利用FACS定量研究脂肪組織中肥大細胞的數目

張 磊, 劉 健

(合肥工業大學 生物與醫學工程學院,安徽 合肥 230009)

利用FACS定量研究脂肪組織中肥大細胞的數目

張 磊, 劉 健

(合肥工業大學 生物與醫學工程學院,安徽 合肥 230009)

肥胖會導致脂肪組織中各種免疫細胞數量的失衡,肥大細胞(MCs)在肥胖個體的脂肪組織中數量明顯增多,而MCs穩定劑木犀草素(LU)可以降低高脂飲食小鼠附睪脂肪組織(EAT)中MCs的數量,并改善肥胖和胰島素抵抗的發展。此前的研究是利用甲苯胺藍染色半定量EAT中MCs數量的變化。甲苯胺藍染色的特異性和統計精密度都存在一定的欠缺,為了更精確地研究在肥胖過程中脂肪組織中MCs數量的變化,文章建立了高精密度的流式細胞熒光分選(fluorescence activated cell sorting,FACS)技術,并研究了低脂、高脂和高脂補充LU組小鼠EAT中MCs變化情況。FACS分析定量結果顯示,MCs在高脂飲食誘導下明顯升高,而飲食補充LU可以明顯降低MCs的數目。另外,EAT中MC蛋白酶的定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)結果也支持了FACS分析的結果。因此,利用FACS分析脂肪組織中MCs數目的精確變化,為進一步研究MCs在肥胖中的作用機制提供技術支持。

木犀草素(LU);肥大細胞(MCs);肥胖;流式細胞術;附睪脂肪組織

肥胖是一種慢性低度的炎性疾病。脂肪組織尤其是內臟脂肪組織中各種免疫細胞的失衡,分泌大量的促炎性細胞因子,引發一系列相關的代謝綜合癥[1-2]。肥大細胞(MCs)在過敏和炎性疾病中起重要的角色,廣泛分布于皮膚及內臟黏膜下的微血管周圍,受到過敏原的刺激后會快速發生脫顆粒釋放介質介導過敏反應。MCs還參與了肥胖及其相關的代謝疾病的調控。MCs在肥胖個體的脂肪組織中大量聚集[3-5]。藥物穩定或基因缺失MCs可以有效地抵抗小鼠高脂飲食誘導肥胖及其相關的胰島素抵抗的發生[4]。木犀草素(LU)是一種高效的天然黃酮類MCs穩定劑[6],廣泛分布于各種食用性植物和藥用植物中[7]。LU不僅可以抑制IgE介導的MCs產生的參與過敏反應遞質釋放[8],而且可以顯著性降低脂肪細胞分化[9]和高脂飲食誘導的小鼠體重和脂肪組織重量的增加[10]。

研究發現LU能夠降低高脂飲食誘導的小鼠附睪脂肪組織(EAT)中MCs的聚集,但檢測方法是半定量的甲苯胺藍組織化學染色,精確度上存在一定的缺陷,并且只能分析組織局部情況,不能很好反映整體組織中MCs數量的變化。流式細胞熒光分選(fluorescence activated cell sorting,FACS)技術是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段,具有速度快、精度高、準確性好等優點。因此本文利用該技術,以LU可以降低高脂飲食小鼠EAT中MCs的聚集為模型來定量分析MCs數量的變化,為進一步研究MCs在肥胖中的作用機制提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

C57BL/6雄性4周齡SPF級小鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司;LU(>98%HPLC,上海華壹生物科技有限公司);Mac2抗體(BioLegend); PE anti-mouse CD45、APC anti-mouse CD117和PE-Cy7 anti-mouse Fc.εR1購于eBioscience;Trizol 試劑盒(TaKaRa);逆轉錄試劑盒(Invitrogen);SYBR Green MIX(Bio-Rad公司);無水乙醇等常規生化試劑(國藥集團)。

1.2 儀器與設備

流式細胞儀MoFlo XDP(Beckman Coulter);組織脫水機TKY-TSH (亞光);石蠟包埋YB-6LF (亞光);組織切片機RM2235 (德國Leica);IQ5熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 小鼠飼養

小鼠飼養于SPF級恒溫25 ℃動物房,12 h/12 h光暗周期。將5周齡小鼠隨機分為3組(每組8只),即給于低脂飲食(research diets D12450B,10%能量源于脂肪)的正常對照組、給予高脂飲食(research diets D12451,45%能量源于脂肪)的肥胖模型組和給予添加0.01%的LU高脂飲食的處理組。喂養20周后處死收取組織。

1.3.2 甲苯胺藍組織化學染色

EAT固定于4%中性甲醛后常規脫水石蠟包埋、切片及復水;復水后的切片放入蒸餾水中洗5 min;切片放入體積分數為0.5%甲苯胺藍水溶液中,室溫染色 2 h;自來水中洗去表面染液;用體積分數為5%乙酸水溶液中分色1 min;分色后的切片迅速放于蒸餾水洗3次,每次5 min;將切片置于室溫中自然涼干;切片浸入二甲苯中透明3 min透明;中性樹膠封片后放入70 ℃烘箱內烘干;在光學顯微鏡下進行統計MCs數目并拍攝圖片,并計算每平方毫米MCs的數目。

1.3.3 FACS技術

用CO2窒息小鼠后,取EAT并稱重,用剪刀將其剪成細小碎塊,轉移到1.25 mg/mLⅡ型膠原酶溶液中,2.5 mg膠原酶每克組織;37 ℃,80 r/min消化25 min;加入預冷的0.5% BSA的PBS以終止反應,用200目的濾網過濾,過濾下液體轉移到新的離心管中;4 ℃,400 g離心4 min棄上清;用紅細胞裂解液裂解去除紅細胞;利用含0.5% BSA的PBS清洗細胞,4 ℃,400 g離心4 min后定容到50 μL,加入0.25 μL的Fc Block,冰上靜止15 min。加入抗體,PE-CD45 0.15 μL/50 μL、PE-CY7-Fc.εR1 0.25 μL/50 μL、APC-CD117 0.25 μL/50 μL,冰上反應90 min;用0.5% BSA的PBS清洗細胞,4 ℃,400 g離心4 min,棄上清,定容到300 μL后直接上機檢測。

1.3.4 總RNA的提取、反轉錄及定量PCR

EAT的總RNA提取、反轉錄及定量PCR的方法參考文獻[11]。定量PCR引物詳細序列見表1所列。

表1 定量PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 甲苯胺藍組織化學染色結果分析

5周齡小鼠隨機分為3組,分別給予低脂、高脂和高脂補充LU飲食喂養20周。EAT中Mcs的甲苯胺藍組織化學染色結果如圖1、圖2所示。

圖1 EAT中MCs的甲苯胺藍組織化學染色

圖2 EAT中MCs甲苯胺藍染色定量分析

通過對EAT中肥大的甲苯胺藍組織化學染色發現高脂組小鼠EAT中的MCs數量顯著多于低脂組小鼠。另外,相比于高脂組小鼠,高脂+LU組小鼠能明顯降低EAT中的MCs,該結果與之前報道相一致[9]。因此,通過組織化學染色發現飲食補充LU可以抑制高脂飲食誘導MCs在EAT中的聚集。

2.2 FACS分析結果

通過MCs的甲苯胺藍染色及定量結果可知,LU降低高脂飲食小鼠EAT中MCs的實驗模型是成功的。由于甲苯胺藍對MCs染色是非特異的,并且統計精確度不高。為了解決該問題,本文利用更高精密度的FACS來分析EAT中的MCs數目的變化。

首先,用膠原酶將EAT進行消化去除成熟的脂肪細胞以分離出間質細胞,再利用交聯不同熒光素抗小鼠的抗體PE-CD45 、PE-CY7-Fc.εR1 和APC-CD117標記間質細胞中的MCs。先用FACS中的前向和側向去除間質細胞中的細胞碎片,再圈出CD45陽性的細胞,最后圈出CD117和Fc.εR1雙陽性的細胞即為MCs,如圖3所示。

圖3 FACS分析EAT中MCs

通過定量計算得到MCs在間質細胞中所占百分比和每克脂肪組織中MCs的絕對數量，如圖4 所示,結果顯示高脂組小鼠EAT中MCs在間質細胞中所占的比例和絕對數量都明顯提高,而高脂+LU組小鼠明顯反轉高脂飲食誘導的結果。因此,流式結果不僅能顯現出MCs在間質細胞中比例的變化,而且還能定量得出每克組織中所含MCs總數的改變。

通過分析甲苯胺藍染色和FACS分析定量MCs結果的相關性,甲苯胺藍染色定量的每平方毫米組織中MCs的數目與FACS定量的每克脂肪組織中MCs的個數呈正相關。說明FACS能夠很好地定量脂肪組織中MCs的數量,如圖5所示。

Mcp是MCs分泌的重要介質,也是作為MCs的重要標記基因。利用定量PCR檢測了低脂組、高脂組和高脂+LU組小鼠EAT中Mcp4和Mcp6的mRNA表達水平,如圖6所示,相比于低脂組小鼠,高脂組小鼠EAT中Mcp4和Mcp6的表達顯著性升高,然而LU處理可以明顯逆轉MC蛋白酶的升高。這一結果與FACS分析一致,飲食補充LU可以抑制高脂飲食小鼠EAT中MC蛋白酶的升高。因此,FACS技術能夠很好地分析EAT中MCs數量的變化。

圖4 FACS 定量 EAT中MCs的數目

圖5 MCs甲苯染色與FACS定量的相關性

圖6 EAT中MC蛋白酶的表達

3 結 論

MCs在肥胖及其相關的胰島素抵抗的產生中起重要作用,天然黃酮類化合物LU可以有效地抑制MCs的活性,并能夠抵抗高脂飲食誘導的小鼠肥胖和胰島素抵抗的發展。之前報道發現通過甲苯胺藍染色結果顯示LU可以降低高脂飲食小鼠EAT中MCs的聚集。本文基于甲苯胺藍染色存在一定欠缺,以飲食補充LU可以降低高脂飲食小鼠EAT中MCs 數量為模型,利用更高精密度的FACS分析定量EAT中MCs的數目。FACS的結果顯示MCs在高脂飲食誘導下明顯升高,而LU的飲食補充可以明顯降低MCs的數目。因此,FACS分析更能精確反映出EAT中MCs在間質細胞中的比例和每克組織中的總數變化。通過FACS分析脂肪組織中MCs數目,為進一步研究MCs在肥胖中的作用機制提供參考。

[1] HUH J Y,PARK Y J,HAM M,et al.Crosstalk between adipocytes and immune cells in adipose tissue inflammation and metabolic dysregulation in obesity[J].Mol Cells,2014,37(5):365-371.

[2] WRONKOWITZ N,ROMACHO T,SELL H,et al.Adipose tissue dysfunction and inflammation in cardiovascular disease [J].Front Horm Res,2014,43:79-92.

[3] HELLMAN B,LARSSON S,WESTMAN S.Mast cell content and fatty acid metabolism in the epididymal fat pad of obese mice [J].Acta Physiol Scand,1963,58:255-262.

[4] LIU J,DIVOUX A,SUN J,et al.Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice [J].Nat Med,2009,15(8):940-945.

[5] ALTINTAS M M,NAYER B,WALFORD E C,et al.Leptin deficiency-induced obesity affects the density of mast cells in abdominal fat depots and lymph nodes in mice [J].Lipids Health Dis,2012,11:1-10.

[6] SISMANOPOULOS N,DELIVANIS D A,ALYSANDRATIOS K D,et al.Mast cells in allergic and inflammatory diseases [J].Curr Pharm Des,2012,18(16):2261-2277.

[7] LOPEZ-LAZARO M.Distribution and biological activities of the flavonoid luteolin [J].Mini Rev Med Chem,2009,9(1):31-59.

[8] KIMATA M,SHICHIJO M,MIURA T,et al.Effects of luteolin,quercetin and baicalein on immunoglobulin E-mediated mediator release from human cultured mast cells [J].Clin Exp Allergy,2000,30(4):501-508.

[9] 林燕,鮑斌.木犀草素抑制3T3-L1前脂肪細胞的分化[J].合肥工業大學學報(自然科學版),2015,38(2):254-257.

[10] XU N,ZHANG L,DONG J,et al.Low-dose diet supplement of a natural flavonoid,luteolin,ameliorates diet-induced obesity and insulin resistance in mice [J].Mol Nutr Food Res,2014,58(6):1258-1268.

[11] 張磊,鮑斌,劉健.木犀草素通過蛋白激酶C途徑抑制肥胖相關的巨噬細胞極化[J].食品科學,2014,35(13):186-191.

QuantitativestudyofmastcellsinadiposetissueusingFACS

ZHANG Lei, LIU Jian

(School of Biological and Medical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Obesity leads to the imbalance of immune cells in adipose tissue. Mast cells(MCs) significantly increase in adipose tissue of obese individuals. Luteolin(LU), a MCs stabilizer, reduces diet-induced body weight gains and insulin resistance in mice. It was reported that LU decreased the aggregation of MCs in epididymal adipose tissue(EAT) in high fat diet(HFD) -fed mice by toluidine blue staining. Toluidine blue staining is a semi-quantity assay and nonspecific for MCs. In this paper, in order to study MCs in adipose tissue in the obese state more precisely, MCs in EAT from low fat, high fat and high fat supplement LU diets-fed mice were detected by high precision fluorescence activated cell sorting(FACS) of flow cytometry. The results of FACS analysis showed that MCs obviously increased in EAT in HFD group mice and significantly reduced in EAT in LU-fed mice. Moreover, the changes of mRNA levels of MC proteases measured by polymerase chain reaction(PCR) supported the results of FACS analysis. Consequently, FACS analysis for MCs can provide technical support for further study of the function mechanism of MCs in obesity.

luteolin(LU); mast cells(MCs); obesity; flow cytometry; epididymal adipose tissue(EAT)

2016-03-09；

2016-04-15

國家自然科學基金資助項目(31171315)

張 磊(1987-),男,安徽六安人,合肥工業大學博士生; 劉 健(1970-),男,安徽合肥人,博士,合肥工業大學教授,博士生導師.

10.3969/j.issn.1003-5060.2017.10.022

Q291

A

1003-5060(2017)10-1416-04

(責任編輯 閆杏麗)