貉源大腸桿菌耐藥性的檢測

馮 濤 薛 原

(東北林業大學野生動物資源學院，哈爾濱，150040)

貉源大腸桿菌耐藥性的檢測

馮 濤 薛 原*

(東北林業大學野生動物資源學院，哈爾濱，150040)

為了解大腸桿菌在黑龍江和吉林兩個省份中健康貉的耐藥情況，利用K-B紙片法對22種抗生素檢測其大腸桿菌的敏感性。結果表明，貉源大腸桿菌的分離菌株表現出不同程度的耐藥性。對頭孢噻吩的耐藥性最強(92.68%)，對氨芐西林、四環素的耐藥率在60%以上，對亞胺培南、阿米卡星、慶大霉素和多黏菌素B的敏感率均在90%以上。

貉；大腸桿菌；耐藥性

近幾年的時間內，養貉業在我國已成為不可忽視的產業，在毛皮養殖行業已取得重要的地位[1]。貉(Nyctereutesprocyonoides)的經濟價值較高，發展的領域較大，而養貉的主要產品為貉皮，具有很強的御寒能力[2]。隨著抗菌藥物的廣泛使用，在臨床上大腸桿菌(Escherichiacoli)的耐藥性也逐漸加強，與此同時也出現了多重耐藥[3]。對于各養殖場的情況不一，使用抗生素的頻率和種類也存在差異，不同養殖場的大腸桿菌的耐藥情況也發生了不同的變化，耐藥基因的傳播同樣影響著養貉業的發展。

因此，進行貉的耐藥性研究具有長遠的意義。本次的研究針對黑龍江和吉林兩個省的養殖場的大腸桿菌耐藥性進行調查和分析，旨在了解大腸桿菌的耐藥性的現狀與發展趨勢，為控制貉對于不同種類的抗生素的耐藥性提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

藥敏質控菌株大腸桿菌ATCC25922，購自中國獸醫藥品監察所。實驗所用大腸桿菌在2016年5～7月從黑龍江和吉林兩個省的貉的養殖場分離的大腸桿菌共56株，將經過分離和鑒定的菌株進行藥敏試驗。

1.1.2 培養基

水解酪蛋白瓊脂培養基(Mueller-Hinton，MH)，杭州天和微生物試劑有限公司生產，批號120302。

1.1.3 藥敏紙片

共22種，包括氨芐西林(AMP)、阿莫西林(AML)、頭孢噻吩(KF)、頭孢他啶(CAZ)、阿莫西林/克拉維酸鉀(AMC)、亞胺培南(IPM)、氨曲南(ATM)、慶大霉素(CN)、卡那霉素(K)、新霉素(NEO)、安普霉素(APR)、阿米卡星(AK)、諾氟沙星(NOR)、環丙沙星(CIP)、恩諾沙星(ENR)、氧氟沙星(OFX)、四環素(TE)、強力霉素(DO)、氯霉素(C)、氟苯尼考(FFC)、復方新諾明(SXT)、多粘菌素B(PB)。藥敏片均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌的分離與鑒定

將新鮮貉的糞便樣本接種于選擇性培養基進行分離。在麥康凱瓊脂培養基上，形成中等大小的粉紅色菌落，在伊紅美藍瓊脂培養基上，形成具有金屬光澤的紫黑色菌落，在營養瓊脂培養基上，形成中等大小的白色菌落。挑取多個菌落于LB液體培養基中培養，將菌液用30%的甘油混合并保存在-20℃中。根據生化特性鑒定分離的細菌為大腸桿菌。

1.2.2 藥敏試驗

采用WHO推薦的Kirby-Bauer法[4]。根據CLSI[4]的標準，只有當質控菌株的抑菌圈直徑在允許范圍內測試菌株結果才有效。

1.2.3 判定標準

按抗菌藥物敏感性試驗擴散法[4]標準判定各菌株的耐藥性，對所分離的細菌進行藥敏試驗。以敏感(Susceptible)、中介(Intermediate)、耐藥(Resistant)3種形式對抑菌圈大小給予判定。

2 結果

2.1 大腸桿菌的耐藥性

56株貉源大腸桿菌均可產生耐藥性(圖1)。對頭孢噻吩、氨芐西林和四環素耐藥率較高，達60%以上；對亞胺培南、阿米卡星、慶大霉素和多黏菌素B高度敏感，敏感率達90%以上 。

圖1 貉源大腸桿菌對22種抗生素的藥敏試驗結果Fig.1 The antimicrobials resistances of Escherichia coli isolated from Nyctereutes procyonoides

2.2 大腸桿菌的多重耐藥性

56株貉源大腸桿菌對22種抗菌藥物均存在耐藥性，表現對1種或1種以上藥物耐藥。3耐菌株所占比例最大為14.28%。分離菌株存在多重耐藥現象，最少為3種，最多為13種(圖2)。

圖2 貉源大腸桿菌的多重耐藥性Fig.2 Multiple antibiotic resistance of Escherichia coli isolated from Nyctereutes procyonoides

2.3 大腸桿菌的耐藥類型

貉源大腸桿菌中，耐藥類型多樣(表1)。

表1 貉源大腸桿菌的耐藥譜型

Tab.1 The resistance spectrum of the Nyctereutes procyonoides

續表1

3 討論

在本次研究過程中，貉大腸桿菌對本試驗所采用的22種抗生素有不同程度的耐藥性，其中最少的耐藥性僅有1種，最多的耐藥性為13種，比例較高的為3重耐藥，耐3種抗生素的占總數的14.28%，且3重及3重耐藥以上的菌株共有45株，所占比例可達80.36%。這些結果說明黑龍江和吉林地區貉的養殖場在治療疾病時，用藥情況較為復雜，多重耐藥情況較為明顯，但對單一抗生素的耐藥性并不普遍，大腸桿菌在該地區使用的抗生素種類較多，在藥物選擇壓力下逐漸發展為多重耐藥的菌株[5]。

大腸桿菌耐藥性的結果表明，黑龍江和吉林地區貉的大腸桿菌僅對頭孢噻吩的耐藥率達到80%以上，氨芐西林、四環素和氯霉素在50%以上，這些抗菌藥物在該地區的養貉業中多為臨床常用藥物[6]，從而造成了耐藥性的產生，張召興等[7]對秦皇島地區貉大腸桿菌進行了藥敏試驗，發現大腸桿菌對氟苯尼考、新霉素、慶大霉素、多黏菌素的敏感性較強，與本次實驗藥敏結果基本相似。而對亞胺培南、阿米卡星、慶大霉素和多黏菌素B高度敏感，均達90%以上，這些在臨床上不常使用的藥物敏感性強，尤其是阿米卡星和多黏菌素B的耐藥性均為0，可以逐漸在臨床上應用，以便緩解當下耐藥性較高的影響。以上研究都表明，我國大腸桿菌多重耐藥性比較嚴重，耐藥菌存在數目較多，菌株間還可能存在克隆垂直或水平傳播，這些對環境安全都會產生較大的影響。因此要定期及時地開展耐藥性的檢測工作，掌握耐藥菌株的發展趨勢，以便更加合理有效地控制抗生素的使用。

貉作為經濟價值比較高的毛皮動物，貉皮不僅具有國內市場，在國際市場上也得到了很高的重視[1]。因此，為了養貉業的更好發展，對貉的耐藥性進行及時的流行病學調查十分重要。養殖人員在飼養過程中，應該盡量減少使用抗菌藥物，這樣既達到抗菌效益，又可以減少貉對抗生素產生耐藥機制。對于貉之類的毛皮動物，一方面應使用治療效果具有針對性的抗菌藥物，并且定期更換抗菌藥物種類，或者采取聯合用藥，這樣可以很好地控制耐藥性出現和發展[8]；另一方面需要養殖場加強管理制度，建立適宜健康的飼養和衛生設備，進而減少耐藥基因在同一菌群和不同菌群之間的傳播，才能促進毛皮業的正常發展。

[1] 華樹芳，華盛.我國養貉業的發展歷程、現狀和展望[J].特種經濟動物，2010(4)：2-4.

[2] Lawler D F，Evans R H，Nieminen P，et al.Lessons from a non-domestic canid：joint disease in captive raccoon dogs(Nyctereutesprocyonoides).[J].Veterinaria Italiana，2012，48(4)：367-378.

[3] Schwarzer A，Kaesberg A K，Bergmann S，et al.Activity rhythms and use of nest boxes of juvenile mink in seminatural group housing[J].Journal of Veterinary Behavior：Clinical Applications and Research，2017，18：13-22.

[4] Clinical and laboratory standards institute(CLSI).Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[C]25th Informational Supplement.Document M100-S25，Wayne，PA：CLSI，2015.

[5] Bonnet R.Growing group of extended-spectrum beta-lactamases：the CTX-M enzymes[J].Antimicrob Agents Chemother，2004，48(1)：1-14.

[6] Lalak A，Wasyl D，Zajac M，et al.Mechanisms of cephalosporin resistance in indicatorEscherichiacoliisolated from food animals[J].Veterinary Microbiology，2016，194：69-73.

[7] 張召興，李蘊玉，張艷英，等.秦皇島地區貉源E.coli的分離鑒定與耐藥性分析[J].黑龍江畜牧獸醫，2016(6下)：175-177.

[8] Bessalah S，Fairbrother J M，Salhi I，et al.Antimicrobial resistance and molecular characterization of virulence genes，phylogenetic groups ofEscherichiacoliisolated from diarrheic and healthy camel-calves in Tunisia[J].Comparative Immunology，Microbiology and Infectious Diseases，2016，49：1-7.

Analysis of Antimicrobial Resistance inEscherichiacolifrom Raccoon Dog(Nyctereutesprocyonoides)

Feng Tao Xue Yuan*

(College of Wildlife Resources,Northeast Forestry University,Harbin,150040,China)

We tested the susceptibility ofEscherichiacolito 22 antimicrobial agents using the agar diffusion test to investigate the diversity of antimicrobial resistance ofE.colifrom Raccoon dog(Nyctereutesprocyonoides)in Heilongjiang and Jilin provinces in northeast China.The strains ofE.coliisolated from raccoon dog sustained varying degrees of resistance.Resistance to cephalothin was the highest(93%)，that to ampicillin and tetracycline was over 60%.Susceptibilities to imipenem，amikacin，gentamycin and polymyxinB were all above 90%.

Nyctereutesprocyonoides；Escherichiacoli；Antimicrobial resistance

稿件運行過程

2017-03-13

修回日期：2017-04-25

發表日期：2017-08-10

S858.9

A

2310-1490(2017)03-498-03

國家自然科學基金(31502119)；黑龍江省博士后科研啟動金(LBH-Q14002)

馮濤，女，21歲，本科生；主要從事細菌耐藥性方面的研究。

*通訊作者：薛原，E-mail：xueyuan-1978@163.com