荔枝酒低溫高糖發(fā)酵技術研究

張 斌，李明陽

(惠州學院生命科學學院，廣東惠州516007)

荔枝酒低溫高糖發(fā)酵技術研究

張 斌，李明陽

(惠州學院生命科學學院，廣東惠州516007)

為了解決高糖發(fā)酵遲緩和不徹底的問題，通過添加氮源強化發(fā)酵能力，考察了添加氮源對果酒中總糖、酒精度、總酯和雜醇油等的影響。結果顯示，添加氮源可以明顯促進發(fā)酵時對糖的消耗，提升乙醇和酯類物質得率，降低雜醇油生成量。與對照樣相比，添加尿素、硫酸銨及復合氮源發(fā)酵的酒樣總糖濃度分別降低了22.63%、27.24%和35.21%；酒精含量分別提高了14.63%、20.42%和23.16%；雜醇油含量分別降低了4.70%、8.33%和14.41%。研究表明，添加氮源可以促進荔枝酒的低溫高糖發(fā)酵，有利于提升荔枝酒的品質。

荔枝酒； 高糖發(fā)酵； 氮源

高糖發(fā)酵（含糖量≥25%）因具有設備利用率高、效率高和節(jié)約能源等優(yōu)點而被廣為應用。在酒精發(fā)酵初期，高糖度會引起高滲透壓，高滲透壓會影響酵母的生長代謝，同時隨著酒精含量的增大，會削弱酵母細胞膜對極性分子的屏蔽能力，對細胞膜成分和細胞代謝產生影響，不同的酵母菌株對酒精的耐受性不同，酵母的生長代謝和發(fā)酵能力也取決于酒精耐受力的大小[1-2]。菌種生長和發(fā)酵產物合成需要氮源，氮源主要用于菌體細胞物質(氨基酸、蛋白質、核酸等)和含氮代謝物的合成。發(fā)酵中使用的氮源可分為兩大類：有機氮源和無機氮源。常用的無機氮源包括各種銨鹽、硝酸鹽、氨水等。本實驗研究了添加蛋白胨、尿素、硫酸銨和硝酸銨等氮源強化果酒發(fā)酵能力，找到了最佳添加量，為荔枝酒的高糖發(fā)酵提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荔枝汁：由廣東禎州集團有限公司提供；食品級蛋白胨、食品級尿素、食品級硫酸銨、食品級硝酸銨，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇均為色譜純，上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

6890N氣相色譜儀-5975質譜儀：美國Agilent公司；頂空固相微萃取裝置(聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)萃取頭100 μm)：美國Supelco公司；UV-7504紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 高糖發(fā)酵工藝

荔枝汁→冷凍濃縮（總糖340 g/L)→成分調整（調酸）→接種酵母菌（250 mg/L）→添加氮源→酒精發(fā)酵（12℃）→過濾→陳釀→成品

1.3.2 氣質聯(lián)用分析果酒中雜醇油[3-4]

（1）頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)

在15 mL頂空樣品瓶中添加10 mL酒樣，在磁力攪拌器作用下以50℃平衡10 min，將微萃取纖維100 μm 的PDMS在250℃老化處理2 h，再以50℃頂空萃取40 min，再以230℃脫附3 min，待檢。

（2）GC/MS操作條件

氣相色譜條件：DB-1色譜柱(30.0 m×0.25 mm×0.25μm)，柱溫為程序升溫：先以45℃保持1 min，再以3℃/min升溫至55℃，保持1 min，再以10℃/min升溫至120℃，保持10 min后再升溫到200℃。進樣口溫度為230℃，載氣為氦氣(He)，流速1 mL/min，不分流。

質譜條件：電離方式電子電離(electronic ionization，EI)源，電子能量70 eV，檢測器電壓為350 V，離子源溫度230℃，接口溫度280℃，以35～335 amu為掃描質量范圍。

（3）數據處理

以保留時間進行定性，外標峰面積法進行定量。

1.3.3 標準溶液的配制

準確稱取甲醇20.0 mg、丙醇30.0 mg、正丁醇40.0 mg、異丁醇40.0 mg、異戊醇40.0 mg，用體積分數40%乙醇水溶液溶解并定容至10 mL，混勻，密封后置于冰箱中保存，使用時用體積分數40%乙醇水溶液稀釋10倍。

1.3.4 理化指標測定方法

總糖和酒精度等常規(guī)理化指標測定采用國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，總酯測定方法參照國標GB/T 10345—2007《白酒分析方法》。

2 結果與分析

2.1 響應面優(yōu)化分析

2.1.1 單一氮源

分別添加蛋白胨、尿素、硫酸銨和硝酸銨等單一氮源，發(fā)酵結束后總糖與氮源添加濃度的關系見圖1。

圖1 氮源對總糖的影響

由圖1可看出，添加不同氮源的酒樣，發(fā)酵過程中總糖變化趨勢不同。氮源添加濃度在300～800 mg/L時，單一添加蛋白胨、尿素和硫酸銨的酒樣，總糖濃度均呈現先降低后上升的趨勢，且分別在400 mg/L、500 mg/L和700 mg/L添加量時，總糖濃度最低；單一添加硝酸銨的酒樣，總糖濃度隨著添加量的增加而呈現出上升趨勢。蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨的最優(yōu)添加量分別為400 mg/L、500 mg/L、700 mg/L、300 mg/L，其相對空白樣的變化見圖2。

圖2 發(fā)酵過程中總糖的變化

由圖2可知，所有酒樣的總糖含量均隨發(fā)酵時間呈現明顯降低的趨勢。添加了氮源酒樣的發(fā)酵速率均比對照樣高，說明外氮源促進了高糖發(fā)酵的進行。隨著發(fā)酵的進行，總糖含量下降的速率逐漸降低，這是由于伴隨著高糖發(fā)酵的進行，酒樣中酒精含量不斷增加，較高的酒精含量削弱了酵母細胞膜對極性分子的屏蔽能力，對細胞膜成分和細胞代謝過程產生影響，從而使發(fā)酵效率逐漸降低。4種氮源對高糖發(fā)酵的促進效果由強到弱的順序分別為硫酸銨＞尿素＞硝酸銨＞蛋白胨。

2.1.2 響應面法優(yōu)化復合氮源

以酒精度作為參考指標，選擇硫酸銨和尿素進行最陡爬坡實驗。最陡爬坡實驗設計與結果見表1。

表1 最陡爬坡實驗設計與結果

由表1可知，在第3組氮源添加組合條件下，發(fā)酵結束后的酒精度最高。因此，以第3組實驗的氮源添加條件作為響應面設計的中心點，以發(fā)酵結束后的酒精度為響應值，進行2因素5水平的Central-Composite設計，各因素水平見表2。Central-Composite設計及實驗結果見表3。

表2 Central-Composite設計各因素水平

表3 Central-Composite設計及實驗結果

用Design Expert軟件對表3中酒精度數據進行回歸分析，得到以發(fā)酵結束后酒精度為響應值的線性回歸方程為：

其中響應值Y為發(fā)酵結束后的酒精度，X1為尿素添加量，X2為硫酸銨添加量，根據回歸分析結果與回歸方程進行回歸模型及系數顯著性檢驗和回歸模型方差分析，結果見表4和表5。

由表4、表5可知，回歸模型的F值為30.80，Prob(P)＞F的概率僅為0.0009，并且，模型的相關性系數R2=0.9686，這說明該模型的擬合性較好且該模型顯著性較高。因此，可以用該模型進行分析和預測添加氮源強化高糖發(fā)酵后的酒精度。用Design Expert軟件繪制出兩種氮源之間交互影響的響應面分析三維曲面圖和等高線圖，見圖3和圖4。

由響應面分析可知，兩因素間的相互作用比較明顯。軟件推薦的通過響應面優(yōu)化得出的最優(yōu)氮源添加組合及添加量為：尿素445 mg/L、硫酸銨650 mg/L，發(fā)酵結束后酒精度理論值為14.36%vol。

2.2 優(yōu)化后的高糖發(fā)酵

以響應面優(yōu)化得到的最優(yōu)氮源添加條件進行高糖發(fā)酵，將優(yōu)化后的發(fā)酵實驗數據與空白樣及單一氮源添加進行對比分析。

表4 回歸模型及系數顯著性檢驗

表5 回歸模型方差分析

2.2.1 對總糖和酒精度的影響

圖3 響應面分析三維曲面圖

圖4 響應面分析等高線圖

發(fā)酵過程中總糖含量和酒精度變化分別見圖5和圖6。

圖5 總糖隨發(fā)酵時間的變化

圖6 氮源對酒精度的影響

由圖5和圖6可知，所有發(fā)酵果汁的總糖濃度均呈現快速降低的趨勢，發(fā)酵液的酒精含量均呈現快速升高的趨勢。添加了氮源的發(fā)酵效率明顯高于未添加氮源的對照樣，復合氮源的發(fā)酵效率明顯高于單一氮源。相對于空白樣，單一氮源的酒樣，發(fā)酵結束后總糖濃度分別降低了22.63%和27.24%，酒精含量分別增加了14.63%和20.42%；復合氮源的酒樣，總糖濃度降低了35.21%，酒精含量增加了23.16%。復合氮源比單一氮源的酒樣發(fā)酵結束后總糖分別降低了16.35%和10.93%，酒精度分別增加了7.82%和2.65%。

經響應面分析后酒精度的實際含量是預測含量的97.38%，這說明經響應面分析所得到的模型可以較好的預測實際發(fā)酵情況。

2.2.2 對總酯的影響

發(fā)酵過程中的總酯含量變化見圖7。

由圖7可知，隨著發(fā)酵的進行，各酒樣總酯含量均呈現上升趨勢。添加氮源調控的高糖發(fā)酵的酒樣總酯含量均高于對照樣。與對照樣相比，添加尿素、硫酸銨及復合氮源發(fā)酵的酒樣總酯含量分別增加了15.85%、19.58%、24.94%。由此可見，經響應面優(yōu)化后所得的總酯含量高于單一氮源。

總酯是果酒中所有酯類芳香物質的總和，是果酒中主要香氣成分的重要組成之一。總酯含量的高低在一定程度上決定了果酒品質的好壞。在高糖發(fā)酵過程中，酯類物質的產生與酵母細胞的代謝過程有關。酵母細胞經分解代謝將糖類分解成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A的分解和來源于氨基酸的碳骨架構成了酯類物質合成的主要原料。在高糖發(fā)酵時添加了氮源后，對谷氨酸和亮氨酸等氨基酸的合成具有積極的促進作用，從而促進了高糖發(fā)酵荔枝酒中總酯的生成。例如，在酵母細胞利用亮氨酸合成乙酸異戊酯的過程中，亮氨酸經過脫氨和脫羧產生一種醛，然后生產的醛被還原成醇，最后生成的醇可以與乙酰輔酶A發(fā)生酯化反應從而生成乙酸異戊酯[5-7]。

2.2.3 對雜醇油的影響

雜醇油是果酒中重要芳香物質的組成成分之一，是正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇等高級醇類的統(tǒng)稱。適量的雜醇油可以使酒體更加醇厚飽滿，但過量就會影響酒的品質。因為雜醇油在人體中的代謝速度較慢，停留時間長，對人體有一定的毒害作用，能使神經系統(tǒng)充血，從而使人感到頭痛頭暈[8-10]。在高糖發(fā)酵過程中雜醇油含量變化見圖8。

圖8 氮源對雜醇油的影響

由圖8可知，在高糖發(fā)酵過程中，各酒樣的雜醇油含量均呈現上升趨勢。與對照樣相比，添加尿素、硫酸銨及復合氮源發(fā)酵酒樣的雜醇油含量分別降低了4.70%、8.33%和14.41%。可見，添加氮源對雜醇油的產生具有一定的抑制作用，響應面優(yōu)化組的抑制效果最好，其次是硫酸銨。

在果酒發(fā)酵的過程中，雜醇油的來源有兩條途徑：一是降解代謝途徑，在此途徑中雜醇油的形成是由氨基酸轉氨、脫羧、還原而產生；二是合成代謝途徑，在該途徑中雜醇油是由糖類經生物合成氨基酸的中間階段形成α-酮酸中間體后經脫羧、還原從而形成高級醇。當發(fā)酵過程中的氮源不足時，酵母細胞就會經過代謝途徑，以氨基酸作為氮源，從而增加了雜醇油的含量[11-15]。當添加了氮源補充發(fā)酵氮源后，就會減少這部分高級醇的產生機會，從而降低了果酒中雜醇油含量。

3 結論

荔枝酒在12℃左右低溫高糖發(fā)酵時，添加單一硫酸銨、尿素、硝酸銨和蛋白胨等氮源均能促進發(fā)酵，硫酸銨和尿素復合添加的最優(yōu)添加量分別為650 mg/L和445 mg/L。外加氮源有利于提升乙醇和酯類物質得率，降低高級醇生成量，使酒體香氣濃郁，提升荔枝酒的品質。

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High-Sugar Low-Temperature Fermentation of Litchi Wine

ZHANG Bin and LI Mingyang

(School of Life Science,Huizhou University,Huizhou,Guangdong 516007,China)

In order to settle the problem of sluggish and unthorough high-sugar fermentation,nitrogen source was added for strengthening the fermenting power.The effects of adding nitrogen source on total sugar content,alcohol content,total esters content and fusel oil content in litchi wine were investigated.The results revealed that the addition of nitrogen source could evidently advance sugar consumption in fermentation process,enhance the yield of ethanol and esters,and reduce the yield of fusel oil.Compared with the contrast samples,in wine samples with the addition of urea,ammonium sulfate,and complex nitrogen source respectively,total sugar content reduced by 22.63%,27.24%,and 35.21%respectively,alcohol content increased by 14.63%,20.42%,and 23.16%respectively,and fusel oil content decreased by 4.70%,8.33%,and 14.41%respectively.All the evidence proved that adding nitrogen source was helpful for high-sugar low-temperature fermentation and for the improvement of litchi wine quality.

litchi wine;high-sugar fermentation;nitrogen source

TS262.7；TS261.4

A

1001-9286（2017）11-0051-06

10.13746/j.njkj.2017203

廣東省教育廳項目基金(2015KTSCX133)；惠州市科技項目基金（2015B010002001）。

2017-07-21

張斌（1979-），男，講師，博士，主要從事果酒、葡萄酒釀造和食品綠色加工，E-mail：zhangbinwr@qq.com。

優(yōu)先數字出版時間：2017-09-20；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170920.1451.003.html。