冷凍電鏡贏得諾獎中國贏得冷凍電鏡

錢煒

2017年的諾貝爾化學獎頒發(fā)給了三位物理學家，他們的科學成就冷凍電鏡

卻成了生物學研究的“神器”。雖然三位諾獎獲得者分別來自瑞士、美國和英國，

但在這一領域，中國與美國比肩，堪稱世界上冷凍電鏡擁有數(shù)量最多、應用水平

最高的國家。但另一方面，對這一昂貴設備競相投入的大手筆，卻難掩中國在

重大基礎性方法研究上的差距

2008年，王宏偉結束了在美國勞倫斯伯克利國家實驗室的工作時，拿到了幾個offer，其中包括母校清華大學的教職。考慮再三后，他選擇了去耶魯大學。那時候，耶魯已經(jīng)有一臺老型號的冷凍電鏡而清華一臺都沒有。不過，這在當時還不是決定性因素，王宏偉說，選擇耶魯，更多還是出于對世界一流名校的向往。

到了2009年底，已在耶魯拿到終身職位的他回國開會，順便到訪清華，才得知清華已經(jīng)購買了當時世界上最新最高端的美國FEI公司生產(chǎn)的300KeV“Titan”型號冷凍電鏡。清華也因此急需熟悉電鏡技術的人才，因為王宏偉是這個領域的專家，時任清華大學生命科學學院院長的施一公再度向他發(fā)出了回國邀請。王宏偉說，“回美國后，我告訴耶魯，如果他們能購買一臺最新的冷凍電鏡，我就留下來。但校方對購買電鏡一事猶豫不決。權衡多方因素，我最終還是回到了母校。”

中科院生物物理研究所的工作人員，辰示利用冷凍電鏡單顆粒三維重構技術解析出的染色質左手雙螺旋高級結構。

王宏偉回來后，清華很快又購買了兩臺Titan型號冷凍電鏡，這樣就有3臺高端冷凍電鏡，再加上中低端設備，共有7臺電鏡。在2013～2015年間，清華大學生科院是世界上最大的冷凍電鏡研究中心。

2016年8月，已經(jīng)是清華生科院院長的王宏偉，與施一公、雷建寧合寫了《冷凍電鏡在中國》一文，發(fā)表在英文學術期刊《蛋白質科學》上。根據(jù)該文，當前，中國的冷凍電鏡正處于快速發(fā)展階段。而今年10月三位科學家因發(fā)明冷凍電鏡而獲得諾貝爾化學獎，讓這一研究領域愈發(fā)炙手可熱。

冷凍電鏡2.0時代

“最近，我第50次收到郵件，咨詢應該如何建一個最新型的冷凍電鏡設施。今天，如果你有機會問一個世界知名大學的校長：‘您的學校生命學科發(fā)展有哪些最需要的設備？冷凍電鏡很可能是居于首位的選擇……與此形成鮮明對比的是，5年前，相當多的大學還在考慮是否應該在本校設立冷凍電鏡這個研究領域;10年前，絕大多數(shù)學校可能還不知道居然有一種電子顯微鏡要用“冷凍”來做定語。”王宏偉發(fā)表在中國生物物理學會官方微信公號上的文章這樣寫道。

如他所說，冷凍電鏡的發(fā)展并非從一開始就勢如破竹。X光晶體學、冷凍電鏡與核磁共振（NMR）是結構生物學的三大研究手段。冷凍電鏡的原理，就像中國武術里的點穴功夫一樣，將正在活動的人一瞬間定住，再用相機拍照。

具體地說，冷凍電鏡就是在傳統(tǒng)的電子顯微鏡之上，加了一個對生物樣品的冷凍環(huán)節(jié)。樣品在液氮中冷凍起來，通過超低溫傳輸系統(tǒng)置于電鏡的冷臺上，用高能量的電子束去照射冷凍樣品成像，并將圖像記錄下來，再在電腦中利用軟件對得到的圖像進行分析處理，最終得到蛋白質結構。

柳振峰、李梅、章新政（由左至右）手拿超級膜蛋白復合體的樣品合影。中科院生物物理所柳振峰研究組、章新政研究組和常文端/李梅研究組聯(lián)合攻關，通過單顆粒冷凍電鏡技術，在國際上首次解析了高等植物（菠菜）的光系統(tǒng)—捕光復合物 超級膜蛋白復合體的三維結構。

冷凍電鏡的概念是在上個世紀70年代就被提出，技術發(fā)展也是從70年代開始的。但由于分辨率遠遜于X光晶體學，一直以來并不是結構生物學的主流研究方法。直到2013年，美國加州大學舊金山分校的程亦凡團隊利用改進后的冷凍電鏡成功解析出TRPV1蛋白結構，局面才有了根本性轉變。

程亦凡在電話接受《中國新聞周刊》采訪時解釋說，他們之所以能取得成功，主要是相機的突破與算法的改進。在相機方面，他們研發(fā)出直接電子探測器與單電子計數(shù)技術。過去，冷凍電鏡用的是傳統(tǒng)CCD相機，要先將電子轉換成光子，再由CCD記錄光子信號，這導致拍照的速度很低，信噪比差，圖像分辨率不高。

程亦凡的同事、美國科學院院士David Agard教授是相機研發(fā)領域的專家，在上世紀90年代初期就參與了第一代CCD相機的研制。在很多年前，Agard就認為，單電子計數(shù)技術是最先進的，一直在做研究。當時，整個業(yè)界大部分的科學家們都不看好這一方向，認為技術上達不到，有人甚至在開會時直接宣稱單電子計數(shù)是不可行的。但Agard力排眾議推進此事，在與勞倫斯伯克利國家實驗室及Gatan公司的合作下，最終開發(fā)出運用單電子計數(shù)技術的直接電子探測器，也就是后來被Gatan公司商業(yè)化的K2相機。

如果說今年的三位諾獎得主研發(fā)出來的冷凍電鏡是1.0版本的話，程亦凡團隊的貢獻，就是直接使電鏡升級進入到2.0時代。這也是有人認為程亦凡足可以獲諾獎的原因。對此，他一笑了之，似乎并未當真。

FEI公司在科學上的決策失誤也令他們痛失商機。盡管清華的3臺高端冷凍電鏡都是該公司的產(chǎn)品，但相機配備的卻都是Gatan公司的K2，這就像攢電腦一樣。如今這也是國際上高端冷凍電鏡的主流配置。

王宏偉評價說，冷凍電鏡是一個高度交叉的領域，它綜合了光學、材料、生物、計算科學等多個學科。像程亦凡就是物理學背景出身，后來又成長為一名分子生物學家，因此，他能夠從生物學應用的角度，參與到冷凍電鏡的技術研發(fā)中。他的貢獻，同時在于冷凍電鏡方法本身與電鏡應用研究兩個方面。

程亦凡則表示，過去，晶體學家們一直對冷凍電鏡不以為意，因為冷凍電鏡能解析的結構，都是晶體學手段已經(jīng)可以做到的。但TRPV1蛋白結構是晶體學家們多年來一直想獲得而未能成功的“圣杯”。因此，當他的團隊首次利用改進后的冷凍電鏡解開該蛋白結構后，“整個晶體學界意識到，電鏡可以做我們做不了的東西。從那以后，國際上很多著名的晶體學實驗室，連夜決定改變方向，再也不做晶體學了，要開始做電鏡。”

身為一名曾經(jīng)主要依靠晶體學手段來做研究的結構生物學家，施一公也曾于2015年表示，原來冷凍電鏡和X射線晶體衍射對結構生物學的貢獻是1：10，而過去一年，這個比例幾乎倒了過來。

清華“押對了寶”

在北京晚秋的一個周末，《中國新聞周刊》記者來到位于清華大學生科院一樓的實驗室，看到一座高達4米的冷凍電鏡鏡筒頂天立地矗立在房間里。另外兩臺Titan號冷凍電鏡，安裝在院子中間臨時加蓋的平房里——足見所有人最初都未充分預見到冷凍電鏡后來的發(fā)展趨勢。盡管是周末，仍有兩個團隊在電鏡上做試驗。

王宏偉表示，現(xiàn)在清華的三臺Titan電鏡都是滿負荷運轉，所有想來做試驗的團隊都要排隊。即使是校內課題組申請使用，也至少要排隊等上兩個星期左右。“因為要做試驗的太多了，我們是人休息電鏡不休息。假如正好是過年期間排上了機時，就不能放假，要在這守著做。”

王宏偉也在文章中表示，如今，全世界所有的冷凍電鏡平臺都人滿為患。高端儀器設備的供不應求，已經(jīng)成為結構生物學家抱怨最多的問題之一，甚至可能比對經(jīng)費申請困難的抱怨還要多。在他們建設清華冷凍電鏡平臺時，曾有人擔心：“這么多的高端冷凍電鏡，未來會有足夠的人使用嗎？它們的運行費用將如何維持？”今天，令王宏偉和同事們遺憾的是，當初沒有規(guī)劃更多的設備與空間，導致現(xiàn)在的運行機時非常緊張。

2011年以來，清華生科院以第一作者單位在國際頂尖雜志 CNS（即《細胞》《自然》《科學》三大學術期刊）上發(fā)表論文40篇，其中，2016年發(fā)表13篇。王宏偉表示，如今，在結構生物學領域，清華的一舉一動都受到國際同行的密切關注。

外界有人認為，清華生科院近年來表現(xiàn)搶眼，應歸功于冷凍電鏡。這雖并不公允，卻也道出了部分原因。

2015年，施一公團隊首次捕獲剪接體高分辨率結構，解決了業(yè)界多年以來未能突破的難題。當時，他在新聞發(fā)布會上表示，“如果沒有冷凍電鏡技術的革新，就完全不可能得到剪接體近原子水平的分辨率。”回顧過去，王宏偉說，清華能有今天的成績，得益于在冷凍電鏡尚未成為主流之前就提前布局。而這一決策，有一定的運氣成分，但更多是歷史的必然性。

清華一直有電鏡研究的傳統(tǒng)與基礎，王宏偉的導師隋森芳院士從1990年代就開始從事電鏡方面的研究，他本人在清華生物系攻讀碩士研究生與博士階段，研究的也正是電鏡技術。

2007年，當“千人計劃”的標桿人物施一公回國后，清華決定建設新的結構生物學實驗設備。當時，上海光源的建設已經(jīng)為X光晶體學提供了應用基礎，北京大學有一套NMR設備，結構生物學的三大研究手段中只有冷凍電鏡在國內還是空白。施一公結合國際前沿情況，判斷冷凍電鏡將是未來結構生物學的發(fā)展方向，因此，他聯(lián)合隋森芳與王志新兩位院士，說服清華大學，斥巨資3000萬人民幣，購買了清華也是全亞洲第一臺高端冷凍電鏡。

“當清華購買第一臺電鏡時，程亦凡革命性的研究成果尚未出爐。因此，那時候，我們只是覺得電鏡是未來方向，需要布局和研究。在這個意義上，也可以說我們押對了寶。”王宏偉表示。

英國劍橋MRC分子生物學實驗室博士后張凱表示，如今，清華生科院與中科院生物物理所是目前國內冷凍電鏡水平最高的研究機構，包括電鏡應用和方法本身。它們在電鏡應用方面的論文產(chǎn)出，已經(jīng)與世界最頂級機構如劍橋MRC分子生物學實驗室相當，超越了世界大多數(shù)同行機構。

瘋狂的設備競賽

“瘋狂”，王宏偉在說到全球冷凍電鏡發(fā)展情況時，用了這個詞。盡管冷凍電鏡身價非常昂貴，但“無論是中國還是歐美其他國家，冷凍電鏡都處于瘋狂的發(fā)展階段”。

8年前，清華購買第一臺300KeV冷凍電鏡時，施一公花了兩周時間與對方談判，最終將價格砍到了3000萬元人民幣，而根據(jù)外媒報道，它的公開最新價格已漲到了600萬美元折合人民幣近4000萬。這還沒有包括需要額外配備的、身價近400萬人民幣的K2相機。此外，冷凍電鏡一年的運行維護保養(yǎng)成本也有300萬左右。

2017年8月，美國生物化學與分子生物學會的會刊《ASBMB Today》上發(fā)表了一篇文章，名字就叫《瘋狂的冷凍電鏡》。文中，人類基因組工程發(fā)起人柯林斯表達了對美國在冷凍電鏡平臺建設上動作遲緩的焦慮：“在讓科研人員獲得冷凍電鏡的使用機會上，美國已經(jīng)落在了中國和歐洲的后面。我們非常關注此事并覺得我們應該做些什么。”

實際上，柯林斯的焦慮可能只是美國這個世界科學界的長期領跑者未雨綢繆的擔心。加州大學洛杉磯分校的周正洪教授也是冷凍電鏡領域的權威專家。他在接受《中國新聞周刊》采訪時表示，當前，在冷凍電鏡的數(shù)量上，中國和美國堪稱平起平坐，都處于領先地位，超過英國與德國，更是遠遠領先于日本和法國。而亞洲的另一個大國印度最近才剛剛完成第一臺冷凍電鏡的購買交易。

王宏偉則表示，雖然清華的冷凍電鏡起步早，曾一度領先于世界，但國外趕超得非常快。

目前，英國的電子生物成像中心（eBIC）與美國紐約的結構生物學中心等幾家科研機構擁有的電鏡數(shù)量已經(jīng)超過清華或與其持平。截至目前，美國正在運行的高端冷凍電鏡已經(jīng)有30臺左右，但很多大學仍在紛紛購買冷凍電鏡。NIH（美國國家健康研究所）也在建設自己的電鏡中心。據(jù)了解，到明年年底，僅300KeV的高端冷凍電鏡，美國就將有100臺左右;此外，已經(jīng)擁有10臺冷凍電鏡的德國，在最近又宣布還將購買17臺。

中國也沒有落在人后。繼清華大學之后，中科院生物物理所、上海蛋白質中心、北京大學、復旦大學、上海科技大學、四川大學等多家高校與科研機構都紛紛引進高端冷凍電鏡。

2017年，浙江大學宣布，與國內很多電鏡中心都是國家投資不同，該校將自籌經(jīng)費6000萬元建設冷凍電鏡中心，使之成為國際上配置最齊全、技術覆蓋最廣的電鏡研究中心之一。

由于有財力雄厚的深圳市的全力支持，剛剛辦學還不到10年的南方科技大學已經(jīng)買入兩臺冷凍電鏡，最近又在購買兩臺新的電鏡。有傳聞稱，該校未來將擁有更多的高端冷凍電鏡。

根據(jù)王宏偉等人的統(tǒng)計，到2017年年底，中國將共有各種型號的冷凍電鏡50臺，其中高端冷凍電鏡20臺。到2018年年底，高端冷凍電鏡的數(shù)字將可能增至30臺。

“到明年年底，全世界的高端冷凍電鏡數(shù)量將增至200臺。這是一個發(fā)展非常迅速的領域，設備多了，參與的用戶也多了，這對于推動冷凍電鏡的技術發(fā)展無疑是好事，但我也并不懷疑，并非所有的高端冷凍電鏡都會有良好的使用效率與高水平的科研產(chǎn)出。這取決于電鏡團隊的管理水平、用戶的水平、以及設備擁有團隊是否有能力對他們的電鏡做重要的技術改進與革新。”王宏偉表示。

對于這場不斷升級的高端科研設備“大賽”，程亦凡無法判斷中美之間究竟誰將贏得冷凍電鏡擁有數(shù)量的冠軍，但是中國對冷凍電鏡的大手筆投資，給他留下了十分深刻的印象。

他指出，結構生物學發(fā)展到今天，如果將其比喻成一棵大樹的話，過去能被晶體學家們摘掉的桃子都已經(jīng)被摘完了。現(xiàn)在的冷凍電鏡是一個新梯子，可以幫助人們摘更高處的桃子。因此，他發(fā)現(xiàn)，國內一些在此領域毫無基礎的科研機構也在購買冷凍電鏡，主要就是用來做應用研究。

在《冷凍電鏡在中國》一文中，王宏偉等人就指出，在中國冷凍電鏡發(fā)展迅速的同時也存在對其基礎性方法研究的不足。張凱也認為，由于歷史積淀等方面的原因，中國在冷凍電鏡的重大基礎性突破上與國外頂級機構相比還有不小差距，研究系統(tǒng)性也有一定差距，研究內容的多元化程度不夠，多學科相互滲透影響稍弱。在電鏡方法方面的研究依然是弱項，尤其是在重大基礎性方法研究上的差距可能在很長一段時間很難改變。

程亦凡說，“他們的思路是，只要購買電鏡，就能發(fā)很多高影響因子的文章。這是一個好的策略嗎？我個人持保留意見。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的根源，是國內科研的評價體系存在問題，即‘唯CNS論。而什么樣的文章發(fā)CNS最快呢？是結構生物學。”

身為一名結構生物學家，程亦凡坦言，他一直有一個可能會得罪同行的看法：在生物學界，結構生物學相對而言更像是一個體力活，而不是腦力活。結構生物學的“桃子”在哪里，往往是明確的，只需要工具，有足夠的資源和人力，不需要動太多的腦筋。但生物的其他領域里面，“桃子”在哪里還不知道，還需要去找。

當前的形勢是，冷凍電鏡研究可以用“如火如荼、日新月異”這8個字來形容。據(jù)王宏偉統(tǒng)計，在1980年代，全世界從事冷凍電鏡相關研究的課題組不超過20個，總人數(shù)也不過100人;到2000年初，已經(jīng)增至近50個;到2010年左右，以冷凍電鏡為主的研究團隊已經(jīng)超過100個。冷凍電鏡已經(jīng)吸引了越來越多數(shù)學、物理學、計算機科學、工程學背景的科學家的加入，新概念與新技術不斷被引進，因此，未來會有更多更快的技術革新出現(xiàn)，使冷凍電鏡技術更上一層樓。

很多人都問程亦凡，冷凍電鏡的下一個技術突破在哪里？在他看來，冷凍電鏡目前還是有不少瓶頸問題，但都屬于細節(jié)上的問題。如果一定要說未來還會有什么飛躍，那就是能不能用冷凍電鏡直接去看細胞里面的結構。

“由于滾雪球效應，冷凍電鏡領域今后5年的發(fā)展速度，將會大大快于上一個5年。因此，我很期待在未來5～10年內，就看到電鏡技術實現(xiàn)這一目標。”程亦凡相信，盡管在5～10年后蛋白結構的解析可能仍無法像如今的基因測序那樣的簡單、快捷、高效，但隨著技術進步，這一天遲早會到來。到那個時候，結構生物學最終將回歸到生物學本身。“我現(xiàn)在就經(jīng)常告訴我的學生，不要只關心解析一個結構，而是要致力于解決一個生物學問題。冷凍電鏡只是研究手段，而且只是手段之一。”

在這個大背景下，程亦凡指出，很多學校認為，買電鏡是更快更多發(fā)CNS文章的捷徑，但實際上能不能“趕上趟兒”卻是個問題。“冷凍電鏡并不是一個下午就能安裝完畢的，從購買、安裝、調試、學習使用到真正用于科研，至少需要兩年時間。在這段時間里，電鏡技術本身可能又有質的飛躍，解析蛋白會變得更加容易。”過去，解析一個蛋白的結構，就能在CNS上發(fā)表文章。5年之后，同樣的工作恐怕就難以再發(fā)表高影響因子的文章了。

日本就發(fā)生過類似的情況：在核磁共振剛發(fā)明出來的時候，日本有的機構買了很多臺核磁共振設備，但隨著科學的發(fā)展，這些設備后來都被淘汰閑置了。“當冷凍電鏡能夠得著的‘桃子都摘完之后，就需要新的技術來尋找更高處的‘桃子，到那時，電鏡就會成為‘昂貴的擺設。這對中國的科學發(fā)展不是一個好事。”程亦凡說，“業(yè)界有人在呼吁，但是現(xiàn)在，我們擋不住這股潮流。”