑單獨使用時的MIC，mg/mL。

當FICI≤0.5時，為協同作用；當0.52時，為拮抗作用。

1.4.3 時間—殺菌曲線 以棋盤法試驗結果作為參考，進一步考察了苯乳酸與苯甲酸鈉和山梨酸鉀較優組合下的聯合抑菌效果。將菌懸液濃度調至1.0×106CFU/mL分別加入含有苯乳酸、苯甲酸鈉、山梨酸鉀以及苯乳酸和苯甲酸鈉、山梨酸鉀兩兩混合培養液的試管中，使菌懸液終濃度為5×105CFU/mL。將上述含有防腐劑的菌懸液于37 ℃恒溫培養箱中培養，分別于0，2，4，6，9，12，24 h取樣，并采用平板計數法測定活菌數。以時間為橫坐標，lg CFU/mL為縱坐標繪制時間—殺菌曲線。

2 結果與分析

2.1 最小抑菌濃度

分別測定了苯乳酸和6種常見食品防腐劑對E.coli和L.monocytogenes的最小抑菌濃度。結果表明，苯乳酸對E.coli的MIC值為1.25 mg/mL，對L.monocytogenes的MIC值為2.25 mg/mL，與袁景環等[8]的研究結果一致；ε-聚賴氨酸對2株指示菌的抑菌效果強于苯乳酸等其余6種防腐劑，其對E.coli和L.monocytogenes的MIC值分別為0.156 0，0.007 8 mg/mL，ε-聚賴氨酸對L.monocytogenes的MIC值顯著低于對E.coli的，與Geornaras等[15]的研究結果一致；其次是Nisin，但其只能夠抑制革蘭氏菌L.monocytogenes，其MIC值為0.25 mg/mL，而對革蘭氏陰性菌E.coli無抑菌作用；EDTA-Na2對2株指示菌的MIC值相同均為0.625 mg/mL；對羥基苯甲酸乙酯對E.coli和L.monocytogenes的MIC值分別為0.625，1.000 mg/mL；山梨酸鉀對E.coli和L.monocytogenes的MIC值分別為12.5，28.0 mg/mL；苯甲酸鈉對E.coli和L.monocytogenes的MIC值分別為10.5，25.0 mg/mL。上述結果表明，各防腐劑間抑菌效應差異顯著，ε-聚賴氨酸和EDTA-Na2對2株指示菌抑制效果均較好；而食品中常用的化學防腐劑苯甲酸鈉和山梨酸鉀對細菌的抑制效果則較差。防腐劑的抑菌效果差異同其抑菌作用機制相關，而不同作用機制的防腐劑間聯合使用，更易于發揮協同增效抑菌作用。因此，有必要考察苯乳酸與上述防腐劑的聯合使用效應，以篩選能同苯乳酸發揮協同抑菌作用的防腐劑。

2.2 聯合抑菌作用

通過微量棋盤法考察了苯乳酸與食品防腐劑的聯合抑菌效應，結果見表1。對于L.monocytogenes本研究所選防腐劑均不能與苯乳酸聯用發揮協同抑菌作用，對于E.coli苯乳酸分別與苯甲酸鈉和山梨酸鉀聯用具有協同抑菌作用。山梨酸鉀和苯甲酸鈉主要用于抑制霉菌和酵母菌，對細菌抑制作用相對較弱。而苯乳酸與苯甲酸鈉聯用后，苯乳酸的濃度降為單獨使用時的1/2～1/4，苯甲酸鈉的濃度則降為單獨使用時的1/2～1/16，苯甲酸鈉的使用量由單獨使用時的10.50 mg/mL 降為0.65 mg/mL，使其使用量低于食品添加劑使用標準最大使用量1 g/kg(GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》)，可作為抑制細菌的防腐劑用于食品加工中。因此，苯乳酸與苯甲酸鈉聯用可以擴大苯甲酸鈉的抑菌譜，降低兩者的使用劑量。同樣，山梨酸鉀與苯乳酸聯用后，苯乳酸使用量降為單獨使用時的1/2～1/4，山梨酸鉀使用量降為單獨使用時的1/2～1/8。上述結果表明苯乳酸分別與山梨酸鉀和苯甲酸鈉聯用后，生物防腐劑苯乳酸和化學防腐劑苯甲酸鈉、山梨酸鉀使用劑量均顯著降低，因此若將其作為復合食品防腐劑可顯著降低使用成本，提高使用安全性。

表1 苯乳酸與食品防腐劑聯合抑菌活性Table 1 Determination of the antibacterial activity of PLA in combination with preservatives

2.3 時間—殺菌曲線

通過時間—殺菌曲線對棋盤法選出的復配較優組合的聯合抑菌效果進行考察。由圖1可知，1/4 MIC濃度苯乳酸對E.coli沒有抑菌作用，1/2 MIC濃度苯甲酸鈉作用E.coli24 h后，與對照組相比活菌數降低了1.69個對數值，然而二者聯合作用6 h后，菌落數降低了3.41個對數值，表現出顯著抑菌作用；作用9 h后，聯用組與MIC濃度苯甲酸鈉對E.coli抑菌趨勢基本相同，表明苯乳酸與苯甲酸鈉具有顯著協同抑菌作用。

由圖2可知，1/4 MIC濃度苯乳酸和1/2 MIC濃度山梨酸鉀分別作用于E.coli均不能抑制其生長。然而1/4 MIC濃度苯乳酸與1/2 MIC濃度山梨酸鉀聯合作用6 h后，活菌數降低了3.63個對數值；聯合作用24 h后，菌落總數較初始值沒有顯著增加，表明苯乳酸與山梨酸鉀聯用可以有效抑制E.coli的生長繁殖。

苯乳酸可增加環境中氫離子的濃度，山梨酸鉀和苯甲酸鈉的抑菌活性會隨介質pH降低而增加，因此苯乳酸可以增強苯甲酸鈉和山梨酸鉀的抑菌作用效果；此外，苯甲酸鈉的作用機理是抑制微生物細胞呼吸酶系的活性，尤其能夠阻礙乙酰輔酶A縮合反應，從而起到抑菌作用；山梨酸鉀的抑菌機制在于它能與微生物細胞中酶的巰基形成共價鍵，使酶喪失活性，破壞許多重要酶系[16]；苯甲酸鈉和山梨酸鉀順利進入微生物細胞是發揮抑菌作用的前提，苯乳酸能夠破壞細菌的屏障結構——細胞壁[5]，從而有利于苯甲酸鈉和山梨酸鉀進入細胞內發揮抑菌作用。因此，苯乳酸與山梨酸鉀和苯甲酸鈉聯合使用具有協同抑菌作用。

圖1 苯乳酸與苯甲酸鈉聯用對E. coli的時間—殺菌曲線

Figure 1 Time-kill curve of PLA in combination with sodium benzoate againstE.coli

圖2 苯乳酸與山梨酸鉀聯用對E. coli的時間—殺菌曲線

Figure 2 Time-kill curve of PLA in combination with potassium sorbate againstE.coli

3 結論

本試驗研究了苯乳酸與常用食品防腐劑的聯合抑菌效果，其中苯乳酸與所選用的6種防腐劑聯用對L.monocytogenens均不產生協同抑菌作用，而苯乳酸與2種化學防腐劑——苯甲酸鈉和山梨酸鉀聯用對E.coli具有協同增效作用，FICI分別為0.312，0.375；聯用后，苯乳酸使用劑量降低75%，苯甲酸鈉和山梨酸鉀均降低50%。本研究篩選了能與苯乳酸聯合使用發揮協同抑菌作用的食品防腐劑，可為苯乳酸在食品防腐中的應用研究提供理論依據；下一步工作將考察苯乳酸與常用食品防腐劑聯用對食品基質的保鮮防腐效應。

[1] TUBRTOSO C I G, BIFULCO E, CABONI P, et al. Lumichrome and phenyllactic acid as chemical markers of thistle (GalactitestomentosaMoench) honey[J]. Journal Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59: 364-369.

[2] LAVERMICOCA P, VALERIO F, EVIDENTE A, et al. Prification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdoughLactobacillusplantarumstrain 21B[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(9): 4 084-4 090.

[3] LI Xing-feng, NING Ya-wei, LIU Dou, et al. Meabolic mechanism of phenyllactic acid naturally occurring in Chinese pickles[J]. Food Chemistry, 2015, 186: 265-270.

[4] VALERIO F, LAVERMICOCCA P, PASCALE M, et al. Production of phenyllactic acid by lactic acid bacteria: an approach to the selection of strains contributing to food quality and preservation[J]. FEMS Microbiology Letters, 2004, 233(2): 289-295.

[5] DIEULEVEUX V, LEMARINIER S, GUEGUEN M. Antimicrobial spectrum and target site ofD-3-phenyllactic acid[J]. International Journal of Food Microbiology, 1998, 40(3): 177-183.

[8] 袁景環, 貢漢生, 孟祥晨. 苯乳酸的抗菌作用及其抗菌機理的初步研究[J]. 食品工業, 2009(5): 14-17.

[9] LIU Hong-xia, PEI Hou-bao, HAN Zhi-nan, et al. The antimicrobial effects and synergistic antibacterial mechanism of the combination ofε-Polylysine and nisin againstBacillussubtilis[J]. Food Control, 2015, 47: 444-450.

[11] 高玉榮, 王雪平. 食品化學防腐劑與納他霉素的協同抑菌作用研究[J]. 現代食品科技, 2010, 26(6): 558-561.

[12] 莫樹平, 王惠惠, 柏建玲, 等.ε-聚賴氨酸復合防腐劑對常見致病菌和污染菌的抑制作用[J]. 食品與機械, 2012, 28(6): 109-111.

[13] WIEGAND I, HILPERT K, HANCOCK R E W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances[J]. Nat Protocols, 2008, 3(2): 163-175.

[14] SEGAL E, SEMIS R, NAHMIAS M, et al. Evaluation of antifungal combinations of nystatin-intralipid againstAspergillusterreususing checkerboard and disk diffusion methods[J]. Journal de Mycologie Médicale, 2015, 25: 63-70.

[15] GEORNARAS I, YOON Y, BELK K E, et al. Activity ofε-Polylysine agaistEscherichiacoliO157:H7,SalmonellaTyphimurium, andListeriamonocytigenesin various food extracts[J]. Journal of Food Science, 2007, 72: 330-334.

[16] 侯振建. 食品添加劑及應用技術[M]. 北京: 化學工業出版社, 2004: 126-127.

Studyonantibacterialactivityofphenyllacticacidcombined
withfoodpreservatives

The antibacterial activity of phenyllactic acid (PLA) combined with food preservatives against foodborne pathogensEscherichiacoliandListeriamonocytogeneswas studied. The minimal inhibitory concentrations were determined by broth micro-dilution method and the interaction of PLA with food preservatives was determined using the checkerboard test. Furthermore, the synergistic effect of the optimized combination was evaluated through the time-kill assay. Results showed that PLA combined with nisin showed indifference effect againstE.coliand additive effect againstL.monocytogenes. The interaction of PLA and ethylp-hydroxybenzoate showed an additive effect againstE.coliandL.monocytogenes. PLA combined with EDTA-Na2orε-poly-L-lysine was observed indifference againstE.coliandL.monocytogenes. PLA combined with sodium benzoate or potassium sorbate exhibited synergistic effect againstE.coli, and additive effect againstL.monocytogenes. The dosage of PLA was decreased 75%, and that of sodium benzoate or potassium sorbate reduced 50%, when PLA combined with sodium benzoate or potassium sorbate againstE.coli.

phenyllactic acid; food preservatives; synergistic antibacterial effect

河北省杰出青年基金(編號：C2016208142)；河北省自然科學基金(編號：C2016208150)；國家自然科學基金(編號：31401653)

寧亞維，女，河北科技大學副教授，博士。

賈英民(1961—)，男，北京工商大學教授，博士。

E-mail: jiayingmin@btbu.edu.cn

2017—03—23

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.09.025