黑青稞花色苷提取及抗氧化活性的分析

杜道坤+賀娟+孟利東+康志鈺

摘要：為探討黑青稞色素資源的開發(fā)與利用，以完整黑青稞種子為材料，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面分析法，以提取溫度、液料比、乙醇濃度、pH值為因素，花色苷提取量為響應(yīng)值優(yōu)化黑青稞花色苷提取工藝，進(jìn)而測定其還原能力，以及清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的能力。結(jié)果表明，黑青稞花色苷最佳提取工藝參數(shù)為提取溫度60 ℃，液料比10.04 mL ∶ g，乙醇濃度55.76%，pH值1，在該條件下提取1 h花色苷的實(shí)際提取量為 9.68 mg/100 g，而在此基礎(chǔ)上使用超聲波提取40 min，提取量達(dá)到14.04 mg/100 g，提高了提取效率。同時(shí)所提黑青稞花色苷的抗氧化活性較強(qiáng)，且抗氧化能力與花色苷濃度間存在劑量效應(yīng)關(guān)系；與維生素C（vitamin C，簡稱VC）相比，黑青稞花色苷清除DPPH自由基和羥自由基能力較強(qiáng)，但還原能力和清除超氧陰離子能力沒有VC強(qiáng)。黑青稞花色苷對自由基的清除能力大小依次為DPPH自由基>羥自由基>超氧陰離子自由基，半抑制濃度（50% inhibitory concentration，簡稱IC50）依次為0.186、0.268、0.293 mg/mL，說明黑青稞花色苷是一種較好的天然抗氧化劑。

關(guān)鍵詞：黑青稞；花色苷；響應(yīng)面法；提取工藝；抗氧化活性

中圖分類號： S512.301 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）18-0173-06

收稿日期：2016-04-20

基金項(xiàng)目：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新基金。

作者簡介：杜道坤（1989—），男，河南信陽人，碩士研究生，主要從事作物遺傳和品種改良研究。E-mail：490041070@qq.com。

通信作者：康志鈺，博士，副教授，主要從事作物遺傳育種及種子科學(xué)與工程方面的研究。E-mail：zhiyukang@163.com。 青稞（Hordeum vulgare Linn. var. nudum Hook.f.）在植物分類學(xué)上為禾本科大麥屬普通大麥種多棱裸粒大麥變種[1]。我國擁有豐富的青稞資源，品種繁多、種類各異，其中黑青稞是一種獨(dú)特的種質(zhì)資源，具有很大的開發(fā)價(jià)值。黑青稞種皮中含有豐富的花色苷而區(qū)別于普通白青稞，單月琴就從囊謙黑青稞的酸性乙醇提取液中鑒定出可能的7種花色苷[2]。花色苷是一種的水溶性的天然色素，它主要存在于植物的花、果實(shí)、種子中，從而使它們呈現(xiàn)出黑、紫、藍(lán)等多種顏色。現(xiàn)代研究證明，人工合成的色素對人類的健康存在潛在的致畸性、致癌性[3]，而天然色素花色苷不僅無毒無害，還具有清除自由基、防癌抗腫瘤、清脂減肥等與人類健康息息相關(guān)的功能[4-6]，所以黑青稞具有生產(chǎn)天然色素的開發(fā)和利用前景，而提取其中的花色苷是利用黑青稞的第1步，研究其提取工藝具有重要意義。

不同的提取條件對黑青稞花色苷的提取效果存在不同的影響。響應(yīng)面分析法（response surface methodology，簡稱RSM）就是使用多元二次回歸方程來擬合多個(gè)提取條件（因素）與試驗(yàn)指標(biāo)（響應(yīng)值）之間的函數(shù)關(guān)系，并通過分析回歸方程來優(yōu)化工藝參數(shù)，它保留了正交試驗(yàn)工作量少的優(yōu)點(diǎn)，還克服了不能在整個(gè)區(qū)域上得出最佳因素組合和最優(yōu)值的缺點(diǎn)[7-8]。陳建國等使用這種方法以黑青稞種子粉為材料優(yōu)化了其花色苷的提取工藝[9]。但是青稞種子中淀粉成分獨(dú)特，普遍含有74%～78%的支鏈淀粉，有的甚至更高[10]，使用種子粉提取在加熱的過程中使提取液變得黏稠、糊化而影響測定結(jié)果，且黑青稞花色苷多數(shù)集中在種皮，所以本研究以去雜的、完整的黑青稞種子為材料，使用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，并初步探索超聲波輔助提取黑青稞花色苷，同時(shí)測定所得花色苷提取液的抗氧化活性，旨為黑青稞天然色素的進(jìn)一步研究和開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以云南省當(dāng)?shù)胤N皮顏色為黑色的青稞為材料。

主要試劑有甲醇、乙醇、鹽酸、三氯乙酸、檸檬酸、冰乙酸、甲酸、乙酸乙酯、30%雙氧水、硫酸亞鐵、水楊酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，簡稱DPPH）、鐵氰化鉀、氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、Tris-base、鄰苯三酚，均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

主要儀器有Agilent Cary60紫外-可見光分光光度計(jì)（美國安捷倫公司）、Alpha 1-2型冷凍干燥機(jī)（德國Martin Christ公司）、RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、予華SHZ-D型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、KQ32001超聲波震蕩器（東莞市柯橋超聲波設(shè)備有限公司）、YXT-2型高速電動離心機(jī)、恒溫水浴鍋、電子天平等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑青稞花色苷吸收波長的選擇 參照孫榮琴等的方法[11]，使用1%鹽酸甲醇進(jìn)行提取，將提取液離心定容后再用紫外-可見光分光光度計(jì)（Agilent Cary 60）進(jìn)行250～700 nm的掃描，確定可見光區(qū)內(nèi)最大吸收波長（λmax）。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以黑色種皮的青稞種子為材料，分別考察種子粉碎與未粉碎、提取劑、乙醇濃度、提取劑pH值、酸化劑、提取溫度、提取時(shí)間、液料比8個(gè)單因素對黑青稞籽粒花色苷提取量的影響。

1.3.2.1 種子粉碎與未粉碎的選擇 分別稱取1 g去雜的完整黑青稞種子和過60目篩網(wǎng)的黑青稞種子粉，按照 10 mL ∶ 1 g 的液料比，以鹽酸為酸化劑，配制pH值=3的60%乙醇，在溫度為50 ℃的水浴條件下提取1 h。

1.3.2.2 提取劑的確定 分別稱取1 g去雜的完整黑青稞種子，按照10 mL ∶ 1 g的液料比，以鹽酸為酸化劑，分別配制pH值=3的蒸餾水、60%甲醇、純甲醇、60%乙醇、純乙醇，在溫度為50 ℃的水浴條件下提取1 h。endprint

1.3.2.3 乙醇濃度的選擇 分別稱取1 g去雜的完整黑青稞種子，按照10 mL ∶ 1 g的液料比，以鹽酸為酸化劑，分別配制pH值=3的30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇，在溫度為50 ℃的水浴條件下提取1 h。

1.3.2.4 pH值的確定 分別稱取1 g去雜的完整黑青稞種子，按照10 mL ∶ 1 g的液料比，以鹽酸為酸化劑，分別配制pH值為1、2、3、4、5的60%乙醇，在溫度為50 ℃的水浴條件下提取1 h。

1.3.2.5 酸化劑的選擇 分別稱取1 g去雜的完整黑青稞種子，按照10 mL ∶ 1 g的液料比，分別以鹽酸、三氯乙酸、冰乙酸、甲酸、檸檬酸為pH值調(diào)節(jié)劑，配制pH值=3的60%乙醇在溫度為50 ℃的水浴條件下提取1 h。

1.3.2.6 提取溫度的確定 分別稱取1 g去雜的完整黑青稞種子，按照10 mL ∶ 1 g的液料比，以鹽酸為酸化劑，配制pH值=3的60%乙醇，分別在溫度為30、40、50、60、70、80 ℃的水浴條件下提取1 h。

1.3.2.7 提取時(shí)間的確定 分別稱取1 g去雜的完整黑青稞種子，按照10 mL ∶ 1 g的液料比，以鹽酸為酸化劑，配制pH值=3的60%乙醇，在溫度為50 ℃的水浴條件下分別提取0.5、1、2、3、4、5 h。

1.3.2.8 液料比的確定 分別稱取1 g去雜的完整黑青稞種子，分別按照5 mL ∶ 1 g、10 mL ∶ 1 g、20 mL ∶ 1 g、30 mL ∶ 1 g、40 mL ∶ 1 g、50 mL ∶ 1 g的液料比，以鹽酸為酸化劑，配制pH值=3的60%乙醇，在溫度為50 ℃的水浴條件下分別提取1 h。

1.3.3 花色苷提取量的測定 將按照以上單因素試驗(yàn)所確定的提取條件得到的提取液離心后，以提取劑為空白對照，在λmax處測定吸光度，參考趙桃等的方法[12]計(jì)算得出提取量，均平行測定3次，相關(guān)公式：

提取量（mg/100 g）=D×V×N×10098.2×m。

式中：D為在λmax處的吸光度；V為稀釋體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；98.2為花色素的平均消光系數(shù)；m為樣品干質(zhì)量，g。

1.3.4 黑青稞花色苷的響應(yīng)面試驗(yàn)及模型驗(yàn)證 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對黑青稞花色苷提取量影響較大的4個(gè)因素提取溫度（A）、液料比（B）、乙醇濃度（C）、pH值（D）作為影響因子，以提取量作為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理使用4因素3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1）。利用 Design-Expert 8.06軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。用響應(yīng)面法分析得出的黑青稞花色苷最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證，算出實(shí)際提取

量與模型的預(yù)測值進(jìn)行比較。

1.3.5 超聲波輔助提取試驗(yàn) 根據(jù)所得最佳提取條件，為進(jìn)一步縮短提取時(shí)間，進(jìn)行超聲波輔助提取試驗(yàn)，超聲波分別提取20、40、60、80 min后測定提取量，平行測定3次。

1.3.6 抗氧化性的測定 根據(jù)“1.3.4”節(jié)優(yōu)化的提取條件提取黑青稞中的花色苷，濾液經(jīng)乙酸乙酯萃取3次進(jìn)行純化，40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至溶液黏稠，最后置于冷凍干燥機(jī)中獲得紫色凍干粉，然后用60%乙醇溶液配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的黑青稞花色苷溶液進(jìn)行抗氧化性的研究，使用相同濃度的維生素C（vitamin C，簡稱VC）溶液作為陽性對照。

1.3.6.1 還原能力的測定參考莫開菊等的方法[13]。采用普魯士法，分別準(zhǔn)確移取1.0 mL不同濃度樣品于干燥試管中，再依次加入3.0 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值=6.6）、2.5 mL 1%六氰合鐵酸鉀溶液，于50 ℃水浴保溫 20 min 后，迅速冷卻，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸，離心，取3.0 mL上清液，再依次加入3.0 mL蒸餾水，0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻后，室溫靜置10 min，再在波長700 nm處測定其吸光度。

1.3.6.2 DPPH清除能力參考朱璐等的方法[14]。精確稱取2.5 mg DPPH粉末，用無水乙醇定容至100 mL，避光保存?zhèn)溆谩７謩e取1.0 mL不同濃度的樣品溶液于試管中，再加入2.0 mL DPPH溶液，搖勻后室溫避光保存30 min，以無水乙醇作為空白對照，在517 nm處測吸光度。計(jì)算清除率，并計(jì)算當(dāng)清除率達(dá)到50%時(shí)所需的濃度，即IC50值，清除率計(jì)算公式如下：

清除率=（1-D1（517 nm）-D2（517 nm）D0（517 nm））×100%。

式中：D0（517 nm）為不加樣品溶液的空白管溶液的吸光度；D1（517 nm）為反應(yīng)溶液的吸光度；D2（517 nm）為不加DPPH溶液的對照管吸光度。

1.3.6.3 羥自由基清除能力參考趙桃等的方法[12] 取干燥試管，依次加入1.0 mL 8.8 mmol/L H2O2、1.0 mL 10 mmol/L FeSO4、1.0 mL 10 mmol/L水楊酸乙醇溶液，再加入1.0 mL樣品溶液，最后加入1.0 mL H2O2于37 ℃水浴中反應(yīng)0.5 h，以蒸餾水作為對照，在510 nm處測吸光度，計(jì)算清除率：

清除率=（1-D1（510 nm）-D2（510 nm）D0（510 nm））×100%。

式中：D0（510 nm）為不加樣品溶液空白管溶液的吸光度；D1（510 nm）為反應(yīng)溶液的吸光度；D2（510 nm）為含1.0 mL H2O2和1.0 mL樣品溶液對照管的吸光度。

1.3.6.4 超氧陰離子自由基清除能力參考資名揚(yáng)等的方法[15] 采用鄰苯三酚自氧化速率法，取干燥試管加入 4.5 mL pH值=8.2的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液和4.5 mL蒸餾水，混合后在25 ℃恒溫水浴中保溫20 min，然后加入于25 ℃預(yù)熱過的3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL，迅速搖勻后倒入比色皿，每隔0.5 min在波長320 nm處測定溶液的吸光度，至5 min后停止。計(jì)算線性范圍內(nèi)1 min吸光度的增加值（ΔD0（320 nm））。在加入鄰苯三酚前，先加入1.0 mL樣品溶液，蒸餾水3.5 mL，從而得到ΔD320 nm，按下式計(jì)算清除率：endprint

清除率=ΔD0（320 nm）-ΔD320 nmΔD0（320 nm）×100%。

式中：ΔD0（320 nm）表示鄰苯三酚自氧化速率；ΔD320 nm表示加入樣品溶液后鄰苯三酚的自氧化速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑青稞花色苷吸收波長的確定

由圖1可知，黑青稞花色苷提液葉在紫外區(qū)270～280 nm 和可見光區(qū)500～550 nm之間均有吸收峰出現(xiàn)，分別為275、528 nm，符合花色苷特征吸收峰的范圍，在324 nm處有吸收峰，則表示該色素分子結(jié)構(gòu)具有酰化基團(tuán)[16]。因此確定黑青稞花色苷測定波長為528 nm。

2.2 花色苷提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 籽粒粉碎與未粉碎的影響 由圖2-A可看出，完整種子的花色苷提取量高于過60目篩的黑青稞種子粉，這是由于黑青稞種子中含有大量的支鏈淀粉[10]，在加熱過程中造成溶液黏稠不利于色素的溶解。因此，以后試驗(yàn)均采用完整的種子浸提。

2.2.2 提取劑的影響 由圖2-B可看出，以60%甲醇為提取劑時(shí)花色苷提取量最高，其次為60%乙醇，100%乙醇的花色苷提取量最低，說明水能促進(jìn)色素的溶解。由于甲醇對人體毒性較強(qiáng)，而乙醇無毒且易回收，因此一般選用一定濃度的乙醇溶液作為提取劑。

2.2.3 乙醇濃度的影響 由圖2-C可知，隨著乙醇濃度的增大，花色苷提取量先升高后下降，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時(shí)，花色苷提取量最高，當(dāng)超過60%后，花色苷提取量便開始下降。由于水能滲透進(jìn)植物細(xì)胞，因此適量的水有利于花色苷從細(xì)胞中滲出。由此可知，60%乙醇溶液提取效果最好。

2.2.4 提取液pH值的影響 由圖2-D可知，當(dāng)提取液pH值為2時(shí)花色苷提取量最高，之后隨著pH值的升高，花色苷提取量開始下降。酸性溶劑能破壞細(xì)胞膜從而有利于水溶性色素的溶解，但過高的pH值會使溶液中花色苷的結(jié)構(gòu)向無色的查耳酮轉(zhuǎn)變，穩(wěn)定性變差[17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，黑青稞花色苷溶液在pH值為2時(shí)比較穩(wěn)定。

2.2.5 溶液酸化劑的影響 由圖2-E可知，經(jīng)鹽酸酸化的提取劑提取花色苷的提取量最高，其次為甲酸，檸檬酸的提取量最低，所以以鹽酸作為下步試驗(yàn)的酸化劑。該結(jié)果與趙桃等的研究結(jié)果[12]不一致，可能是其他提取條件不一樣或不同黑青稞材料的花色苷對各酸化劑的適應(yīng)性不同所致。

2.2.6 提取溫度的影響 由圖2-F可知，隨著提取溫度的升高，黑青稞花色苷提取量先升高后降低，在50 ℃時(shí)提取量達(dá)到最大值，此時(shí)再提高溫度，就會對花色苷的結(jié)構(gòu)造成破壞，促進(jìn)其降解，從而使提取量降低。

2.2.7 提取時(shí)間的影響 由圖2-G可知，隨著提取時(shí)間的延長，花色苷提取量也在逐漸提高。提取時(shí)間從0.5 h升到 1 h 時(shí)，黑青稞花色苷提取量提高明顯，而后再增加提取時(shí)間，提取量雖有提高但它們之間變化并不明顯。過長的提取時(shí)間可能會促進(jìn)雜質(zhì)的滲出和花色苷受熱降解，所以選擇提取時(shí)間為1 h。

2.2.8 液料比的影響 由圖2-H可知，隨著液料比的增大，花色苷提取量先提高后變化平緩，10 mL ∶ 1 g液料比的提取量最高。當(dāng)液料比超過10 mL ∶ 1 g時(shí)，增加液料比對提取效果影響并不明顯，并且過量的提取劑會增加濃縮的時(shí)間與成本。

2.3 數(shù)學(xué)模型與方差分析結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度（A）、液料比（B）、乙醇濃度（C）、pH值（D）等4個(gè)對黑青稞花色苷提取量影響較大的因素為自變量，以提取量為響應(yīng)值的響應(yīng)面分析結(jié)果如表2所示。

使用Design-Exper 8.06軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到以提取量（Y）為目標(biāo)函數(shù)，提取溫度（A）、液料比（B）、乙醇濃度（C）、pH值（D）為自變量的二次多元回歸方程：

Y=-38.976 43+0.869 28A-0.230 19B+0.767 75C+2.072 51D-4.582 05×10-3AB-6.587 25×10-4AC-0.067 739AD+0.0244 27BC-0.078 494BD+0.040 462CD-5.445 78×10-3A2-0.038 747B2-9.091 41×10-3C2-0.795 13D2。

由表3可知，該模型P<0.000 1，極顯著。模型R2為0963 2>0.900，說明相關(guān)性良好，即該模型可以解釋 96.32%的數(shù)據(jù)。失擬項(xiàng)不顯著，表明回歸方程對試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合度高，可以使用該模型進(jìn)行分析和預(yù)測。對模型中各回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，A、D因素對提取量的影響極顯著，各因素對提取量的影響從大到小排序?yàn)閜H值>提取溫度>液料比>乙醇濃度，并且溫度和pH值交互影響顯著，液料比和乙醇濃度交互影響極顯著。

2.4 響應(yīng)面結(jié)果分析

響應(yīng)曲面能直觀反映各因素間的相互作用，由上述研究結(jié)果可知AD、BC交互作用分別為顯著、極顯著，使用 Design-Exper 806軟件得到相應(yīng)的響應(yīng)曲面和等高線，如圖3、圖4所示。隨著pH值、液料比、乙醇濃度這3個(gè)因素的增大或減小，對提取量的影響較大，并且pH值對提取量變化的影響極顯著。

通過軟件對方程進(jìn)一步分析得出，黑青稞花色苷提取的最佳條件為提取溫度60 ℃，液料比10.04 mL ∶ 1 g，乙醇濃度55.76%，pH值=1，在此條件下提取量的預(yù)測值為 9.29 mg/100 g。

2.5 模型驗(yàn)證和超聲波輔助提取

對根據(jù)模型得到的提取黑青稞花色苷的最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證，平行測定3次得到的實(shí)際提取量平均值為9.68 mg/100 g，

與模型理論值9.29 mg/100 g很接近，表明該模型對黑青稞花色苷的提取具有一定實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。endprint

在最優(yōu)提取條件的基礎(chǔ)上使用超聲波輔助提取黑青稞總花色苷的結(jié)果如圖5所示，可見隨著超聲時(shí)間的延長，黑青稞花色苷提取量也在不斷提高。這是由于超聲波增強(qiáng)了溶劑的水合與滲透作用，加速了花色苷的溶出。超聲波處理20 min后花色苷提取量為11.15 mg/100 g，不僅比浸提法提取1 h得到的提取量要高1.47 mg/100 g，還縮短了時(shí)間，超聲40 min后花色苷提取量為14.04 mg/100 g，隨后增加超聲時(shí)間對提取量的變化并不明顯，超聲80 min時(shí)花色苷提取量為 15.03 mg/100 g，而且超聲時(shí)間過長，也會促進(jìn)糖、淀粉等其他雜質(zhì)的滲出而造成溶液黏稠，增加了純化的難度，因此超聲時(shí)間以40 min為宜。

2.6 黑青稞花色苷的抗氧化性

利用反應(yīng)體系中的還原物質(zhì)可將Fe3+還原成Fe2+，從而使溶液顏色加深，因此吸光度越高，溶液中物質(zhì)的還原能力越強(qiáng)。由圖6-a可見，隨著黑青稞花色苷、維生素C濃度的增大，吸光度也在增大，說明還原能力也越來越強(qiáng)。黑青稞花色苷濃度與吸光度之間的相關(guān)系數(shù)為0.958，呈顯著正相關(guān)，維生素C濃度與吸光度之間的相關(guān)系數(shù)為0.982，呈極顯著正相關(guān)，說明還原能力與它們的濃度之間關(guān)系密切，并且總體上黑青稞花色苷的還原能力不如維生素C。

DPPH由于自身特殊的分子結(jié)構(gòu)，在517 nm下有強(qiáng)烈吸收峰，并且它的乙醇溶液肉眼觀察下為紫色，抗氧化劑有供氫能力，可與DPPH的孤對電子配對使其原有結(jié)構(gòu)破壞，顏色變淺，吸光度降低，抗氧化性也就越強(qiáng)。通常以IC50（即清除率過半時(shí)抗氧化劑的濃度）來表示抗氧化能力，其值越小抗氧化能力越強(qiáng)。由圖6-b可見，隨著花色苷、維生素C濃度的增大，它們對DPPH自由基的清除能力也在逐漸增強(qiáng)。黑青稞花色苷、維生素C的濃度（x，mg/mL） 與DPPH自由基清除率（y，%） 的回歸方程分別為y=92.423x+32.793、y=87263x+22.785，r2分別為 0.964 3、0.992 9，說明它們的線性關(guān)系良好。由此得出，花色苷、維生素C的IC50分別為0186、0.311 mg/mL，說明黑青稞花色苷清除DPPH能力要好于維生素C，清除效果約為維生素C的2倍。

利用水楊酸與抗氧化劑相互競爭溶液中羥自由基的能力，使原本水楊酸與羥自由基生成的物質(zhì)顏色變淺，因此可在510 nm下測定吸光度的變化來反映該物質(zhì)的清除能力， 通常

用IC50表示。羥自由基是對生物體危害最大的自由基，可使紅細(xì)胞失活，降解DNA、細(xì)胞膜和多糖化合物，從而引起器官、組織病變[18]。由圖6-c可知，黑青稞花色苷和維生素C都有一定的清除羥自由基能力，其清除率隨濃度增大而提高，線性關(guān)系較好。同樣得出黑青稞花色苷對羥自由基的IC50為0.268 mg/mL，維生素C對羥自由基的IC50為 0.406 mg/mL，說明黑青稞花色苷的羥自由清除能力要好于維生素C。

由于鄰苯三酚堿性溶液在自然狀態(tài)下幾十秒后會產(chǎn)生超氧陰離子，并進(jìn)一步產(chǎn)生具有顏色的中間物質(zhì)，該物質(zhì)的吸光度可隨時(shí)間的延長而呈線性增加，當(dāng)有抗氧化劑加入時(shí)可抑制該物質(zhì)的生成而被用來測定抗氧化性，通常用IC50表示。超氧陰離子自由基不僅自身具有一定破壞性，它還會繼續(xù)反應(yīng)產(chǎn)生其他氧自由基，對生物體的損壞作用進(jìn)一步加大[19]。由圖6-d可見，隨著花色苷、維生素C濃度的增大，它們對超氧陰離子自由基的清除能力呈現(xiàn)遞增的趨勢，具有較好的線性關(guān)系。同樣得出黑青稞花色苷對超氧陰離子自由基的IC50為 0.293 mg/mL，維生素C對超氧陰離子自由基的IC50為0.239 mg/mL，說明維生素C對超氧陰離子的清除效果要略好于黑青稞花色苷。

3 結(jié)論

因?yàn)楸姸嗵崛l件都會對黑青稞花色苷提取量具有不同程度的影響，所以先根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對提取量影響較大的提取溫度、乙醇濃度、液料比、pH值4個(gè)因素，以提取量為響應(yīng)值，使用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取條件，結(jié)果為提取溫度60 ℃，液料比10.04 mL ∶ 1 g，乙醇濃度55.76%，pH值=1，在此條件下提取1 h的提取量的實(shí)測值為9.68 mg/100 g；并且各因素對黑青稞花色苷提取量影響的大小順序?yàn)閜H值>提取溫度>液料比>乙醇濃度。在此基礎(chǔ)上超聲波輔助提取40 min，提取量為14.04 mg/100 g，不僅縮短了提取時(shí)間還提高了提取量，是一種縮短提取時(shí)間的有效方法。

通過測定還原能力、清除DPPH自由基能力、清除羥自由基能力、清除超氧陰離子自由基能力發(fā)現(xiàn)，黑青稞花色苷具有一定的抗氧化活性，與維生素C相比，其清除DPPH自由基和清除羥自由基能力較強(qiáng)，但還原能力和清除超氧陰離子自由基能力沒有維生素C強(qiáng)。它對自由基的清除能力大小依次為DPPH自由基>羥自由基>超氧陰離子自由基，IC50依次為0.186、0.268、0.293 mg/mL，是一種較好的天然抗氧化劑。

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