貴州西南喀斯特地區土壤芽孢桿菌資源及多樣性研究

張 震，謝 和，張文杰，龍金花

(貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550000)

貴州西南喀斯特地區土壤芽孢桿菌資源及多樣性研究

張 震，謝 和*，張文杰，龍金花

(貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550000)

采集興義市坡崗、興仁縣清水河和安龍縣青龍山三個貴州省西南部喀斯特保護區土樣，利用平板分離方法分離芽孢桿菌，根據形態學觀察、生理生化實驗和16SrRNA基因序列分析對其進行鑒定。結果表明：從54份土樣中共分離到芽孢桿菌129株，鑒定為24個種，分為3個屬：芽孢桿菌屬(Bacillus)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)和短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)，其中芽孢桿菌屬為優勢屬(93.80%)，蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)(20.16%)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)(14.73%)和維德曼芽孢桿菌(Bacilluswiedmannii)(10.08%)為優勢種。在多樣性方面，清水河保護區的Margalef豐富度指數、Shannon-Wiener多樣性指數和Pielou均勻度指數皆最高(3.937 7，2.445 5，0.903)，坡崗保護區的Shannon-Wiener多樣性指數和Pielou均勻度指數最低(2.216 0，0.818 3)，青龍山保護區的Margalef豐富度指數最低(3.358 1)；從Jaccard相似性指數來看，坡崗與清水河、青龍山保護區的芽孢桿菌資源不相似(0.243 2，0.187 5)，而清水河與青龍山中等不相似(0.257 1)。

喀斯特地區；芽孢桿菌；資源；多樣性

芽孢是生命世界中抗逆性最強的一種結構，能夠抵抗高溫、干燥、紫外線、電磁輻射和腐蝕性化學藥品等極端因素的影響，廣泛分布于自然界的各種生境中[1，2]。能夠形成芽孢的細菌，包括芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、海洋芽孢桿菌屬、梭菌屬和脫硫腸狀菌屬、八疊球菌屬等。芽孢桿菌因其獨有的生理特征和理化性質，在工業、農業、醫學、環保和軍事領域具有重要的應用研究價值。

土壤作為微生物聚集的大本營，是調查微生物資源及多樣性的重要場所。貴州省地處云貴高原，平均海拔1 100 m，擁有典型的喀斯特巖溶地貌。位于副熱帶東亞大陸的季風區內，屬于中國亞熱帶高原季風濕潤氣候，大部分地區氣候溫和，年均氣溫14～16℃，年平均降水量1 100～1 300 mm，雨量充沛，相對濕度較大。土壤類型十分豐富，從亞熱帶的紅壤到暖溫帶的棕壤均有分布，以黃壤為主。這些獨特的地理、氣候和土壤特點，使得該地區蘊含豐富的土壤芽孢桿菌資源。目前為止，關于貴州喀斯特地區芽孢桿菌資源及多樣性的系統研究較少。鑒于此，本研究從采集貴州省喀斯特地區土壤樣本入手，通過土壤芽孢桿菌分離鑒定和多樣性分析，對貴州喀斯特地區芽孢桿菌資源和生態多樣性展開調查研究。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1土壤樣品 選取貴州省興義市坡崗、興仁縣清水河、安龍縣青龍山三個喀斯特保護區采樣點(參見表1)，于保護區內不同海拔、不同生境下，采集地表以下5～10 cm的土壤，裝入無菌密封袋，及時分離土壤芽孢桿菌。

表1 土壤樣本采集地環境描述Tab.1 Environment description of soil samples from collection sites

1.1.2分離培養基 分離培養基為牛肉膏蛋白胨培養基[3]。

1.1.3試劑 芽孢桿菌基因組DNA提取采用BIOMIGA公司細菌基因組DNA提取試劑盒(GD2411 Bacterial gDNA Miniprep kit)。

1.2試驗方法

1.2.1分離純化 分離純化方法參照《微生物學實驗》[3]。

1.2.2芽孢桿菌的分類鑒定

1.2.2.1 形態學觀察和生理生化實驗 形態學觀察和生理生化試驗方法參照《微生物學實驗手冊》[4]與Bergey’sManual?ofSystematicBacteriology[5]。

1.2.2.2 16SrRNA基因序列測定 PCR擴增引物為細菌16SrRNA基因擴增通用引物63F(CAGGCCTAACACATGCAAGTC，5’→3’)和1387R(GGGCGGWGTGTACAAGGC，5’→3’)[6]。

PCR反應體系為25 μl體系(參見表2)，反應條件參見表3。

表2 25μl PCR反應體系Tab.2 PCR reaction system of 25μl

表3 PCR反應條件Tab.3 PCR reaction condition

PCR產物由上海英濰捷基生物技術有限公司進行測序，得到16SrRNA 基因序列。將序列于EzTaxon(www.ezbiocloud.net)進行比對，使用MEGA6.0軟件構建各個保護區內分離所得芽孢桿菌的系統發育樹。參數為：鄰位相連法(Neighbor-joining)、Kimura2-Parameter Distance模型、重復取樣自展值(Bootstrap)為1 000[7]。

1.2.3芽孢桿菌種類優勢度分析 參數：所在群落的所有芽孢桿菌的個體數之和(N)、芽孢桿菌i的個體數(Ni)；分析公式：di=Ni/N=pi。芽孢桿菌占總物種的百分比di≥10%為優勢種，1%

1.2.4芽孢桿菌群落多樣性分析 參數：所在群落的所有芽孢桿菌的菌株數之和(N)、種類數目(S)、種群優勢度(d)、Margalef豐富度指數(R)、香農-維納(Shannon-Wiener) 的多樣性指數(H’)、Pielou均勻度指數(J)和Jaccard相似性指數(Cj)；各分析指數的公式如下：

Margalef豐富度指數：R=(S-1)/lnN；

Shannon-Wiener多樣性指數：H’=-∑dilndi(i=1，2，3，…，n)；[8]

Pielou均勻度指數：J=H’/lnS；[9]

Jaccard相似性指數：Cj=c/(a+b+c)。

式中a和b分別為兩種生境地中芽孢桿菌的種數或屬數，c為兩種生境地中共有的芽孢桿菌種數或屬數。Jaccard相似性指數(Cj)用于比較兩個生境地中芽孢桿菌種類組成的相似程度，當0.00≤Cj<0.25時，表現為不相似；當0.25≤Cj<0.50時，表現為中等不相似；當0.50≤Cj<0.75時，表現為中等相似；當0.75≤Cj≤1時，表現為極相似。

2 結果與分析

2.1分離純化結果

于三個喀斯特保護區共采集土樣54份，分離到細菌189株，通過芽孢染色及觀察，初步確定芽孢桿菌129株(68.25%)。

表4 芽孢桿菌形態和生理生化試驗結果Tab.4 Physiological and biochemical test results of Bacillus-like species

注1：表格中“+”表示試驗結果為陽性，“-”表示試驗結果為陰性，“d”表示不同的菌株表現不同的試驗結果，“w”表示陽性反應極其微弱；注2：Bacillushorneckiae尚未有對應的中文芽孢桿菌命名；注3：CM000739_s、JH792383_s和JH792233_s在菌種庫中尚未有明確的芽孢桿菌命名。

2.2芽孢桿菌的分類鑒定結果

結合部分生理生化試驗結果(參見表4)，根據16SrRNA基因序列分析，將129株芽孢桿菌鑒定為24個種，涉及3個屬：分別為芽孢桿菌屬(Bacillus)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)和短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)(參見表5)。

2.3各保護區芽孢桿菌分布概況及優勢度分析

坡崗保護區內蘇云金芽孢桿菌和短短芽孢桿菌屬于優勢種，并且短短芽孢桿菌為該地區特有菌種；該地區其他特有芽孢桿菌為暹羅芽孢桿菌、JH792233_s菌株、橋石短芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌枯草亞種。

清水河保護區優勢種為蘇云金芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌；該地區特有芽孢桿菌為病研所芽孢桿菌、解木糖賴氨酸芽孢桿菌、路西法芽孢桿菌和郭霍氏桿菌。

青龍山保護區優勢種是蘇云金芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、維德曼芽孢桿菌、高地芽孢桿菌和蕈狀芽孢桿菌，其中蕈狀芽孢桿菌為該地區特有菌種；該地區其他特有芽孢桿菌為單純桿菌和彎曲芽孢桿菌。

三個保護區優勢種為蘇云金芽孢桿菌(20.16%)、蠟樣芽孢桿菌(14.73%)和維德曼芽孢桿菌(10.08%)，芽孢桿菌屬為優勢屬(93.80%)。以上結果可以體現出貴州西南喀斯特地區生境下一定的芽孢桿菌資源及分布特點。具體參見表5。

表5 芽孢桿菌資源種類及優勢度結果Tab.5 Resources and dominance of Bacillus-like species

注1：“0.0000”表示該區域未分離到該種芽孢桿菌；注2：Bacillushorneckiae尚未有對應的中文芽孢桿菌命名；注3：CM000739_s、JH792383_s和JH792233_s在菌種庫中尚未有明確的芽孢桿菌命名。

2.4各保護區芽孢桿菌群落多樣性分析

從圖1(A， B)得出，清水河保護區數值皆最高，青龍山保護區R值最低，坡崗保護區H’值最低。表明清水河保護區土壤芽孢桿菌在種類數量方面和種屬水平分布均勻度方面都具有優勢，群落穩定性更加明顯[10]。

從圖1(C)得出，清水河保護區J值最高，坡崗保護區J值最低。表明清水河保護區土壤芽孢桿菌在種屬間和種內分布都比較均勻。

圖1 各保護區相關指數結果Fig.1 Relevant index of any reserve

坡崗與清水河之間的相似性指數Cj為0.243 2，表現為不相似；坡崗與清水河之間的相似性指數Cj為0.187 5，表現為不相似；清水河與青龍山之間的相似性指數Cj為0.257 1，表現為中等不相似(參見表6)。

表6 各保護區間相似性指數結果Tab.6 Similarity index between any reserve

3 討 論

土壤芽孢桿菌資源及多樣性研究越來越受到專家學者的青睞。王子旋等對新疆不同地區的土壤芽孢桿菌種類及其多樣性進行了調查， 結果顯示新疆地區芽孢桿菌種類較豐富， 但在種類和數量上受空間分布影響[11]；劉國紅等對玉米根際土壤的芽孢桿菌做了一定的研究，發現了芽孢桿菌與玉米根部之間的相關聯系[12]；葛慈斌等首次調查了武夷山地衣表生和內生芽孢桿菌種類多樣性，發現芽孢桿菌屬為優勢屬，蘇云金芽孢桿菌為優勢種[13]。

在貴州西南部喀斯特地區土壤芽孢桿菌多樣性方面，清水河保護區自然生境類型豐富，海拔地勢低，氣候濕潤溫熱，人為活動影響小，參數相對較高；而坡崗保護區氣候偏干燥，人為活動較頻繁，參數相對較低。一定程度上反映出人為活動程度、濕度、海拔高度、生境種類、種群密度等環境因素會對土壤芽孢桿菌豐富度、多樣性、分布均勻度等造成一定的影響，在人為活動程度小、濕度大、海拔低、生境類型豐富、種群密度適中的生境下，芽孢桿菌各種多樣性指數相對更有優勢。受人為活動因素影響較大的生境與自然生境在芽孢桿菌資源相似度方面有著較高的差異，自然生境間差異不顯著。

蘇云金芽孢桿菌是世界范圍內應用最廣泛的生防芽孢桿菌之一，在本次研究土壤中具有明顯的優勢度，同樣，阿氏芽孢桿菌和短短芽孢桿菌也可應用于生防制劑的研發，可以為生防芽孢桿菌的開發和利用儲備菌種，提升作物病蟲害防治水平；高地芽孢桿菌因其具有脫氮除磷作用[14]，是一種良好的廢水凈化功能菌種，蕈狀芽孢桿菌、彎曲芽孢桿菌等在污水處理的解磷、解氮和重金屬離子吸附方面也有相關應用；維德曼芽孢桿菌是美國于2016年從乳制品分離出的一株新型耐冷、具有致病性的芽孢桿菌[15]，在喀斯特地區土壤中的報導尚屬首次；菌種JH792383_s、菌種CM000739_s和菌種JH792233_s在菌種庫中尚未有明確的芽孢桿菌命名，相關研究報導極少，具有較高的研究價值。

以上結果顯示了該地區具有較豐富的土壤芽孢桿菌資源，并且其分布及多樣性特征與當地生境之間存在一定的關聯，可為研究貴州西南喀斯特地區芽孢桿菌特點提供相應的參考。

[1] Kim Y H，Kim I S，Moon E Y，etal. High Abundance and Role of Antifungal Bacteria in Compost-Treated Soils in a Wildfire Area[J]. 2011， 62(3)：725-737.

[2] G?rtner A，Blümel M，Wiese J，etal. Isolation and characterisation of bacteria from the Eastern Mediterranean deep sea[J].AntonievanLeeuwenhoek， 2011， 100(3)：421-435.

[3] 沈 萍. 微生物學實驗.第4版[M]. 高等教育出版社，2007.

[4] 周德慶，編. 微生物學實驗手冊[M]. 上海科學技術出版社，1986.

[5] Brenner D J，Krieg N R，Staley J T. Bergey’s Manual? of Systematic Bacteriology[M]. Williams & Wilkins*， 2005.

[6] Marchesi J R， Sato T， Weightman A J，etal. Design and Evaluation of Useful Bacterium-Specific PCR Primers That， Amplify Genes Coding for Bacterial 16S rRNA[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology， 1998，64(2)：795.

[7] 鄭有坤，任 丹，盧圣鄂，等. 鉛鋅礦區蜈蚣草內生放線菌的多樣性及群落結構[J]. 環境科學學報，2014，34(11)：2832-2838.

[8] 張華勇，李振高，王俊華，等. 紅壤生態系統下芽孢桿菌的物種多樣性[J]. 土壤，2003，35(1)：45-47.

[9] 龔國淑，唐志燕，鄧香潔，等. 成都郊區土壤芽孢桿菌的空間分布及其多樣性[J]. 生態學雜志，2009，(10)：2009-2013.

[10] 張穎慧. 森林植被與土壤微生物關系研究進展[J]. 安徽農業科學，2014，(30)：10683-10684+10758.

[11] 王子旋，劉 波，林營志，等. 新疆土壤芽孢桿菌采集鑒定及其分布多樣性[J]. 福建農業學報，2012，27(2)：187-195.

[12] 劉國紅，朱育菁，劉 波，等. 玉米根際土壤芽孢桿菌的多樣性[J]. 農業生物技術學報，2014，22(11)：1367-1379.

[13] 葛慈斌，鄭 榕，劉 波，等. 武夷山自然保護區土壤可培養芽孢桿菌的物種多樣性及分布[J]. 生物多樣性，2016，(10)：1164-1176.

[14] 倪晉仁，鄧若男. 一株耐鹽脫氮除磷高地芽孢桿菌其在廢水處理中的應用：CN，CN102703350A[P]. 2012.

[15] Miller R A， Beno S M， Kent D J，etal. Bacillus wiedmannii sp. nov. a psychrotolerant and cytotoxic Bacillus cereus group species isolated from dairy foods and dairy environments[J].InternationalJournalofSystematic&EvolutionaryMicrobiology， 2016， 66(11).

ResearchonResourcesandDiversityaboutSoilBacillusofKarstAreaintheSouthwestofGuizhouProvince

ZHANGZhen，XIEHe*，ZHANGWen-jie，LONGJin-hua

(1.CollegeofLifeScience，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550000，China)

54 soil samples were collected from Pogang nature reserve in Xingyi city，Qingshui River nature reserve in Xingren county and Qinglong Mountain nature reserve in Anlong county in Karst landform area of southwest of Guizhou province.TheBacillus-like species were isolated by utilizing plate separation method and then identified using morphological observation，Physiological and biochemical experiments and 16SrRNA gene sequence analysis. Results showed that 129 strains isolated from these soil samples belonged to 24Bacillus-like species and 3 genus(Bacillus，LysinibacillusandBrevibacillus).The dominant bacteria forming spore areBacillusthuringiensis(20.16%)，Bacilluscereus(14.73%)，Bacilluswiedmannii(10.08%)of three reserves andBacillusis dominant genera(93.80%).Further research in terms of diversity indicated that every index ofBacillus-like in Qingshui River was the highest(3.9377，2.4455，0.9031)， but Pogang had the lowest level of what included Shannon-Wiener diversity index and Pielou evenness index (2.2160，0.8183)，and the Margalef richness index about Qinglong Mountain was the lowest (3.3581).Pogang was not similar to Qingshui River and Qinglong Mountain(0.2432，0.1875)， while Qingshui River and Qinglong Mountain were not either moderately concerning the Jaccard similarity index(0.2571).

Karst landform area；Bacillus；resources；diversity

2017-04-11；

2017-10-17

國家科技基礎性工作專項，西南喀斯特地區特色微生物資源及多樣性調查(編號：2014FY120100)。

*

謝 和，副教授，主要研究方向：微生物資源學。E-mail：xieheh@163.com。

Q938

A

1008-0457(2017)05-0036-06國際DOI編碼10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.05.006