草地早熟禾種間原生質體電融合條件的研究

牛奎舉，張 然，趙春旭，馬暉玲(甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

草地早熟禾種間原生質體電融合條件的研究

牛奎舉，張 然，趙春旭，馬暉玲
(甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

為改良培育草地早熟禾(Poapratensis)新品種，擬建立草地早熟禾商用品種與具有優良性狀的野生早地早熟禾種間原生質體融合體系。采用電融合法，研究了電融合儀的電場條件和原生質體密度對草地早熟禾種間原生質體融合的影響。結果表明：在交流電場強度和頻率分別為20 V/cm和2000 kHz時，原生質體可在較短的時間內形成2～4個原生質體串；最適于草地早熟禾種間原生質體融合的直流脈沖強度為200 V/cm、DC幅寬為40 μs、直流脈沖次數為3次，原生質體密度為3×105個/mL，在此條件下，草地早熟禾種間原生質體總融合率和一對一融合率可分別達到25.39%和12.27%。

草地早熟禾；原生質體；電融合；種間體細胞雜交

早熟禾屬(Poa)隸屬于禾本科早熟禾亞科早熟禾族，是禾本科最大的屬，廣泛分布于寒帶和北溫帶冷涼濕潤地區[1-2]。目前全世界的早熟禾屬植物有500多種，我國包括變種在內共有105種[3-4]。該屬的草地早熟禾(Poapratensis)不僅是優良的牧草，同時由于具有質地纖細、再生能力和耐修剪性強、綠期長、坪質優美以及較強的抗寒能力等優良特性，被廣泛應用于草坪建植，是寶貴的草坪植物種質資源。在草地早熟禾育種的研究中，人們以往采用常規育種方法和手段，如父母本雜交法[5-6]、篩選自然突變體和理化誘導突變體[7-9]等手段來選育草地早熟禾優良新品種。大量的研究表明，早熟禾屬植物生殖方式復雜多樣，草地早熟禾常以兼性無融合生殖方式進行繁殖，有些品種的無融合生殖率高達98%以上[10-11]，而有性雜交率很低，很難獲得雜種優勢品種，利用傳統育種方式改良品種特性存在著一定困難和局限性，自然雜交困難是制約早熟禾植物種質創新的瓶頸。

植物原生質體是脫去了細胞壁的裸露細胞，由于無細胞壁，在化學、物理或自發性作用下，原生質體之間可以進行細胞的融合而獲得體細胞雜種[12]。植物原生質體融合技術給植物不同種、屬乃至科的遺傳物質的交流提供了可行的途徑和方法，克服了雜交不親和而導致的生殖屏障[13]，通過此途徑可以轉移多基因控制的數量性狀和細胞質基因控制的性狀等[14]。1993年，Kisten等[15]成功建立了草地早熟禾‘Geronimo’的細胞懸浮系原生質體培養體系；國內馬暉玲和趙小強等[16-17]以草地早熟禾Midnight Ⅱ和Nuglade的胚性愈傷組織為分離材料，獲得的原生質體經液體培養后成功地再生出植株。但到目前為止，未見有關早熟禾種間原生質體融合的報道。與PEG法相比，電融合法可避免PEG高鈣高pH強加于原生質體的生理條件，同時融合的條件更加數據化，便于控制和比較，且融合率相對較高[18]。

筆者所在課題組前期的初步研究表明，采集于甘肅安定區的野生草地早熟禾具有較強的抗旱性，可作為優良的育種材料[19-21]，且已建立起了安定野生草地早熟禾的分離和培養體系[22]。因此，筆者以草地早熟禾商用品種Midnight Ⅱ和采集于甘肅省安定區的野生草地早熟禾的原生質體為材料，采用電融合法探索了草地早熟禾種間原生質體融合條件，以期確定適宜的電融合參數，為利用植物原生質體融合技術對草地早熟禾種質創新和品種改良奠定基礎。

1 材料和方法

1.1試驗材料

試驗采用草地早熟禾Midnight Ⅱ(W-2)和采集于甘肅省安定區的野生草地早熟禾(AD)的原生質體，原生質體的獲得分別參考馬暉玲等[17]和牛奎舉等[22]的研究；電融合儀選用CRY-3型細胞融合儀，融合電極小室為1.5 mm。

1.2融合參數的確定

原始融合參數的設定和基本操作參照CRY-3型細胞融合儀操作說明書和文獻[23]的方法進行。

1.2.1 成串(交流，AC)電場參數 將獲得的原生質體用電融合液純化一次后再次懸浮，調整兩親本原生質體的密度，使其最終密度為1×105個/mL，并按1∶1的比例混合備用。融合液含有0.55 mol/L甘露醇和0.4 mmol/L的CaCl2·2H2O的雙蒸水溶液，pH 5.8，過濾滅菌。

試驗采用單因素設計，前次試驗結果為后次試驗的基本條件，每處理重復3次，倒置顯微鏡下觀察原生質體接觸情況、統計成串時間、成串率和串珠長度。成串脈沖電壓和成串脈沖頻率參數分別設置為：(1)電壓：10、15、20、25、30、35 V/cm；(2)頻率：1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 kHz。

1.2.2 融合(直流，DC)脈沖參數 融合脈沖參數涉及融合脈沖電壓、脈沖幅寬和脈沖次數3個因素，試驗采用單因素設計，前次試驗結果為后次試驗的基本條件，每處理重復3次，倒置顯微鏡下觀察原生質體融合情況、統計總融合率、一對一融合率。融合脈沖電壓、脈沖幅寬和脈沖個數分別設置為：(1)直流脈沖電壓：50、100、150、200、250、300 V/cm；(2)直流脈沖幅寬：5、10、20、40、80、100 μs；直流脈沖次數：1、2、3、4次。

1.2.3 原生質體密度對融合頻率的影響 在最適的成串參數與融合參數的基礎上，對不同的原生質體密度(1×105、2×105、3×105、4×105、和5×105個/mL)對融合率的影響進行統計分析。

1.3數據處理

數據的處理和統計分析采用Microsoft Excel 2013。采用SPSS 19.0進行數據單因素方差分析(ANOVA)，使用 Duncan 法在0.05顯著性水平進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1交流電場強度對原生質體成串的影響

當融合親本原生質體處于交流電場的作用時，彼此之間會相互靠近并逐漸相連排列成串。隨著交流電場強度的增大，原生質體成串所需時間逐漸縮短，成串率逐漸增高，串珠長度也隨之增大。然而，原生質體融合所期望的是雙親細胞融合，串珠長度過長則會引起多細胞的融合，所以串珠長度以2～3個細胞為最佳。因此，交流電場強度應小于25 V/cm。試驗表明，交流電場強度以20 V/cm為最適，此條件下成串時間較短，串珠長度也較短，為2～4個，但成串率較高，為78.1%(表1)。

表1 交流電場強度處理下原生質體成串的指標

注：表中同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.2交流電場頻率處理下原生質體成串的指標

交流電場頻率對原生質體的成串時間、成串率和串珠長度有著顯著地影響(表2)。當交流頻率為1 000 kHz時，顯微鏡下可觀察到原生質體只是自身旋轉，并未能成串，交流頻率的逐漸增高，原生質體成串時間逐漸縮短，成串率也逐漸增高，但當交流頻率達到2 500 kHz時，可觀察到部分串珠長度超過5個。因此，適宜于草地早熟禾原生質體成串的交流電場頻率為2 000 kHz。

表2 交流電場頻率處理下原生質體成串的指標

2.3直流電場強度對原生質體融合的影響

在交流電場強度為20 V/cm，交流頻率為2 000 kHz，持續時間為3 min的情況下，研究了不同直流脈沖強度，直流脈沖幅寬和脈沖個數對原生質體融合頻率的影響(表3)。當直流脈沖電壓強度為50 V/cm時，原生質體的總融合頻率和一對一融合率均較低，分別為9.01% 和1.31%，隨著直流電壓的繼續增高，總融合率和一對一融合率逐漸開始增高，當直流電壓達到200 V/cm時，總融合率和一對一融合率達到最大值，分別為22.26% 和11.04%。當直流電壓超過250 V/cm時，原生質體開始變形和破碎，總融合率和一對一融合率均開始下降，尤其是一對一融合率開始急劇下降。因此，草地早熟禾原生質體融合的最適直流電壓為200 V/cm。

表3 直流電場強度處理下原生質體的融合

2.4直流脈沖幅寬對原生質體融合的影響

在直流脈沖強度為200 V/cm條件下，隨著脈沖幅寬的延長，細胞的總融合率和一對一融合率均呈現出先增高后降低的趨勢(表4)。在80 μs的脈沖幅寬下，總融合率達到最高，為22.81%，但是顯微鏡下可明顯觀察到有破碎的細胞出現，可能導致了其一對一融合率較40 μs顯著地降低。當脈沖幅寬為40 μs時，雖然總融合率相對較低，但是其一對一融合率顯著高于其他處理，因此，最適于草地早熟禾原生質體融合的脈沖幅寬為40 μs。

表4 直流脈沖幅寬處理下原生質體的融合

2.5直流脈沖次數對原生質體融合的影響

在直流脈沖強度為200 V/cm，幅寬為40 μs條件下，脈沖次數過少，則融合率較低；而脈沖次數超過4次時，導致細胞膜不能承受過強的脈沖刺激，從而降低融合率，尤其是一對一融合率開始顯著降低(表5)。當脈沖次數為3時，其總融合率和一對一融合率顯著高于其他處理，因此，最適于草地早熟禾原生質體融合的直流脈沖次數為3次。

表5 直流脈沖次數處理下原生質體的融合

2.6原生質體密度對融合效率的影響

原生質體密度對融合頻率同樣具有顯著的影響，隨著原生質體密度的逐漸增大，融合頻率呈現先升高后降低的趨勢(表6)。當原生質體的密度為3×105個/mL時，草地早熟禾原生質體融合率和一對一融合率均達到最大值，分別為25.39% 和12.27%。

表6 原生質體密度處理下的融合效率

2.7草地早熟禾原生質體電融合過程

將W-2和AD的原生質體密度均調至3×105個/mL，1∶1混合。取0.4 mL加入1.5 mm平行電極，靜置3～5 min，待原生質體沉淀后連接電極與融合儀輸出接頭，施加適當的交流電壓(電壓強度為20 V/cm，交流頻率為2 000 kHz)，2～3 min可觀察到約80%的原生質體會形成2～4個原生質體串(圖1-A)，成串后，給予適當的直流脈沖(脈沖強度為200 V/cm，幅寬為40 μs，脈沖次數為3次)，部分相互接觸的原生質體則會發生融合(圖1-B～1-D)。其總融合率和一對一融合率分別可達到25.39% 和12.27%。

圖1 原生質體電融合的過程Fig.1 The process of protoplast electrofusion

3 討論

3.1電融合法在草地早熟禾體細胞雜交中的應用

1979年，Sencia等[24]建立了電融合法。與PEG融合法相比，電融合法避免了高Ca2+高pH強加于原生質體的生理條件對融合原生質體的傷害，同時，其便于融合過程中精準化的控制和比較，且可提高原生質體的融合率[25]。目前，國內外均已建立了草地早熟禾的原生質體培養體系[15-17]，然而，有關草地早熟禾原生質體融合的研究報道卻很少。因此，筆者首次對電融合法在草地早熟禾原生質體融合中的應用條件進行了一定的探索。

前人的研究表明，電融合法在高羊茅(Festucaarundinacea)與多花黑麥草(Loliummultiflorum)[26]、多花黑麥草與小麥(Triticumaestivum)[27]等禾本科植物中均取得了較好的結果。研究表明，在AC電壓為20 V/cm、AC頻率為2 000 kHz、DC脈沖強度為200 V/cm、DC幅寬為40 μs、DC脈沖次數為3次和原生質體密度為3×105個/mL的條件下，草地早熟禾種間原生質體融合率可達到25.39%，而趙小強等[28]采用PEG法在草地早熟禾種內原生質體融合的研究中所得到的融合率僅為9.8%，試驗采用電融合法所得到的融合率是其采用PEG法的2.6倍。

3.2草地早熟禾原生質體電融合參數

電融合過程可分解為兩步，首先是交流電場使得原生質體2～3個串在一起，最后是給予直流脈沖使得串在一起的原生質體發生融合，因此，影響電融合的參數就是交流電場和直流脈沖相關參數。

交流電場能促進原生質體的偶極化，進而使相鄰的原生質體排列成串。交流電壓過低時，原生質體無法成串或成串需要耗費比較長的時間，不利于后期直流脈沖誘發原生質體融合，而交流電場強度過高時，會使原生質體短時間內形成很長的串珠，則導致后期原生質體融合時形成多細胞融合體[29]。研究表明，在交流電場強度為20 V/cm和交流電場頻率為2 000 kHz，草地早熟禾原生質體可在較短時間內形成2～3個原生質體的串珠，該結果與張凌云等[23]在苜蓿(Medicagosativa)原生質體電融合研究中所得到的結果相似。然而，魏彩霞等[29]研究表明，馬鈴薯(Solanumtuberosum)原生質體電融合的最佳交流電場強度為110 V/cm，這種差異可能是電融合儀的型號不同導致，不同的植物種之間原生質體電融合的條件也會存在一定的差異[23,30]。

直流脈沖通過脈沖電壓，脈沖幅寬和脈沖次數3個參數影響著原生質體融合頻率[23,30]。脈沖電壓強度的大小預示著細胞膜能否被擊穿及是否或導致細胞膜的不可逆性損傷，在原生質體融合時，找到適宜的直流脈沖電場強度、脈沖幅寬和脈沖次數的相應閾值，可避免直流脈沖強度過高引發的原生質體細胞膜的破碎，使得細胞質膜產生可逆性的擊穿恢復，從而提高原生質體的融合頻率[29]。研究表明，直流脈沖強度為200 V/cm、直流幅寬為40 μs和直流脈沖次數為3次時，草地早熟禾原生質體的融合率最高，且原生質體狀態完好，而當直流脈沖強度為250 V/cm、直流幅寬為80 μs和直流脈沖次數為4次時，原生質體出現變形，破碎嚴重的情況，其融合率也隨著降低。

4 結論

草地早熟禾種間原生質體電融合的最佳參數為： AC電壓為20 V/cm、AC頻率2 000 kHz、DC脈沖強度200 V/cm、DC幅寬40 μs、DC脈沖3次和原生質體密度為3×105個/mL。

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StudyontheconditionsforelectrofusionofinterspecificprotoplastsinPoapratensis

NIU Kui-ju,ZHANG Ran,ZHAO Chun-xu,MA Hui-ling

(CollegeoPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity,KeylaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

The conditions for electrofusion of interspecific protoplasts in genus ofPoapratensiswere studied.The results showed that the optimum AC (alternating current) electric field intensity and frequency were 20 V/cm and 2 000 kHz,and the bunch could be obtained in a relatively short time.The optimum DC (direct current) electric field intensity was 200 V/cm with 40 μs pulse width and 3 pulse frequency.The optimal protoplast density was 3×105number/mL.Under these conditions,the highest total fusion frequency and binary fusion frequency reached 25.39% and 12.27%,respectively.

Poapratensis;protoplast;electrofusion;interspecific somatic hybridization

S 543；Q 813.2

A

1009-5500(2017)05-0030-06

2017-02-28；

2017-03-22

國家自然科學基金“草地早熟禾種間體細胞雜交的研究”項目(31160482)資助

牛奎舉(1991-)，男，甘肅通渭人，在讀博士。

E-mail：niukuiju@163.com

馬暉玲為通訊作者。