蘋果樹根際高效解鉀菌的篩選及鑒定?

姜霽航，彭霞薇，顏振鑫，何不為，朱昌雄，國 輝**，耿 兵**

（1．北京林業大學生物科學與技術學院，北京 100083；2.中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所，北京 100081）

蘋果樹根際高效解鉀菌的篩選及鑒定?

姜霽航1，彭霞薇1，顏振鑫1，何不為1，朱昌雄2，國 輝1**，耿 兵2**

（1．北京林業大學生物科學與技術學院，北京 100083；2.中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所，北京 100081）

為探明蘋果樹根際解鉀菌的種群特征和解鉀性能，從蘋果樹根際土壤中分離獲得解鉀能力較強的高效解鉀菌。本研究以鉀長石為唯一鉀源，分離獲得118株具有解鉀活性的菌株，重復片段 PCR基因指紋分析（Repetitive-element PCR, rep-PCR）聚為29個類群。利用火焰分光光度法測定菌株解鉀能力，獲得5株高效解鉀菌，平均解鉀活性達到41.47mg·L-1，其中K105的解鉀能力最強，有效態鉀增長23.09%。采用H2O2消煮后測得的 K+濃度升高，有效態鉀增長最高達 31.22%。采用形態特征觀察、生理生化特性檢測和基于 16S rRNA基因序列的系統發育分析對高效解鉀菌株進行鑒定。結果表明：K1為不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）、K98、K105和K115為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、K168為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。研究結果可為開辟新型高效解鉀菌，為連作土壤的改良和蘋果專用微生物菌肥的開發提供依據。

解鉀菌；重復片段PCR基因指紋分析；篩選；鑒定

鉀是植物的三大元素之一，對植物的生長起著十分重要的作用。鉀元素在植物體內主要以K+的狀態存在于細胞液中，是很多酶的催化劑。在植物生長的過程中有近60種酶需要鉀加以活化，鉀元素間接決定了植物的生長速度。土壤中鉀元素一般可分為水溶性鉀、交換性鉀、非交換性鉀和礦物質鉀，能直接被植物吸收利用的有效鉀約占總量的2%，有95%的鉀以緩效態形式存在于鉀長石或云母等硅酸鹽礦物中，不能被植物直接吸收利用[1]。因此，研究如何將這些土壤礦物中的鉀釋放出來，成為作物能吸收利用的可給態鉀，具有理論和實踐意義。

中國土壤中可溶性鉀資源匱乏，但是以鉀長石為主的難溶性硅鋁酸鉀資源存儲豐富，分布廣泛，南方儲存尤為豐富[2]。土壤中的鉀礦物主要以穩定的硅酸鹽形式存在，而解鉀菌是從土壤中分離出的一種能利用鋁硅酸鹽和磷灰石類礦物的細菌，可作為微生物肥料，分解鉀長石、磷灰石等不溶性的硅鋁酸鹽無機礦物質，促進難溶性的鉀、磷、硅、鎂等養分元素轉化成可溶性養分，增加土壤速效養分的含量，促進作物生長發育，提高產量[3]。研究表明，生物有機質可改良土壤質量，減少土壤中氮磷鉀等養分淋失[4]。目前利用土壤中的解鉀微生物，有效開發鉀長石資源，從中提取鉀，制造鉀肥是解決中國可溶性鉀資源緊缺現狀的重要途徑[5]。而根際解鉀微生物比普通解鉀菌具有更顯著的優勢，不但能轉化土壤中難溶性鉀，改造土壤結晶構造，還能分泌促生物質，活化根際土壤微生物態環境，促進植物生長[6]。由于不同植物根際的解鉀細菌的種類和數量存在差異，不同種類的解鉀菌或不同菌株之間的解鉀能力存在較大差異，所以從特定植物根際篩選高效解鉀細菌的工作顯得尤為重要。

近年來，隨著蘋果品種更新換代和密植的發展，新老果園的重茬，常常導致蘋果再植病的發生，表現為植株矮小，生長衰弱，果實品質低下等癥狀[6]。許多高產果園蘋果種植模式均為多年連作，這種種植模式下土壤鉀素輸出量大，有效鉀虧缺嚴重[7]。在連作模式下，土壤中根際有益菌的種類和數量降低，有害真菌逐漸富集。微生物的“解鉀”作用，是由于微生物代謝過程中所產生的無機酸和有機酸的作用結果，它能明顯提高連作土壤中速效鉀的含量，有效降低土壤中蘋果連作病原菌鐮刀菌的發生率[8]。研究表明，根際促生菌在改善蘋果樹連作中扮演著重要的角色[9]。解鉀菌是常用的促生根際菌（PGPR）之一，通過在植物根際定殖，可促進植物生長，提高產量和營養利用率[1-2,10-12]。國內外研究表明，目前研究較為廣泛的解鉀菌多為膠質芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）和克霍爾德菌（Burkholderia sp.）[13-15]，解鉀微生物多樣性還有待開發，目前國內有關解鉀細菌的研究與應用主要集中在農作物上，從多年生作物上篩選應用解鉀細菌的報道鮮見，國內外鮮有蘋果樹根際解鉀菌的相關研究報道。本研究通過蘋果樹根際高效解鉀微生物的篩選，對促進解鉀微生物多樣性，利用生物途徑改善缺鉀現狀，緩解土壤連作障礙具有十分重要的現實意義。

本研究以鉀長石為唯一鉀源，從蘋果樹根際土壤中分離出解鉀分離株，rep-PCR基因指紋分析聚類，通過發酵培養，對發酵液中速效鉀含量進行測定，獲得高效解鉀菌，并對解鉀菌進行解鉀能力測定和菌種鑒定，重點探討連作蘋果樹根際解鉀菌的解鉀能力，并試圖比較合理評估解鉀菌的解鉀作用。旨在開辟新型高效解鉀菌，充分利用土壤鉀素資源，為連作土壤的改良和蘋果專用微生物菌肥的開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

土壤樣品取自山東省泰安市多年生蘋果園，分別采集多年生果樹和栽植后表現出連作障礙的幼苗根際土，土壤理化性質如表1，每個區隨機抽取6個點采樣，共12份樣品，取5-10cm土層，把根際土壤連同樹根一起裝入無菌袋，貼上標簽編號。抖掉根際附著的土壤，將同一蘋果園區的6個樣品混合，用于解鉀菌的分離。帶回實驗室放置于冰箱4℃保存。

1.1.2 培養基及溶液

LB液體培養基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，H2O 1000mL。

表1 蘋果樹根際土壤理化性質Table 1 Soil properties of the apple rhizosphere region

LB固體培養基：瓊脂粉 15g，其它成分同 LB液體培養基。

解鉀菌分離液體培養基：蔗糖 5g，MgSO4·7H2O0.5g，Na2HPO42g，CaCO30.1g，FeCl30.005g，鉀長石（K2O·Al2O3·6SiO2）粉（150 目）1.0g，H2O 1000mL。

解鉀菌分離固體培養基：瓊脂粉15g，其它成分同解鉀菌分離液體培養基。

K標準系列溶液：KCl 0.19g（110℃烘2h）溶于蒸餾水中，定容至1000mL，即為100mg·L-1的K標準溶液，分別吸取0、2、5、10、20、30、40mL至容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，配置成0、2、5、10、20、30、40mg·L-1的 K 標準溶液[16]。

1.2 方法

1.2.1 解鉀菌分離篩選

稱取10g新鮮土樣置于裝90mL無菌水的250mL錐形瓶中，利用28℃、180rpm全溫振蕩培養箱振蕩，充分混勻制成土壤懸浮液，按梯度稀釋為10-3、10-4、10-5濃度，各取0.1mL稀釋液涂布于以鉀長石為唯一鉀源的解鉀菌分離培養基中，每個濃度 3個重復，放入 28℃培養箱中培養 3～4d。從中篩選較大的、圓形透明、表面粗糙黏稠的單菌落[2]進行四分體劃線純化，反復進行3次，同時用顯微鏡觀察菌落純度，直至獲得純培養。

1.2.2 rep-PCR分析及聚類圖構建

采用天根生化試劑盒，按照說明書操作步驟進行樣品DNA的提取。對各解鉀菌分離株的基因組進行基因外重復回文序列（repetitive-element PCR,rep-PCR）DNA指紋分析，用軟件CORSS CHECKER進行凝膠分析、SAS9.0進行聚類分析，構建蘋果樹根際解鉀細菌的rep-PCR聚類分析圖。

rep-PCR 采用引物為 BOX-AIR（5′-CTACGGC AAGGCGACGCTGACG-3′）[16]。rep-PCR 反應體系為：10×PCR Buffer 2.5μL，10mmol·L-1dNTP 2μL，25mmol·L-1MgCI21.5μL，10μmol·L-1引物 2μL，模板1μL，Taq酶0.15μL，補加雙蒸水至30μL。rep-PCR反應條件為：95℃、7min—94℃、1min— 53℃、1min—65℃、8min，共 35個循環，再 65℃、16min—4℃、Pause。PCR產物進行 1%的瓊脂糖凝膠電泳，電解液為1×TAE，Marker選用Trans 2KTMPlusⅡDNA Marker。

1.2.3 解鉀能力測定

（1）鉀標準曲線的繪制

將配制好的鉀標準系列溶液，用含 K+0mg·L-1的鉀標準液將火焰光度計上檢流計讀數調整為0，用40mg·L-1質量濃度的鉀標準液將火焰光度計上檢流計調為滿度（100），然后按鉀的質量濃度從稀到濃依次測定不同質量濃度下的鉀離子含量（mg·L-1），記錄檢流計讀數。以檢流計讀數為縱坐標，鉀的質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線[16]。

（2）細菌的培養

將篩選獲得的解鉀菌在解鉀菌分離培養基平板上培養48h，挑取單菌落接種于解鉀菌分離液體培養基中，28℃、180rpm全溫振蕩培養箱培養 72h，獲得處理組（接菌）發酵液。在250mL三角瓶中裝入50mL培養液，高壓滅菌鍋121℃高溫滅菌20min，冷卻至室溫。處理組（接菌）按 4% 的接種量接種發酵液，28℃、180rpm全溫振蕩培養箱培養72h測定速效鉀含量。以對照組（不接菌）中速效鉀含量為基準計算獲得菌株的解鉀能力。

（3）鉀離子的測定

取步驟（2）中培養 72h后的培養液 20mL，6000r·min-1離心20min，取上清液用火焰分光光度計（棱光FP6410式）測定其中K+含量；另取20mL培養液，加4%H2O2，高壓滅菌鍋121℃高溫滅菌處理20min，6000r·min-1離心 20min，測上清液中 K+的含量[17]。

（4）解鉀活性的測定

將步驟（3）中得到的上清液與鉀標準系列溶液一起在火焰分光光度計上進行測定，根據標準曲線讀出待測上清液相對應的K+含量。

1.2.4 菌株鑒定

（1）菌種形態與生理生化分析

采用革蘭氏染色法對菌株的形態進行顯微鏡觀察，并結合生理生化性質實驗初步確定菌株種屬。參照Shirking等[18]的方法對菌株進行生理生化鑒定。

分別在25℃、28℃、30℃、37℃、45℃共5個溫度梯度下，180r·min-1條件下振蕩培養 48h，不同溫度的處理各設3個重復，測定各發酵液600nm下0D值。

用 HCl和 NaOH調節培養基的 pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在5個pH梯度下，30℃、180r·min-1條件下振蕩培養48h，不同pH的處理各設3個重復，測定各發酵液600nm下0D值。

（2）16Sr RNA基因序列分析

根據解鉀能力測定和聚類結果，選取具有高效解鉀能力的解鉀菌進行菌株鑒定。

TaqDNA聚合酶、2×GC Buffer1、dNTPs試劑由北京某公司提供；采用擴增細菌16SrDNA的一對保守通用引物，由北京某生物技術有限公司提供。正向引物27F（5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'）；反向引物 1492R（5'-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3'）。PCR 體系為 2×GC Buffer one25μL，dNTPs1.25μL，10pmol 引物各 2.5μL，5U·μL-1Taq 酶 0.5μL，無菌水 17.25μL[19]。反應程序[12]如表 2。

表2 16S rRNA聚合酶鏈式反應體系Table 2 16S rRNA polymerase chain reaction system

將測得的菌株序列上傳至 NCBI數據庫中進行BLAST分析比對，從比對結果中挑選相似性較高菌株的16S rRNA基因序列，通過Clustal X進行多重序列比對，并用MEGA5. 0軟件，以Neighborjoining法構建系統發育樹[19]。

2 結果與分析

2.1 土壤中解鉀菌的分離與篩選

從蘋果樹根際中共分離得到 118株具有解鉀能力的細菌分離株，菌株編號為“K”和“分離順序”。菌落形態呈近圓形或橢圓形、白色或灰白色、半透明或不透明、大部分邊緣規則、生長速度中等。

將分離獲得的 118個解鉀分離株進行 rep-PCR基因指紋分析，構建其DNA指紋聚類圖，如圖1。將118個解鉀菌聚為29個類群，其中K1、K10、K13、K17、K22、K24、K28、K32、K48、K49、K50、K55等分離株具有完全一致的電泳 DNA指紋圖譜（圖2），被聚為同一類群，其余的28種分離株相異百分數為0.4水平上，都有各自獨立的特征譜帶，說明各分離株的基因組之間存在顯著異質性，表現出豐富的基因型多態性。

圖1 蘋果樹根際解鉀菌的rep-PCR DNA指紋聚類圖Fig. 1 Cluster analysis of apple rhizospheric potassiumsolubilizing bacteria based on the rep-PCR DNA fingerprints

圖2 部分解鉀分離株的rep-PCR凝膠電泳結果Fig. 2 The result of rep-PCR gel electrophoresis of part potassium-solubilizing bacterial isolates

2.2 土壤中解鉀菌菌株解鉀能力的測定

對照組（CK）鉀離子含量為31.73mg·L-1，以此為基準計算得到所有菌株的解鉀能力，結果見圖3。由圖可見，29個菌株培養液其K+含量與CK差異均達極顯著水平（P＜0.01）。與 CK相比，培養 72h后未加 H2O2滅菌的處理中，各株菌的鉀增加4.71%～23.09%，不同菌株解鉀能力存在顯著差異，其中K1、K98、K105、K115、K168的解鉀能力最強，有效態鉀分別增加18.43%、15.62%、23.09%、20.79%、21.79%。培養液中 K+含量＜35mg·L-1的有 4株，占13.79%，35～40mg·L-1的有 6株，占 20.69%，＞40mg·L-1的有19株，占65.51%，培養液中K+含量越高說明菌株的解鉀能力越強。

研究發現，大部分菌株培養液加4%H2O2消化后溶液中的鉀離子濃度高于未加的處理，與未經處理組得到的結果差異顯著，鉀含量增加量最高可達12.26倍。這可能是因為，H2O2的消化對鉀長石有一定的溶解作用；也可能是解鉀細菌在分解鉀長石粉時，一部分溶解后存在于發酵液中，還有一部分鉀在菌體中積累起來，供細菌自身生長繁殖需要，某些解鉀菌具有莢膜結構，例如芽單胞菌屬和不動桿菌屬，莢膜的黏附作用可以吸附礦物釋放的鉀離子，培養液經4%H2O2溶液高溫消煮后，細菌莢膜被氧化分解，莢膜吸附的鉀離子被釋放出來。

圖3 29個解鉀類群培養液中鉀離子含量的比較Fig. 3 Comparision of K+ content in culture medium of 29 potassium-solubilizing groups

2.3 5株解鉀能力較強的蘋果樹根際解鉀菌的分類鑒定

2.3.1 形態鑒定

選取 5株高效解鉀菌的菌落，其形態和菌落特征見表3。由表可見，其中K1、K115、K105、K98菌株均為革蘭氏陰性菌，為無芽孢的桿菌，K168菌株為革蘭氏陽性菌；菌落顏色有乳白色、淡黃色；除 K115、K105外其它菌落表型均呈濕潤黏稠狀。

2.3.2 生理生化性質

由表4可知，5株菌落在溫度為28℃、pH為7.0～8.0的條件下生長最適宜；篩選獲得的5株解鉀菌生理生化性質如表5所示，5株細菌均可利用葡萄糖，可水解明膠，除K98外均不能分解吲哚。

表3 形態鑒定結果Table 3 The morphology colony and basic characteristics of morphological

表4 5株解鉀菌在不同溫度梯度和pH梯度下的OD600值Table 4 OD600 value of 5 potassium-solubilizing bacteria under different temperature and pH gradient

表5 生理生化性質Table 5 Physiological and biochemical characteristics

2.4 土壤中解鉀菌菌株鑒定

2.4.1 GenBank數據庫數據比對

測序所得的5株功能菌株16SrRNA基因序列長度均在1500bp左右，將5株菌株序列在NCBI中進行BLAST同源性比較，同時與GenBank中的核酸數據進行對比分析，獲取同源性較高的相鄰種、屬的16SrRNA序列，比對結果如表6所示，其中假單胞菌屬在整個樣品中屬于優勢屬。

表6 5株高效解鉀菌的16S rRNA基因序列比對Table 6 16S rRNA gene sequence blast of 5 potassium-solubilizing bacteria

2.4.2 系統發育及同源性分析

對解鉀能力最強的5株菌株進行PCR擴增，將獲得的16SrRNA基因序列提交到NCBI數據庫進行序列比對，選取同源性較高的菌株，利用MEGA5.0軟件的Alignment Explorer程序進行多序列同源性分析，并通過該軟件的 Neighbor-Joining法構建根際促生細菌的系統進化樹如圖4、圖5、圖6。由圖可見，K1菌株與不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）的遺傳進化距離最近，與已知菌株Acinetobacter sp.（GQ369439.1）的16S rRNA的基因序列同源性達到99%。菌株K98、K105、K115均屬假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），其中菌株 K98與已知菌株Pseudomonas sp.48XA（DQ103513.1）的16S rRNA的基因序列同源性最大，高達到99%；菌株K105與已知菌株熒光假單胞菌Pseudomonas rhodesiae strain（KF147019.1）的16S rRNA的基因序列同源性最大，達到99%；菌株K115與已知菌株Pseudomonas sp.（GU784937.1）的16S rRNA的基因序列相似性達到99%。菌株K168與芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）的遺傳進化距離最近，與已知菌株解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens（KP261025.1）的16S rRNA的基因序列相似性達到 99%。結合各菌株的菌體形態、菌落特征和生理生化性質，初步確定菌株K1為不動桿菌屬（Acinetobacter sp.），菌株K98、K105、K115均為假單胞桿菌屬（Pseudomonas sp.），菌株K168為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。因此，可在這3個屬內挖掘高效解鉀微生物，開發高效解鉀微生物資源。

圖4 基于16S rRNA基因序列的解鉀菌K1的系統發育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of the strain K1 based on 16S rRNA gene sequence

圖5 基于16S rRNA基因序列的解鉀菌K98、K105、K115的系統發育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of the strains K98, K105, K115 based on 16S rRNA gene sequence

圖6 基于16S rRNA基因序列的解鉀菌K168的系統發育樹Fig. 6 Phylogenetic tree of the strain K168 based on 16S rRNA gene sequence

3 討論與結論

3.1 討論

解鉀菌又稱硅酸鹽細菌（Silicate bacteria），是一類能夠分解鉀長石、云母等硅酸鹽類礦物，把土壤中難溶性鉀分解、轉化成為可以被作物直接吸收的有效鉀并能分泌促進植物生長的活性物質的微生物[17，20]。大多數解鉀菌都是從土壤中分離得到的，而根際土壤中更容易分離得到高效解鉀菌[21]。根際解鉀菌不僅可以改良土壤結構、降解有毒物質，還可以促進植物生長，防治植物病害[1]。近年來有研究表明，包括根際解鉀菌在內的根際土壤功能菌可誘導植物產生生長激素，增強植物對環境的忍耐力及對病原菌的抗性，從而起到促生作用[22]。國內外研究表明，目前發現的鉀礦物分解菌主要有硅酸鹽細菌，包括環狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）、膠質芽孢桿菌（Bacillus nutcilaginosus）和土壤芽孢桿菌（Bacillus edaphicus）3個種[13-15]。但本研究中獲得的5株高效解鉀菌中，K1為不動桿菌屬，K168為解淀粉芽孢桿菌，K105為熒光假單胞菌，K98和 K115為假單胞菌屬。不同的土壤或作物其根際引起硅酸鹽細菌種群的分布存在一定差異，針對蘋果樹相關根際解鉀菌的報道很少。本研究從山東泰安蘋果園獲得土壤樣品，得到118株具有解鉀能力的細菌，占分離總細菌數（3.15×107個·mL-1）的 37.46%，說明采集的土壤樣品中解鉀菌的數量占較高比例。118株解鉀菌株通過rep-PCR聚類分析聚為29個類群，測定解鉀活性后獲得5株高效解鉀菌，經16Sr RNA基因測序分析，結合其菌體形態和菌落特征、生理生化特征，將K1鑒定為不動桿菌屬（Acinetobacter sp.），K98、K105、K115鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），K168 鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。

研究表明，鉀長石與菌體相互作用的第一步是吸附，絕大多數微生物包括微生物細胞或酶，以及微生物在生長代謝或殘體分解過程中釋放出的小分子有機酸和大分子物質，以吸附態的形式與土壤礦物作用，形成細菌-礦物復合體[23]。本研究中，與對照組相比，有些菌株培養 72h后培養液中鉀含量反而降低，這可能是由于菌體與鉀長石形成復合體，對培養液中本來存在的鉀元素有一定的吸附作用。

關于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）和芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）的解鉀活性已有報道[22,24-26]，Bhattacharya在鹽田中發現1株具有解鉀活性的不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）[27]，是一類稀有解鉀菌，楊紹周等[28]曾發現一株不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）屬具有解磷活性，而目前對該類菌解鉀活性的研究報道較少, 對其進一步研究有助于緩解鉀肥短缺的現狀和開發新一代穩定的功能菌種。

本研究發現，4%H2O2消煮處理的發酵液中的鉀離子濃度明顯高于未消煮處理的發酵液，這可能是由于解鉀細菌在分解鉀長石粉時，一部分鉀溶解在發酵液中，還有一部分鉀在菌體中積累起來，供細菌自身生長繁殖需求；有些細菌具有莢膜結構，細菌莢膜也可吸附鉀離子，經H2O2消煮處理，莢膜多糖被氧化分解，使吸附的鉀離子釋放出來。經過H2O2處理后所檢測到的鉀離子包括溶液中游離態的鉀、菌體吸附的鉀和部分細胞內的鉀，這樣計算得到的解鉀效率是最貼近真實情況的[29]。而培養基中鉀長石中的鉀僅包括溶液中游離態的鉀和菌體所吸附的鉀兩部分，研究表明被菌體所吸附的鉀只占一小部分[29]，Eisenstadt[30]利用高特異性42K的泄漏間接檢測枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）生長、產芽胞過程中鉀含量的變化，在細菌生長對數期鉀元素含量僅占細胞干重的2.5%～3%，大部分通過解鉀菌的分解作用變成游離態鉀離子。從土壤中篩選的菌株具有一定解鉀能力，但未經處理的菌株解鉀能力并不高，通過加長對菌的浸出時間和對菌細胞膜的破壞可以提高培養液鉀離子濃度，這可為高效解鉀菌的篩選提供理論基礎和技術指導。

解鉀細菌的生長和解鉀性能受光照、水分、溫度等外界環境條件的影響，因此，解鉀菌在田間的施用效果有待進一步研究。近年來植物根際促生菌中研究較多的細菌類群是固氮細菌、解磷細菌[9]，對解鉀菌的研究相對較少，本實驗在探討根際高效解鉀菌的篩選及解鉀活性的同時，獲得一些具有研究價值和應用潛力的根際促生細菌，以期為改善蘋果樹根際微生態環境，研制開發蘋果樹微生物菌肥提供科學依據。

3.2 結論

解鉀菌解鉀能力的強弱是作為評價其性能的重要指標。本研究從蘋果樹根際分離出118個解鉀分離株，rep-PCR聚為29個解鉀類群，通過解鉀活性的測定獲得 5株高效解鉀菌，具有明顯解鉀優勢，鉀離子含量最高達41.47mg·L-1，菌株K105的解鉀能力最強，有效態鉀增長 23.09%。5株高效解鉀菌最適生長pH范圍為7.0～8.0，最適生長溫度為28℃。經生理生化和分子生物學鑒定，篩選獲得的解鉀菌分別屬于不動桿菌屬 Acinetobacter sp.，假單胞菌屬Pseudomonas sp.，芽孢桿菌屬Bacillus sp.，其中假單胞菌屬Pseudomonas sp.為優勢菌屬。4%H2O2處理后的培養液中可溶性鉀濃度明顯高于未經 4%H2O2處理的培養液，經處理得到的鉀離子含量更接近培養液中鉀離子的實際含量。

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Isolation and Identification of Potassium-Solubilizing Bacteria from Rhizosphere Soil of Apple Tree

JIANG Ji-hang1, PENG Xia-wei1, YAN Zhen-xin1, HE Bu-wei1, ZHU Chang-xiong2, GUO Hui1, GENG Bing2
(1.College of Biological Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2.Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100081)

In order to detect the population properties and potassium-dissolving characteristics of potassium-dissolving bacteria existing in apple rhizosphere soil, the highly efficient potassium-dissolving bacterial isolates were gained from the rhizosphere soil of apple trees. 118 strains with the ability of potassium-dissolving were isolated with potassium feldspar as the sole potassium source, then the strains were clustered into 29 populations by analysis of repetitive-element PCR (rep-PCR) genomic DNA fingerprinting. Flame spectrophotometer was used to determine the potassium-dissolving capacity, and 5 highly efficient potassium-dissolving bacteria was obtained, whose average soluble potassium content of culture medium reached to 41.47mg·L-1. K105 performed the highest potassiumdissolving ability, and the available potassium increased by 23.09%. The available potassium increased after being digested by H2O2solution, the maximum was up to 31.22%. After identifying the isolated 5 strains of efficient potassium-dissolving bacteria by bacterial morphology, physiology and biochemical characteristics, and phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences, 5 strains were classified into 4 bacterial genera. K1 belongs to Acinetobacter sp., K98, K105 and K115 belong to Pseudomonas sp., and K168 belongs to Bacillus sp.. It provided basis for exploration of new efficient potassium-solubilizing bacteria, contributing to improve apple replanted soil and develop microbial fertilizer special for apple trees.

Potassium-solubilizing bacteria; Rep-PCR DNA fingerprinting; Isolation; Identification

10.3969/j.issn.1000-6362.2017.11.006

姜霽航,彭霞薇,顏振鑫,等.蘋果樹根際高效解鉀菌的篩選及鑒定[J].中國農業氣象,2017,38(11):738-748

2017-03-07**

。E-mail：guohuiya@126.com; gengbing@caas.cn

北京林業大學青年科技啟動基金（BLX2014-25）；流域農業面源污染防控整裝技術與農業清潔流域示范（2015ZX07103-007）

姜霽航（1992-），碩士生，主要研究資源與環境微生物。E-mail：13121201177@163.com