五味子甲素通過ATP結合盒轉運子B1逆轉膠質瘤干/祖細胞耐藥性研究

魏子龍 狄沖 樓美清 趙耀東

·基礎研究·

五味子甲素通過ATP結合盒轉運子B1逆轉膠質瘤干/祖細胞耐藥性研究

魏子龍 狄沖 樓美清 趙耀東

目的探討五味子甲素對膠質瘤干/祖細胞耐藥性的影響及作用機制。方法自人膠質瘤細胞系SHG?44中分離培養膠質瘤干/祖細胞SHG?44s，予五味子甲素0、12.50、25.00和50.00 μmol/L 聯合長春新堿400、800和1200 nmol/L，細胞活性檢測試劑盒CCK?8細胞毒性實驗檢測SHG?44s細胞增殖活性，羅丹明123染色檢測SHG?44s細胞泵出藥物能力，實時聚合酶鏈反應（PCR）和Western blotting法檢測SHG?44s細胞ATP結合盒轉運子B1（ABCB1）基因轉錄和翻譯能力。結果五味子甲素50 μmol/L即可抑制SHG?44s細胞增殖活性（P=0.001，0.001，0.039），剔除這一濃度后無論長春新堿濃度為400、800或1200 nmol/L，聯合應用五味子甲素均可抑制SHG?44s細胞增殖活性（長春新堿400 nmol/L組：P=0.007，0.001；長春新堿800 nmol/L組：P=0.001，0.000；長春新堿1200 nmol/L組：P=0.000，0.000）。倒置熒光顯微鏡觀察，五味子甲素12.50 μmol/L組和25.00 μmol/L組SHG?44s細胞可見明顯綠色熒光。流式細胞術顯示，隨著五味子甲素濃度的增加，SHG?44s細胞羅丹明123染色陽性細胞比例分別為10.40%、39.20%和45.20%。實時PCR法顯示，五味子甲素12.50 μmol/L組和25.00 μmol/L組SHG?44s細胞ABCB1基因表達水平較 0 μmol/L組降低（P=0.027，0.006），尤以 25.00 μmol/L組顯著（P=0.034）。Western blotting法顯示，隨著五味子甲素濃度的增加，SHG?44s細胞P?糖蛋白表達水平下降。結論五味子甲素通過抑制膠質瘤干/祖細胞表面已存在的ABCB1基因編碼的P?糖蛋白泵出藥物能力并降低ABCB1基因轉錄和翻譯能力，逆轉膠質瘤干/祖細胞耐藥性。

五味子素； ATP結合匣式轉運子； 神經膠質瘤； 腫瘤干細胞； 藥物耐受性； 顯微鏡檢查，熒光； 流式細胞術； 聚合酶鏈反應； 免疫印跡法； 腫瘤細胞，培養的

膠質瘤是臨床最常見的原發性中樞神經系統腫瘤（約占50%），患者預后較差。盡管隨著現代醫學的發展，膠質瘤診斷與治療技術有較大提高，但近20年患者預后并未獲得顯著改善，成為困擾臨床醫師的難題。近年來，癌癥干細胞（CSCs）假說的提出和膠質瘤干/祖細胞（GSPCs）的發現，為膠質瘤的治療提供新的切入點［1］。研究證實癌癥干細胞在腫瘤發生、發展、轉移和復發中發揮關鍵作用［2］。五味子甲素是從五味子果實中分離出來的具有生物活性的木脂素。國內多項研究顯示，五味子粗提取物及其有效成分五味子甲素具有逆轉腫瘤細胞［3］特別是結腸癌細胞［4］和乳腺癌細胞［5］耐藥性的作用。但是對于五味子甲素能否逆轉癌癥干細胞特別是膠質瘤干/祖細胞耐藥性及其作用機制尚不清楚。本研究以膠質瘤干/祖細胞系SHG?44s為研究對象，采用細胞活性檢測試劑盒（CCK?8）細胞毒性實驗、羅丹明123（Rhodamine 123）熒光染色、實時聚合酶鏈反 應（real time?PCR）和 免 疫 印 跡 法（Western blotting），探討五味子甲素對膠質瘤干/祖細胞耐藥性的影響及其作用機制。

材料與方法

一、實驗材料

1.細胞系來源 人膠質瘤細胞系SHG?44購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，來源于1例32歲女性額葉星形細胞瘤（WHOⅡ～Ⅲ級）患者，經分離、體外培養、鑒定和擴增，傳代129代。

2.試劑與儀器 （1）主要試劑：五味子甲素和長春新堿購自上海源葉生物科技有限公司。羅丹明123（20 μg/ml）由上海碧云天生物技術有限公司提供。DMEM/F12無血清培養基（體積比1∶1）、B27培養基添加劑和堿性纖維母細胞生長因子（bFGF，20 ng/ml）均購自美國Gibco公司。表皮生長因子（EGF，20 ng/ml）由美國Invitrogen公司提供。免疫試劑Ⅰ抗工作液中兔抗人CD133單克隆抗體購自美國Bioworld公司，小鼠抗人巢蛋白（Nes）單克隆抗體、兔抗人ATP結合盒轉運子B1（ABCB1）單克隆抗體和小鼠抗人β?肌動蛋白（β?actin）單克隆抗體均購自美國Abcam公司；工作濃度均為1∶1000。山羊抗兔熒光Ⅱ抗和山羊抗小鼠熒光Ⅱ抗購自美國Abcam公司，3H?吲哚菁染料Cy3標記的山羊抗兔IgGⅡ抗購自美國BD Biosciences公司，異硫氰酸熒光素（FITC）標記的山羊抗小鼠IgGⅡ抗購自美國Miltenyi Biotec公司，工作濃度均為1∶2500。二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒為北京中杉金橋生物技術有限公司產品。CCK?8試劑盒由日本Dojindo化學研究所提供。（2）主要儀器：TCS SP2激光掃描共聚焦顯微鏡為德國Leica公司產品。XDS?220C型倒置相差顯微鏡購自上海蔡康光學儀器有限公司。Nikon ECLIPSE TE2000?U型倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司。多功能酶標儀由美國BioTek公司提供。FCASCalibur流式細胞儀為美國BD公司產品。Odyssey紅外雙色激光成像系統由美國LI?COR公司提供。

二、實驗方法

1.膠質瘤干/祖細胞分離與培養 將SHG?44細胞置于37℃、含5%二氧化碳的飽和濕度培養箱中培養，培養基為含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養基，細胞生長至覆蓋培養瓶底部表面大部分（＞80%）時，胰蛋白酶消化后傳代培養。參照文獻［6］方法，將SHG?44細胞置于干細胞培養基［含DMEM/F12無血清培養基（體積比1∶1）、B27培養基添加劑（體積比1∶50）、20 ng/ml堿性纖維母細胞生長因子和20 ng/ml表皮生長因子］中培養，以CD133免疫磁珠分離克隆出膠質瘤干/祖細胞SHG?44s，并經免疫組織化學檢測鑒定。將SHG?44s細胞置于37℃、含5%二氧化碳的飽和濕度培養箱中培養，培養基為干細胞培養基。每3天半量換液1次，7～10 d傳代1次，于倒置相差顯微鏡下觀察SHG?44s細胞形態，傳代33代。

2.CCK?8細胞毒性實驗檢測SHG?44s細胞增殖活性 當干細胞培養基中SHG?44s細胞球生長至約100個細胞時（通常4～5 d），以離心半徑5.50 cm、1000 r/min離心5 min，棄上清，培養基重懸細胞，吸管反復吹打，制備單細胞懸液。分別予不同濃度五味子甲素（0、12.50、25.00和50.00 μmol/L共4組），以細胞密度為2×103/100 μl接種于96孔培養板，每組3孔。培養72 h后每孔加入10 μl CCK?8試劑，37℃恒溫3 h，于450 nm波長處測定光密度值（OD值）。然后將不同濃度五味子甲素組（0、12.50和25.00 μmol/L共3組）進一步分為3個亞組，每亞組各1孔，分別予以不同濃度長春新堿（400、800和1200 nmol/L），共培養72 h，于450 nm波長處測定OD值，代表腫瘤細胞增殖活性。每孔重復3次，取平均值。

3.羅丹明123熒光染色檢測SHG?44s細胞泵出藥物能力 將處于對數生長期的SHG?44s細胞制備成100×103/ml的細胞懸液，以細胞密度為200×103/2 ml接種于6孔板，分別予以不同濃度五味子甲素（0、12.50和 25.00 μmol/L），培養 48 h，以離心半徑5.50 cm、2000 r/min離心5 min，棄上清液，收集沉淀細胞，吸管反復吹打，制備單細胞懸液。以4℃預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌（×3次），加入40 μg羅丹明123，于37℃孵育30 min，磷酸鹽緩沖液洗滌（×2次），流式細胞儀（激發波長488 nm、發射波長525 nm）計數SHG?44s細胞中熒光染色陽性細胞比例，倒置熒光顯微鏡觀察SHG?44s細胞熒光強度。重復實驗3次，取平均值。

4.實時聚合酶鏈反應檢測ABCB1基因表達變化 將處于對數生長期的SHG?44s細胞提取RNA，逆轉錄合成cDNA，進行聚合酶鏈反應（PCR），ABCB1基 因 上 游 引 物（P1）序 列 ：5'?AAGGCCTAATGCCGAACACA?3'、下游引物（P2）序列：5'?GTCTGGCCCTTCTTCACCTC?3'，內參照物甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）上游引物序列：5'?ACGGATTTGGTCGTATTGGG?3'、下游引物序列：5'?CGCTCCTGGAAGATGGTGAT?3'。PCR 擴增條件：95℃ 10 min；SYBR GreenⅠ熒光染色反應95℃15 s，60℃ 1 min，共40個循環；溶解曲線分析反應95℃ 15 s，60℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，37 ℃15 min，85℃ 5 s。繪制實時PCR擴增和溶解曲線，計算目的基因相對表達量2-△△Ct，代表ABCB1基因表達水平。重復實驗3次，取平均值。

5.Western blotting法檢測P?糖蛋白表達變化

將處于對數生長期的SHG?44s細胞制備成100×103/ml的細胞懸液，以細胞密度為200×103/2 ml接種于6孔板，分別予不同濃度五味子甲素（0、12.50和 25.00 μmol/L），培養 48 h，以離心半徑 5.50 cm、2000 r/min離心5 min，棄上清液，收集沉淀細胞，向細胞沉淀中加預冷的含蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）的細胞裂解液RIPA，0℃冰浴5～10 min，冰上超聲2 min，以12 000×g離心10 min，收集上清液，即為P?糖蛋白（P?gp）。目標蛋白行十二烷基磺酸鈉?聚苯稀酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE），濕轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，以質量分數為5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，滴加兔抗人ABCB1單克隆抗體（1∶1000）1 ml，4℃孵育過夜，TBST洗膜（×3次），滴加山羊抗兔 IgGⅡ抗（1∶2500）2 ml，孵育 1 h，TBST洗膜（×3次），電化學發光（ECL）顯色，Odyssey紅外雙色激光成像系統檢測目標蛋白電泳條帶。重復實驗3次，取平均值。

6.統計分析方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據處理與分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較行SNK?q檢驗。以P≤0.05為差異具有統計學意義。

表1 不同濃度五味子甲素組SHG?44s細胞增殖活性的比較（x± s，OD450nm）Table 1. Comparison of proliferative activity of SHG?44s cells among different concentrations of schizandrin A(x±s,OD450nm)

表2 不同濃度五味子甲素組SHG?44s細胞增殖活性的兩兩比較Table 2. Paired comparison of proliferative activity of SHG ?44s cells among different concentrations of schizandrin A

表3 不同濃度五味子甲素聯合長春新堿亞組SHG?44s細胞增殖活性的比較（x±s，OD450nm）Table 3. Comparison of proliferative activity of SHG?44s cells among different concentrations of schizandrin A and vincristine(x±s,OD450nm)

表4 不同濃度五味子甲素聯合長春新堿亞組SHG?44s細胞增殖活性的兩兩比較Table 4. Paired comparison of proliferative activity of SHG?44s cells among different concentrations of schizandrin A combining with vincristine

結 果

一、膠質瘤干/祖細胞增殖活性

以含不同濃度五味子甲素的干細胞培養基培養SHG?44s細胞，結果顯示，五味子甲素50 μmol/L即可抑制SHG?44s細胞增殖活性（P=0.001，0.001，0.039；表1，2）。因此，后續的研究剔除五味子甲素50 μmol/L組，以排除自身毒性作用。將不同濃度五味子甲素（0、12.50和 25.00 μ mol/L）和長春新堿（400、800和 1200 nmol/L）共同作用于 SHG?44s細胞，結果顯示，無論長春新堿濃度為400、800或1200 nmol/L，聯合五味子甲素均可以抑制SHG?44s細胞增殖活性（長春新堿400 nmol/L組：P=0.007，0.001；長春新堿 800 nmol/L 組：P=0.001，0.000；長春新堿1200 nmol/L組：P=0.000，0.000；表3，4）。

二、膠質瘤干/祖細胞泵出藥物能力

羅丹明123是一種能夠穿透細胞膜并在細胞內蓄積的熒光染料，其熒光強度可以反映腫瘤細胞經藥泵蛋白泵出藥物能力。倒置熒光顯微鏡觀察顯示，五味子甲素0 μmol/L組SHG?44s細胞罕見綠色熒光，五味子甲素12.50 μmol/L組和25.00 μmol/L組SHG?44s細胞可見明顯綠色熒光（圖1a～1c）。流式細胞術顯示，五味子甲素 0 μmol/L 組、12.50 μmol/L組和25.00 μmol/L組SHG?44s細胞羅丹明 123染色陽性細胞比例逐漸增加，分別為10.40%、39.20%和45.20%（圖2a～2c）。

三、膠質瘤干/祖細胞ABCB1基因轉錄和翻譯能力

實時PCR法顯示，與五味子甲素0 μmol/L組相比，五味子甲素 12.50 μmol/L 組和 25.00 μmol/L 組SHG?44s細胞ABCB1基因表達水平降低（P=0.027，0.006），尤以五味子甲素 25.00 μmol/L組顯著（P=0.034），表明隨著五味子甲素濃度的增加，對ABCB1基因的抑制作用逐漸增強（表5，6）。Western blotting法顯示，隨著五味子甲素濃度的增加（0、12.50和 25.00 μmol/L），SHG?44s細胞 P?糖蛋白表達水平逐漸降低（圖3）。

圖1 倒置熒光顯微鏡觀察所見 羅丹明123染色 ×100 1a 五味子甲素0 μmol/L組SHG?44s細胞罕見綠色熒光 1b 五味子甲素12.50 μmol/L組SHG?44s細胞可見綠色熒光 1c 五味子甲素25.00 μmol/L組SHG?44s細胞可見明顯綠色熒光Figure 1 Inverted fluorescence microscopy findings Rhodamine 123 staining ×100 SHG?44s cells rarely showed green fluorescence in schizandrin A 0 μ mol/L group (Panel 1a). SHG ?44s cells showed green fluorescence in schizandrin A 12.50 μ mol/L group(Panel 1b).SHG?44s cells showed obvious green fluorescence in schizandrin A 25.00 μmol/L group(Panel 1c).

討 論

膠質瘤是臨床常見的原發性中樞神經系統腫瘤，約占中樞神經系統腫瘤的50%，預后較差。隨著癌癥干細胞理論的提出和研究的深入，目前認為癌癥干細胞是惡性腫瘤復發的根源，其中重要特征是放射治療耐受性和多藥耐藥性（MDR）［2］。多藥耐藥性系指細胞對作用不同的藥物具有抗藥性現象。導致癌癥干細胞多藥耐藥性的原因有多種，除因其常處于G0期外，還與ATP結合盒（ABC）轉運蛋白高表達以及凋亡和自噬減弱等機制有關［7?10］。ABC轉運蛋白是跨膜蛋白，是介導多藥耐藥性家族的重要一員，通過ATP釋放的能量將藥物轉運至細胞外，避免細胞毒性作用［11］。目前與多藥耐藥性有關的ABC轉運蛋白主要包括乳腺癌耐藥蛋白（BCRP/ABCG2）、多藥耐藥相關蛋白（MRP）和 P?糖蛋白，是腫瘤多藥耐藥性中最關鍵的途徑［12?13］，其中，ABCB1蛋白介導的多藥耐藥性機制最為重要。ABCB1蛋白作為藥物泵，可以將多種藥物泵出細胞外，使細胞內藥物蓄積減少，減輕細胞毒性作用，從而產生多藥耐藥性［14］。

國內多項研究顯示，五味子粗提取物及其有效成分五味子甲素具有逆轉耐藥性的作用［3?4］，但是對于五味子甲素能否逆轉腫瘤干/祖細胞（TSPCs）尤其是膠質瘤干/祖細胞耐藥性及其作用機制尚不清楚。本研究結果顯示，低濃度五味子甲素（0、12.50和25.00 μmol/L）對SHG?44s細胞未產生明顯的增殖抑制作用，當五味子甲素達50 μmol/L時方表現出增殖抑制作用，因此本研究采用低濃度五味子甲素（0、12.50和25.00 μmol/L）進行實驗。CCK?8細胞毒性實驗顯示，SHG?44s細胞在五味子甲素和長春新堿聯合作用下較單純長春新堿增殖活性明顯下降，表明五味子甲素可以部分逆轉SHG?44s細胞對化療藥物的耐藥性。

多數細胞可以蓄積熒光染料，如Hoechst 33342和羅丹明123。ABC轉運蛋白如ABCG2和ABCB1蛋白可以通過泵出藥物作用，將二者像化療藥物一樣泵出細胞外而使細胞不著色，與普通細胞分離。這些不著色的腫瘤細胞稱為側群細胞（SP細胞），研究證實多種腫瘤細胞中均存在側群細胞［15］。本研究對不同濃度五味子甲素組SHG?44s細胞進行羅丹明123染色，倒置熒光顯微鏡觀察和流式細胞術顯示，隨著五味子甲素濃度的增加，SHG?44s細胞熒光強度增加、熒光染色陽性細胞比例增加，表明五味子甲素可以抑制ABCB1蛋白泵出藥物能力。

圖2 流式細胞術所見 2a 五味子甲素0 μmol/L組SHG?44s細胞羅丹明123染色陽性細胞比例為10.40% 2b 五味子甲素12.50 μmol/L組SHG?44s細胞羅丹明123染色陽性細胞比例為39.20% 2c 五味子甲素25.00 μmol/L組SHG?44s細胞羅丹明123染色陽性細胞比例為45.20%Figure 2 Flow cytometry findings The percentage of positive SHG?44s cells by Rhodamine 123 staining was 10.40% in schizandrin A 0 μ mol/L group(Panel 2a). The percentage of positive SHG?44s cells by Rhodamine 123 staining was 39.20%in schizandrin A 12.50 μmol/L group(Panel 2b).The percentage of positive SHG?44s cells by Rhodamine 123 staining was 45.20%in schizandrin A 25.00 μmol/L group(Panel 2c).

圖3 Western blotting法顯示，隨著五味子甲素濃度的增加（0、12.50和 25.00 μmol/L），SHG?44s細胞 P?糖蛋白表達水平逐漸降低Figure 3 Western blotting showed that the expression of P?gp in SHG?44s cells was gradually decreased with the increasing of schizandrin A concentration(0,12.50 and 25.00 μmol/L).

表5 不同濃度五味子甲素組SHG?44s細胞ABCB1基因表達水平的比較（x±s）Table 5. Comparison of ABCB1 expression in SHG?44s cells among different concentrations of schizandrin A(x±s)

表6 不同濃度五味子甲素組SHG?44s細胞ABCB1基因表達水平的兩兩比較Table 6. Paired comparison of ABCB1 gene expression in SHG?44s cells among different concentrations of schizandrin A

本研究采用實時PCR和Western blotting法對ABCB1基因及其編碼的P?糖蛋白表達變化進行檢測，結果顯示，予五味子甲素后SHG?44s細胞ABCB1基因轉錄和翻譯能力均下降。研究顯示，尼卡地平作為多藥耐藥基因ABCG2的作用底物具有逆轉其功能的作用［13，16］。五味子甲素通過抑制膠質瘤干/祖細胞表面已存在的ABCB1基因編碼的P?糖蛋白泵出藥物能力并降低ABCB1基因轉錄和翻譯能力，從而發揮逆轉膠質瘤干/祖細胞耐藥性的作用。尼卡地平與五味子甲素聯合作用是否能夠進一步提高膠質瘤療效尚待進一步研究。

綜上所述，五味子甲素可以抑制膠質瘤干/祖細胞表面已存在的ABCB1基因編碼的P?糖蛋白泵出藥物能力，還可以通過降低ABCB1基因轉錄和翻譯能力，進一步逆轉膠質瘤干/祖細胞的耐藥性。

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Study on schizandrin A reversing drug resistance of glioma stem/progenitor cells by ATP binding cassette subfamily B member 1

WEI Zi?long1,DI Chong2,LOU Mei?qing3,ZHAO Yao?dong3
1Department of Neurosurgery,Shanghai Pudong Hospital,Shanghai 201399,China
2Department of Intensive Care Unit,the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University,Xuzhou 221002,Jiangsu,China
3Department of Neurosurgery,Shanghai General Hospital,Shanghai 200080,China
Corresponding author:ZHAO Yao?dong(Email:zhaoyd@aliyun.com)

ObjectiveTo investigate the effect of schizandrin A on drug resistance of glioma stem/progenitor cells(GSPCs)and its mechanism.MethodsIsolate and culture SHG?44s cells from human glioma cell line SHG?44.The SHG?44s cells were treated with different concentrations of schizandrin A(0,12.50,25.00 and 50.00 μmol/L)and vincristine(400,800 and 1200 nmol/L).The cell proliferative activity was measured by cell counting kit?8(CCK?8)assay.Rhodamine 123 staining was used to detect the drug delivery ability of SHG?44s cells. The transcription and translation ability of ATP binding cassette subfamily B member 1(ABCB1)gene of SHG?44s cells was detected by real?time polymerase chain reaction(PCR)and Western blotting.ResultsThe proliferative activity of SHG?44s cells was inhibited when the concentration of schizandrin A was 50 μmol/L(P=0.001,0.001,0.039),so this concentration was removed in the follow?up study.No matter the concentration of vincristine was 400,800 or 1200 nmol/L,combining with schizandrin A could inhibit the proliferative activity of SHG?44s cells(vincristine 400 nmol/L:P=0.007,0.001;vincristine 800 nmol/L:P=0.001,0.000;vincristine 1200 nmol/L:P=0.000,0.000).Inverted fluorescence microscopy findings showed SHG ?44s cells in the group of schizandrin A 0 μ mol/L rarely revealed green fluorescence,while SHG ?44s cells in the groups of schizandrin A 12.50 and 25.00 μ mol/L presented obvious green fluorescence.Flow cytometry showed that with the increasing of schizandrin A concentration,the percentage of positive cells by Rhodamine 123 staining was 10.40%,39.20% and 45.20%,respectively.Real?time PCR showed thatABCB1gene expression levels of SHG?44s cells in schizandrin A 12.50 μ mol/L group and 25.00 μ mol/L group were significantly decreased comparing with schizandrin A 0 μ mol/L group(P=0.027,0.006),especially in schizandrin A 25.00 μ mol/L group(P=0.034).Western blotting showed that the expression level of P?glycoprotein(P?gp)in SHG?44s cells was gradually decreased with the increasing of schizandrin A concentration.ConclusionsSchizandrin A can inhibit the drug delivery ability of P?gp coded byABCB1gene existing in the surface of GSPCs.It can further reverse the drug resistance of GSPCs by reducing the transcription and translation ofABCB1gene.

Schizandrin; ATP ?binding cassette transporters; Glioma; Neoplastic stem cells;Drug tolerance; Microscopy, fluorescence; Flow cytometry; Polymerase chain reaction;Immunoblotting; Tumor cells,cultured

10.3969/j.issn.1672?6731.2017.06.009

上海市衛生和計劃生育委員會科研課題（項目編號：201540412）；上海市浦東醫院基金資助項目（項目編號：201313）；上海市浦東醫院2012年度優秀人才“南菁獎”項目

201399上海市浦東醫院神經外科（魏子龍）；221002徐州醫科大學附屬醫院重癥醫學科（狄沖）；200080上海市第一人民醫院神經外科（樓美清，趙耀東）

趙耀東（Email：zhaoyd@aliyun.com）

This study was supported by Scientific Research Project of Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning(No.201540412),Funded Project of Shanghai Pudong Hospital(No.201313)and Personnel Training Program"Nanjing Award 2012"of Shanghai Pudong Hospital.

2017?05?08）