大菱鲆精子運動特征與精液pH的相關性研究

安 皓, 徐世宏, 豐程程, 王彥豐, 劉清華, 李 軍

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大菱鲆精子運動特征與精液pH的相關性研究

安 皓1, 2, 3, 徐世宏1, 3, 豐程程1, 2, 3, 王彥豐1, 3, 劉清華1, 3, 李 軍1, 3

(1. 中國科學院海洋研究所中國科學院實驗海洋生物學重點實驗室, 山東青島 266071; 2. 中國科學院大學, 北京 100049; 3. 青島海洋科學與技術國家實驗室海洋生物學與生物技術功能實驗室, 山東青島 266237)

為探究大菱鲆()精液質量與pH的關系及甘油對大菱鲆精子激活的影響, 本研究通過計算機輔助精子分析系統分析檢測了威海和煙臺4家大菱鲆育苗場(A、B、C、D)的精子質量。研究發現, 不同育苗場的大菱鲆精子活力存在顯著的差異, A2>A1>D>C>B, 精子預測壽命分別為11.7、7.1、6.8、4.6、3.3 min, 所取精子的質量的存在顯著差異。研究結果發現, 大菱鲆精子運動特性與精子活化率相關性顯著, 其中精子活化率與平均曲線運動速度、平均直線運動速度、平均路徑速度、精子頭側擺幅度、精子平均鞭打頻率呈顯著正相關(<0.05), 與運動直線性、運動擺動性、運動前向性等參數無顯著相關性; 大菱鲆精子運動特性受pH影響顯著, 精液pH與平均曲線運動速度、平均直線運動速度、平均路徑速度、精子頭側擺幅度、精子平均鞭打頻率呈顯著正相關(<0.05), 而與運動直線性、運動擺動性、運動前向性等參數無顯著相關性。同時還發現, 精子活化率高、壽命長的大菱鲆精液pH偏弱堿性(pH=8.0), 即大菱鲆精子適宜在弱堿性環境中活動。除此之外, 向激活海水中加入梯度甘油(0.1、1、10、100、500、1 000 mmol/L), 發現可以顯著提高大菱鲆精子壽命, 其中甘油濃度為100 mmol/L時, 精子壽命延長至15.17 min±0.29 min, 推測甘油在精子激活后可能被精子吸收并氧化分解提供能量。

大菱鲆(); 精子; 運動特征; pH

魚類精子質量由于該魚種養殖模式、個體、環境等因素的不同, 存在較大的個體差異[1-4]。精子質量對魚類的人工繁育至關重要, 優質的精子可以顯著提高受精率和孵化率, 從而提高養殖生產效益。在其他研究領域, 對精子質量的鑒定也十分重要, 如精子冷凍、品系選育、重金屬污染評價等[5]。魚類精子質量的評價方法有很多, 如精子活化率、運動時間、精子密度、受精率和生理功能等[5]。計算機輔助精子分析(computer-assisted sperm analysis, CASA)技術能對精子的動靜態圖像全面量化分析[6], 與常規精液分析方法(Sperm routine analysis, SRA)相比測定指標更多樣、客觀、準確。

甘油作為精子冷凍保存的添加劑, 在精子冷凍保存中的作用已經比較清楚, 但在精子激活后活力維持中是否有作用及其作用機制尚不清楚。在精子活力維持方面, 糖類(如葡萄糖、果糖)等外源物質能夠促進精子的活力[7-8]。有研究表明, 精子細胞中的甘油能夠進入糖酵解途徑, 參與有氧代謝, 提供能量, 促進精子活力的維持[9-11]。

鲆鰈魚類是中國重要的海水養殖魚類, 其中大菱鲆()養殖產業占鲆鰈類產量和規模的80%。本實驗擬以大菱鲆精子為研究對象, 采集了4個不同魚苗場的大菱鲆精子, 通過對這些大菱鲆精子活力的檢測和評價, 探究精液質量與pH的關系, 及甘油對大菱鲆精子激活的影響, 為提高大菱鲆人工繁殖的受精率提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 親魚來源

實驗用大菱鲆親魚采集于威海和煙臺4家公司的繁殖用魚, 采集時間2016年9月、10月, 其中于A公司先后采集了2次, 選取尾數分別為25(A1, 12條; A2, 13條)、8、8、8條。

1.2 藥品及儀器

實驗所用甘油購自青島恒飛生物科技有限公司(分析純), 不同濃度梯度的甘油激活劑設置為0.1、1、10、100、1 000 mmol/L, 用海水稀釋, 顯微鏡型號Nikon-eclipse-E200, 計算機輔助分析系統(CASA)。

1.3 采集方法

隨機取繁殖用魚, 采用人工擠壓腹部的方法采集精液, 操作過程中盡量避免海水、糞便、尿液等的污染。采集到的精液裝入1.5 mL離心管內, 置于裝有冰袋(毛巾包裹)的泡沫箱中暫存。精液采集為逐條采集, 隨后立即檢測精子質量, 1個個體為1個樣本。

1.4 精子質量檢測

精子的活力檢測通過自然海水進行稀釋激活精子, 在10倍顯微鏡下觀察精子的運動情況并通過計算機軟件采集相關數據并統計。活化率檢測: 激活后30s時對精子的活化率進行統計, 每個樣本計數的精子數大于200個, 以快速和中速運動精子個數之和與總計數精子個數的比值作為精子的活化率指標(速率指標: 快速>100mm/s、中速45~100mm/s、慢速10~45mm/s, 不動<10mm/s)[12-13]。壽命檢測: 精子自激活開始到約 95%停止原處顫動, 即認為壽命終止。運動特征參數檢測: 激活后30 s時記錄精子運動特征參數。pH檢測: 采用pH試紙檢測每個樣本pH值。梯度甘油激活劑激活精子, 檢測不同濃度的甘油激活精子后精子的壽命。

1.5 統計分析

本實驗數據均用SPSS 16軟件進行分析。實驗數據以平均數±SD表示, 平均數的比較采用 One- Way ANOVA 分析法和Kruskal-Wallis檢驗,<0.05為差異顯著,<0.01為差異極顯著, 相關性分析采用Pearson法。

2 結果與分析

2.1 大菱鲆精子活化率與運動特征參數

實驗以自然海水激活精子, 測得激活后30 s時的8個運動特征參數: 平均曲線運動速度(curvilinear velocity, VCL)、平均直線運動速度(straight line velocity, VSL)、平均路徑速度(average path velocity, VAP)、精子頭側擺幅度(amplitude of lateral head displacement, ALH)、運動的直線性(linearity, LIN)、運動的擺動性(wobble, WOB)、運動的前向性(straightness, STR)、精子平均鞭打頻率(beat cross frequency, BCF), 活化率與運動特征參數關系如圖1所示。

大菱鲆精子激活后活化率與運動特征參數VCL(=0.845,<0.01,=49)、 VSL(=0.664,<0.01,=47)、VAP(=0.763,<0.01,=49)、ALH(=0.695,<0.01,=43)、BCF(=0.871,<0.01,=43)呈極顯著正相關關系, 與LIN、WOB、STR相關性不顯著。

2.2 大菱鲆精液pH與精子運動特征參數

實驗以自然海水激活精子, 用pH試紙測得從各育苗場取得的精液未激活時的pH, 同時測得激活后30 s時的8個運動特征參數: 平均曲線運動速度、平均直線運動速度、平均路徑速度、精子頭側擺幅度、運動的直線性、運動的擺動性、運動的前向性、精子平均鞭打頻率, pH與運動特征參數關系如圖2所示。

大菱鲆未激活精液的pH與大菱鲆精子激活后的運動特征參數VCL(=0.300,<0.05,=40)、 VSL(=0.546,<0.01,=29)、VAP(=0.494,<0.01,=38)、ALH(=0.603,<0.01,=42)、BCF(=0.476,<0.01,=33)呈正相關關系, 與LIN、WOB、STR相關性不顯著。ALH在各pH組之間差異顯著(6.5a、7.0a、7.5b、8.0c,<0.05), VCL、VSL、VAP、BCF僅在pH 7.5和8.0兩組中存在顯著差異(<0.05), LIN、STR、WOB在各pH組之間無顯著差異。大菱鲆精液pH越高VCL、VSL、VAP、ALH、BCF等參數的數值也越高, 精子活力也越好。

2.3 大菱鲆精液pH與精子活化率

將各個養殖場取得的精液用pH試紙測得未激活精液的pH(=37), 以激活后30 s時測得的快速(>100mm/s)和中速(45~100mm/s)運動精子占所有精子的比例作為精子活化率, pH與活化率關系如圖3所示。

大菱鲆精液pH與精子活化率呈極顯著正相關關系(=0.466,<0.01), 活化率在各pH組之間分別為6.5ab、7ab、7.5a、8b(<0.05)。大菱鲆精液pH越高活化率越高, 精子活力也越好。好的大菱鲆精液pH呈弱堿性, 在8.0左右。

圖1 大菱鲆精子活化率與運動特征參數

2.4 精子壽命

將各養殖場采集到的精子樣品取5~8個測精子壽命。將精子以自然海水激活, 30 s時測活化率, 之后每隔30 s測1次活化率, 各養殖場的樣品測得的數據分別取平均后, 測得不同養殖場精子激活后時間與精子活化率關系如圖4所示。

隨著激活后時間的持續, 精子活化率明顯下降, 各養殖場精液質量也存在明顯差異(<0.01)。精液質量情況: A2>A1> D> C> B。根據圖1中的擬合曲線方程得到不同養殖場精子壽命如表1所示。

2.5 大菱鲆精液pH與精子壽命

將各個養殖場取得的精液用pH試紙測得未激活精液的pH(=40), 然后將養殖場采集到的精子樣品以自然海水激活, 測得精液pH與精子壽命關系如圖5所示。

大菱鲆精液pH與精子壽命呈極顯著正相關關系(=0.576,<0.01), 各pH組精子壽命分別為6.5a、7b、7.5bc、8c(<0.05)。大菱鲆精液pH越高壽命越長。

圖2 大菱鲆精液pH與精子運動特征參數

2.6 甘油對精子激活后精子壽命的影響

用海水稀釋甘油獲得不同濃度梯度的甘油激活劑, 各梯度甘油激活劑分別激活精子, 測3個活力相近的精液樣本后取平均值, 測得不同梯度甘油激活劑激活下的精子壽命如圖6所示。

實驗組與對照組有顯著差異(<0.05), 不同濃度實驗組之間也有顯著差異(<0.05), 說明加入甘油后可以延長精子壽命, 其中甘油濃度在100 mmol/L的時候效果最好, 濃度過高會降低精子壽命。

圖3 大菱鲆精液活化率與pH

圖4 大菱鲆精子活化率與激活時間

表1 不同育苗場場大菱鲆精子壽命

圖5 大菱鲆精液pH與精子壽命

圖6 大菱鲆精子活力與甘油濃度

圖中字母代為多重比較結果

The letters represent the results of multiple comparison

3 討論

魚類精子活力的評價指標有多種, 如精子活化率、運動時間、密度、形態、受精率和生理功能等。本實驗選取其中最傳統的評價方法——精子活力, 其測定方便, 能較準確地評價精子質量。計算機輔助精子分析與常規精液分析方法相比, 前者能客觀準確地量化精子運動狀況, 通過對精子運動特征參數的捕獲, 使人們對精子運動有了更深層次的了解, 并已被越來越多地用于精子質量的評估。實驗檢測了精子8個運動特征參數, 其中VCL、VSL、VAP、ALH、BCF與精液pH或活化率成正相關關系, LIN、STR 、WOB與精液pH或活化率相關性不顯著, 這與LIN、STR、WOB是比值的定義有關。比較各運動特征參數在不同pH組之間的差異性發現, 多數運動特征參數在高pH組之間差異顯著, 低pH組之間、高pH與低pH組之間差異不顯著, 這可能與低pH值組有效數據太少有關。

實驗共測得49尾魚的pH, 其中pH在7.0以上的占78%。作者發現, 活化率高、精子壽命長的大菱鲆精液pH偏弱堿性, 即大菱鲆精子適宜在弱堿性環境中活動。唐天德等[14]認為, 魚類精子均適于在中性和偏堿性環境中活動, 酸性環境會破壞精子細胞, 抑制精子活力。據報道, 草魚()、鯉()和烏鱧()等淡水魚類精子活力最強時的適宜pH值均在7.5~9.0, 即在弱堿性范圍內[15], 眼斑擬石首魚()、點帶石斑魚()等海水魚類精子活力最適pH范圍分別是6.5~8.5、6.5~8.0, 也在弱堿性范圍內[16-17]。在本試驗中大菱鲆精子活力最強時的pH為8.0, 這一結果與其他魚類一致。實驗發現激活30s時, 在較低pH組的樣品中也有運動特征參數值較高的樣品, 且這些精子的各運動特征參數均處于較高水平, 但是與高pH下同等活力的樣品相比, 它們的壽命卻明顯縮短, 即低pH的精子激活后雖然在短期內活力較高但持久性較差。實驗過程中還發現采集精液時尿液摻入會顯著降低pH和精子活力甚至殺死精子, 因此生產中采集精液時應避免尿液的摻入。

將精子運動時間和活化率綜合考慮能更好地反映精子的運動能力。實驗發現, 隨著激活后時間的推移, 精子活化率明顯下降, 4家公司精液質量的差異可能是由于飼養條件不同所導致的。值得一提的是, 作者發現同一地點2次取樣精子質量差異較大, 第二次明顯好于第一次, 兩次取樣時間分別是大菱鲆產精初期和中期, 間隔1個月左右, 說明大菱鲆繁殖期中期精液質量高于初期, 這與韓明明等[18]研究結果相一致。

通過作者的研究發現, 甘油的加入延長了精子激活后的運動時間, 最適濃度為100 mmol/L, 濃度過低或過高都會降低精子壽命。在精子活力維持方面, 已知糖類(如葡萄糖、果糖)等外源物質能夠促進精子的活力[7-8], Gardiner[19]認為, 體外受精魚類精子具有三羧酸循環代謝的能力。魚類可以通過氧化作用利用細胞外源性碳水化合物, 尤其是葡萄糖、半乳糖和果糖[20]獲得能量。而精子細胞內的甘油氧化分解產生的中間產物能夠參與糖酵解過程, 提供能量, 促進精子活力的維持[9-11]。因此, 推測外源甘油能夠在大菱鲆精子激活時迅速進入精子細胞并被精子細胞氧化分解, 提供能量, 從而延長精子激活后的運動時間。

4 結論

實驗檢測了采自4個養殖場共5批大菱鲆精子8個運動特征參數, 其中平均曲線運動速度、平均直線運動速度、平均路徑速度、精子頭側擺幅度、精子平均鞭打頻率與精液pH或活化率成正相關關系, 運動的直線性、運動的前向性、運動的擺動性與精液pH或活化率相關性不顯著。

實驗發現活化率高、精子壽命長的大菱鲆精液pH偏弱堿性, 即大菱鲆精子適宜在弱堿性環境中活動。某些低pH的精子激活后雖然在短期內活力較高但持久性較差。尿液會顯著降低精液的pH和精子活力, 甚至殺死精子。大菱鲆繁殖期中期精液質量高于初期。

甘油的加入延長了精子激活后的運動時間, 最適濃度為100 mmol/L。作者推測外源甘油能夠在大菱鲆精子激活時迅速進入精子細胞并被氧化分解, 提供能量, 從而延長精子激活后的運動時間。

[1] Alavi S M, Cosson J. Sperm motility in fishes. I. Effects oftemperature andpH:areview[J].CellBiologyInternational, 2005, 29(2): 101-110.

[2] Sansone G, Fabbrocini A, Ieropoli S, et al. Effects of extender composition, cooling rate, and freezing on the motility of sea bass (L.) spermatozoa after thawing[J]. Cryobiology, 2002, 44(3): 229-239.

[3] Christ S A, Toth G P, Mccarthy H W, et al. Monthly variation in sperm motility in common carp assessed using computer-assisted sperm analysis (CASA)[J]. Journal of Fish Biology, 1996, 48(6): 1210-1222.

[4] Vladi? T, J?trvi T. Sperm motility and fertilization time span in Atlantic salmon and brown trout—the effect of water temperature[J]. Journal of Fish Biology, 1997, 50(5): 1088-1093.

[5] 季相山, 陳松林, 趙燕, 等.魚類精子質量評價研究進展[J]．中國水產科學, 2007, 14(6): 1048-1054. Ji Xiangshan, Chen Songlin, Zhao Yan, et al. Review of assessing sperm quality in fish[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2007, 14(6): 1048-1054.

[6] Boyer S P, Davis R O, Katz D F. Automated semen analysis-current problems in obstetrics[J]. Gynecol Fertil, 1989, 12: 165-200.

[7] 張利.豬精子在液態保存過程中葡萄糖代謝的研究[D]. 哈爾濱: 東北農業大學, 2014.Zhang Li. Investigation of sperm glucose metabolism during liquid storage pig semen[D]. Haerbin: Northeast Agricultural University, 2014.

[8] 王學穎, 徐世宏, 劉清華, 等.滲透壓、pH、葡萄糖及離子溶液對夏牙鲆精子激活及運動特征的影響[J].海洋科學, 2016, 40(3): 40-46.Wang Xueying, Xu Shihong, Liu Qinghua, et al. The effects of osmolality, pH, glucose and ions solutions on sperm motility of summer flounder ()[J]. Marine Sciences, 2016, 40(3): 40-46.

[9] Mann T, White I G. Metabolism of glycerol, sorbitol and related compounds by spermatozoa[J]. Nature, 1956, 178(4525): 142-143.

[10] White I G. Metabolism of glycerol and similar compounds by bull spermatozoa[J]. Amer Physio, 1957, 189: 307-310.

[11] Jones A R, Chantrill L A, Cokinakis A. Metabolism of glycerol by mature boar spermatozoa[J]. Journal of Reproduction and Fertility, 1992, 94(1): 129-134.

[12] 劉清華, 李軍, 丁福紅, 等.運用計算機輔助分析檢測超低溫保存的真鯛()精子的質量[J]. 自然科學進展, 2006, 9: 1181-1185.Liu Qinghua, Li Jun, Ding Fuhong, et al. The analysis of cryopreserved sperm quality ofby CASA[J]. Progress in Natural Science, 2006, 9: 1181-1185.

[13] 鄧岳松, 林浩然.魚類精子活力研究進展[J].生命科學研究, 1999, 4: 271-278.Deng Yuesong, Lin Haoran. Advance in fishes sperm motility[J]. Life Science Research, 1999, 4: 271-278.

[14] 唐天德, 許興基, 李文杰, 等.幾個環境因子對梭魚精子活力影響的初步研究[J]. 熱帶海洋, 1985, 4(2): 91-97.Tang Tiande, Xu Xingji, Li Wenjie, et al. A preliminary study on some environmental factors influencing the vitality of mullet () spermatozoa[J]. Tropic Oceanology, 1985, 4(2): 91-97.

[15] 趙振山, 曹克駒, 楊立軍.烏鱧精子生理生態特性的研究Ⅰ不同pH溶液對精子活力的影響[J]. 水利漁業, 1995, 3 : 11-12.Zhao Zhenshan, Cao Keju, Yang Lijun.A study on physiological and ecological characteristics of snakehead spermⅠthe influence of solution with different pH on sperm motility[J]. Reservoir Fisheries, 1995, 3: 11-12.

[16] 魏平, 葉霆, 吳向丹, 等. 環境因子對眼斑擬石首魚精子活力的影響[J]. 生態科學, 2009, 5: 438-442.Wei Ping, Ye Ting, Wu Xiangdan, et al. Effect of environment factors on the vitality of sperm in[J]. Ecological Science, 2009, 5: 438-442.

[17] 王小剛.點帶石斑魚精子種質保存研究[D].海口: 海南大學, 2010.Wang Xiaogang. The germplasm preseervation of spermatozoa from Epinephelus[D]. Haikou: Hainan University, 2010.

[18] 韓明明, 丁福紅, 孟振, 等.大菱鲆不同繁殖期的精子質量分析[J]. 漁業科學進展, 2013, 34(5): 31-35.Han Mingming, Ding Fuhong, Meng Zhen, et al. The analysis of turbotsemen quality during spawning season[J]. Progress in Fishery Sciences, 2013, 34(5): 31-35.

[19] Gardiner D M. Utilization of extracellular glucose by spermatozoa of two viviparous fishes[J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part A Physiology, 1978, 59(2): 165-168.

[20] Gregory R W. Occurrence of fructose in trout seminal plasma[J]. Transactions of the American Fisheries Society, 1968, 97(2): 203-204.

Analysis of turbot () sperm motion characteristics and relationship with pH

AN Hao1, 2, 3, XU Shi-hong1, 3, FENG Cheng-cheng1, 2, 3, WANG Yan-feng1, 3, LIU Qing-hua1, 3, LI Jun1, 3

(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266237, China)

This study investigated the relationship between semen quality and pH of turbot () and the impact of glycerin on turbot sperm activation using turbot sperm from different hatcheries (A, B, C, and D) through the computer-assisted sperm analysis (CASA) system. The results showed that sperm motility rates were different in the four hatcheries, A2> A1> D > C > B. The predicted sperm longevity times were 11.7, 7.1, 6.8, 4.6, and 3.3 min, respectively.

The motility rates of turbot sperm significantly positively correlated with VCL, VSL, VAP, ALH, and BCF (< 0.05), but no significant correlation was observed with LIN, WOB, and STR. We found that the pH of turbot sperm significantly positively correlated with motility, VCL, VSL, VAP, ALH, and BCF(< 0.05), whereas no significant correlation was found with LIN, WOB, and STR. In addition, high-quality sperm exhibited a weak alkalinity with a pH of 8.0.

We also found that an appropriate concentration of glycerol (100 mmol/L) in sea water was useful for maintaining the longevity.

; sperm; motion characteristics; pH

(本文編輯: 譚雪靜)

Q256

A

1000-3096(2017)07-0037-07

10.11759//hykx20170119006

2017-01-19;

2017-03-22

國家自然科學基金資助項目(31472264, 31572602); 鰲山科技創新計劃項目 (2015ASKJ02, 2015ASKJ02-03-03); 現代農業產業技術體系項目(CARS-47)

[National Natural Science Foundation of China, No.31472264, 31572602; the Scientific and Technological Innovation Project , No.2015ASKJ02, 2015ASKJ02-03-03; Modern Agro-industry Technology Research System, No.CARS-47]

安皓(1992-), 男, 山東日照人, 碩士研究生, 主要從事魚類生理學研究, E-mail: anhao14@mails.ucas.ac.cn; 李軍, 通信作者, 研究員, E-mail: junli@qdio.ac.cn; 劉清華, 通信作者, 副研究員, E-mail: qinghualiu@qdio.ac.cn

Jan. 19, 2017