中性粒細胞在大腸桿菌感染大鼠乳腺損傷中的作用機制

顧蓓蓓 盧勁曄 馬 卉 盧 煒 周偉偉

（1.泰州出入境檢驗檢疫局，江蘇泰州 225300；2.江蘇農牧科技職業學院，江蘇泰州 225300）

中性粒細胞在大腸桿菌感染大鼠乳腺損傷中的作用機制

顧蓓蓓1盧勁曄2*馬 卉1盧 煒2周偉偉1

（1.泰州出入境檢驗檢疫局，江蘇泰州 225300；2.江蘇農牧科技職業學院，江蘇泰州 225300）

36只清潔級SD懷孕大鼠于產后72h經乳頭管灌注2×1012CFU/ml大腸桿菌懸液100μL/側到第四對乳腺（兩側）內。分別于灌注前（定義為0h）及灌注后12、24、48和72h（n=6）頸靜脈放血處死動物，采集樣品。結果顯示大腸桿菌誘發乳腺炎引起細胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和中性粒細胞趨化因子（cytokineinduced neutrophil chemoattractant-1，CINC-1）表達顯著升高，從而促進嗜中性粒細胞（neutrophil，PMN）遷徙及活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的釋放，同時伴隨著乳腺組織丙二醛（MDA）含量的顯著升高。結果表明活化的PMN向乳腺組織遷徙是大腸桿菌乳腺炎的主要特征，PMN遷徙至感染部位通過釋放ROS消滅病原菌，同時也是引起組織損傷的重要原因。

中性粒細胞；大腸桿菌；乳腺炎；大鼠

乳腺炎在各種乳用家畜甚至是人類普遍存在，奶牛乳腺炎更是頻繁發生。據報道，全世界約有1/3的奶牛罹患有各種類型的乳腺炎，是危害奶牛產業的一種重要疾病之一。乳腺炎誘發因素眾多，其中以病原菌感染最為重要，根據病原來源和傳播方式可分為傳染性病原和環境性病原兩大類。大腸桿菌是環境性病原的代表，感染大腸桿菌后常引起急性乳腺炎，并伴隨局部和全身癥狀[1]。近年來大腸桿菌乳腺炎發病率有升高的趨勢，特別是在一些飼養管理水平較高的發達國家，接觸性乳腺炎有所控制，而大腸桿菌乳腺炎在臨床型乳腺炎中的發病率有所增加。大腸桿菌多在干乳期感染乳腺（干乳后兩周到產前兩周是最易感期），而在分娩后兩周內表現出臨床癥狀，圍產期乳腺感染的易感性（IMI）明顯升高，可能與圍產期先天免疫防御系統受到抑制密切相關[2]。治療和預防圍產期的大腸桿菌乳腺炎已成為目前奶牛業面臨的主要挑戰之一。

機體的天然免疫系統有非特異性和特異性兩套防御機制，非特異性防御機制的發揮依賴和病原微生物持續性作用，并且其殺傷效果取決于微生物的種類[2]。在乳腺防御體系中，組成型的防御機制主要有物理屏障（乳腺上皮屏障）、乳腺內的防御細胞（包括各種粒細胞、單核/巨噬細胞、自然殺傷細胞）和體液中的抗菌酶、溶菌酶等。現有的研究證實活化的中性粒細胞（PMN）作為非特異性細胞免疫系統的成分之一，在乳腺炎的發生、發展和轉歸進程中發揮了重要的作用。致病菌入侵乳腺后在趨化因子的作用下血液中大量的PMN激活并向乳腺組織遷移，通過釋放大量活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）殺滅病原微生物，ROS是分子氧在還原過程中的一系列代謝中間產物，主要包括O2-、H2O2、HOCl、·OH等[3]。在對一些胞內感染菌的研究中發現，ROS的產生對清除胞內微生物是必需的，但持續過度激活，產生過量氧化劑超過局部抗氧化劑的防御反應時，能降解蛋白多糖，減少細胞外基質與乳腺上皮的粘附性，引起乳腺上皮細胞死亡、脫落和泌乳功能的損傷[4]。因此深入了解PMN在宿主抗乳腺感染過程中的作用具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 細菌

乳腺炎致病菌大腸桿菌（Escherichial coli）由南京農業大學動物醫學院泌乳生化教研室提供。大腸桿菌經肉湯培養基復壯后在普通營養瓊脂平板分離成單個菌落，實驗前挑取單個菌落于肉湯培養基中37℃培養24h，無菌取100μL均勻涂抹在瓊脂糖平板上，37℃培養24h后刮取菌苔，溶解于滅菌磷酸鹽緩沖液（PBS）中，3000rpm離心10min，連續3次，用平板稀釋計數法調整濃度至2×1012CFU/ml。

1.2 實驗動物

36只清潔級懷孕SD大鼠，購自上海實驗動物中心。產后72h誘發試驗性乳腺炎，經乳頭管注入2×1012CFU/ml大腸桿菌懸液100μL/側到大鼠第四對乳腺（兩側）內。分別于灌注前（定義為0h）及灌注后12、24、48、72h（n=6）頸靜脈放血處死動物，收集血清、肝素抗凝血及乳腺組織用于后續分析。

1.3 主要試劑及儀器

TRIzol購自Invitrogen公司；RNA酶抑制劑、隨機引物、M-MLV、dNTPs購自Promega公司、SYBR? Green PCR Master Mix購自Toyobo公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒購于南京建成生物工程研究所；乙酸肉豆蔻佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）、雙氫羅丹明（dihydrorhodamin，DHR 123）購自Sigma公司。

UV755B型分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），光學顯微鏡（日本奧林巴斯BH2），組織勻漿器（瑞士Kinematica AG），核酸濃度測定儀（德國Eppendorf Biophotometer），熒光定量PCR儀（ABI Prism 7300），流式細胞儀（美國BD Biosciences）。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 熒光定量PCR檢測乳腺組織細胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、中性粒細胞趨化因子（cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1，CINC-1）mRNA表達TRIzol試劑盒提取總RNA，用隨機引物同時對所有樣品進行反轉錄，建立各樣品的cDNA。用所有待測RT產物的混合樣對反應條件進行優化。反應條件為95℃ 1min預變性；95℃20s，62℃30s，72℃20s，重復45個循環。基因引物參考已發表的文獻。數據分析采用2-△△Ct法。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.4.2 乳腺組織與血清中MPO、MDA的測定

乳腺組織：準確稱取1g乳腺組織加入生理鹽水6ml，冰浴勻漿后于3000rpm 4℃離心30 min，吸取上清液，分裝，-20℃冰箱保存備用。使用前用Bradford法測定蛋白濃度。

血清：大鼠采集血液后4℃過夜，待完全凝固后，3000rpm離心10min，吸取上清液，分裝，-20℃冰箱保存備用。

MDA活性按試劑盒說明書操作。

1.4.3 流式細胞術測定外周血PMN活性氧釋放

100μL全血加入終濃度為100ng/ml PMA刺激PMN，同時設無PMA刺激對照（等量PBS代替PMA）；37℃ 15min后加入DHR123工作液，終濃度為5μmol/L，37℃孵育10min；裂解紅細胞，0.01mol/L、pH7.2 PBS洗滌兩次并重懸于PBS中，混勻后流式細胞儀檢測，依次檢測無刺激對照和PMA刺激樣品，每個樣品獲取10000個細胞，重復三次，結果以平均熒光強度給出。

1.5 數據處理

用SPSS17.0方差分析程序對試驗數據進行統計分析，統計結果以平均數±標準誤（Mean±SE）表示。

2 結果與分析

2.1 乳腺組織ICAM-1和CINC-1 mRNA表達的變化

圖2-1 乳腺組織ICAM-1和CINC-1 mRNA表達的變化

試驗結果顯示，乳腺組織中ICAM-1和CINC-1 mRNA相對表達在乳腺灌注大腸桿菌后各個時間點均顯著升高（P ＜0.05）。ICAM-1 mRNA表達第72h盡管仍顯著高于0h，但與48h相比明顯下降。CINC-1 mRNA表達趨勢相同，灌注后第48h已開始急劇下降。

2.2 外周血中性粒細胞活性氧釋放的動態變化

圖2-2 外周血中性粒細胞活性氧釋放的動態變化

大腸桿菌灌注乳腺后12、24、48h外周血PMN活性氧釋放均顯著升高（P ＜0.05），峰值出現在第24h，第72h已恢復至正常水平。

2.3 乳腺組織和血清中MDA水平

圖2-3 大鼠血清和乳腺組織中MPO活性的變化

誘導乳腺炎后12、24和48h，乳腺組織中MDA水平顯著升高，峰值出現在第24h，到72h基本恢復至正常水平。血清中MDA水平在第24h顯著升高，其他時間點與0h相比差異不顯著。

3 討論

作為機體最大的外分泌腺，乳腺在進化、發育和泌乳再構建的過程中時刻面臨著病原微生物的侵襲。乳腺感染在各種乳用家畜甚至是人類（尤其是發展中國家）普遍存在，奶牛乳腺炎更是頻繁發生，是制約奶牛產業發展的主要疾病之一，每年因乳腺炎造成的經濟損失高達350億美元。

大量循環血液中的PMN在病原微生物或其他活性分子的作用下向乳腺組織遷徙，是乳腺炎發生時的重要特征。已有研究表明，細菌入侵后通過激活NF-κB/AP-1刺激單核、巨噬細胞產生多種趨化因子促進吞噬細胞如PMN的趨化[5]。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族的成員，廣泛表達于各種細胞表面，在細胞間的相互作用以及白細胞粘附聚集中起著重要作用[6]。CINC-1則是炎癥發生時一種重要的趨化因子，能促進吞噬細胞遷徙，對PMN有激活作用，可以誘導其變形、趨化、脫顆粒、合成生物活性脂類、整合素上調以及呼吸爆發等[7]。試驗結果表明大腸桿菌誘導試驗性乳腺炎后乳腺組織中的ICAM-1和CINC-1表達顯著升高，表明細菌入侵后通過表達促炎因子和趨化因子，誘導PMN趨化進入病灶發揮吞噬活性。

PMN是機體抵抗感染的主要非特異性防御細胞，PMN進入病灶通過釋放ROS清除病原微生物，在對一些胞內感染菌的研究中發現，ROS的產生對清除胞內微生物是必需的[8]，本研究結果顯示，大腸桿菌灌注乳腺后ROS顯著升高，表明ROS是宿主抵御乳腺感染的主要效應分子。但是過度釋放的高毒性ROS在殺滅病原微生物的同時會損傷組織細胞。本研究結果顯示ROS釋放的峰值伴隨著MDA的顯著增加，MDA作為脂質過氧化代謝的產物，其水平高低間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。大腸桿菌灌注后第12、24、48h乳腺組織中MDA含量急劇升高，第24h達到峰值，第72h恢復至正常水平。

4 小結

病原微生物或其他活性分子刺激乳腺組織后，在趨化因子的作用下，循環血液中的PMN向乳腺組織遷徙，釋放活性氧消滅病原微生物，但亦是引起乳腺組織的損傷的主要原因。因此如何迅速的啟動機體的免疫反應，促進PMN等效應細胞第一時間遷徙至病灶組織發揮吞噬效應，并迅速從乳腺腺泡清除是乳腺炎防控的根本所在。本研究深入探討了宿主識別和清除乳房致病因子感染的天然免疫機制，為臨床上乳腺炎的免疫調控及防治具有重要的現實意義。

[1]Shlomo E.B.，Elimelech D.H.，Gabriel L.Long term effects of Escherichia coli mastitis[J].Vet J，2014，（201）：72-77.

[2]Steven M.G.H.，Spiegeleer B.D.，Peelman L，Boulougouris X.J.A.，et al.Compromised neutrophil function and bovine E. coli mastitis：is C5a the missing link?[J].Vet Immunol Immunop，2012，（149）：151-156.

[3]Gu BB，Zhu YM，Zhu W，et al.Retinoid protects rats against neutrophil-induced oxidative stress in acute experimental mastitis[J].Int Immunopharmacol，2009，（9）：223-229.

[4]Zhao X，Lacasse P.Mammary tissue damage during bovine mastitis：cause and control[J].J Anim Sci，2008，（86）：57-65.

[5]Fonseca I，Silva P V，Lange C C，et al.Expression profile of genes associated with mastitis in dairy cattle[J].Genet Mol Biol，2009，32（4）：776-781.

[6]Li R J，Meng Z Q，Xie J F.Effects of sulfyr dioxide on the expressions of MUC5AC and ICAM-1 in airway of asthmatic rats[J].Regul Toxicol Pharm，2007，（48）：284-291.

[7]Stillie R，Farooq S M，Gordon J R，et al.The functional significance behind expressing two IL-8 receptor types on PMN[J].J Leukocyte Biol，2009，（86）：529-543.

[8]Lauzon K，Zhao X，Bouetard A，et al.Antioxidants to prevent bovine neutrophil-induced mammary epithelial cell damage[J].J Dairy Sci，2005，（88）：4295-4303.

江蘇省自然科學基金面上研究項目（編號：BK20151354）；江蘇農牧科技職業學院科研課題（編號：NSF201609）；江蘇省現代畜牧與新獸藥工程技術中心開放課題（編號：TGC2XKF1402）；江蘇高校品牌專業建設工程項目（PPZY2015C230）。

顧蓓蓓（1983—），江蘇興化人，博士，研究方向：乳腺炎的營養免疫調節機制研究。

盧勁曄（1983—），江蘇邗江人，博士。