綠色木霉VKF3中提取的木聚糖酶用于廢舊新聞紙的脫墨

綠色木霉VKF3中提取的木聚糖酶用于廢舊新聞紙的脫墨

綠色木霉VKF3是紅樹林土壤樣品中的木聚糖分解真菌。該研究在不同的碳源、氮源、pH和培育溫度下生產綠色木霉VKF3，獲得了最佳的木聚糖酶。將椰子油蛋糕作為底物，測得分離后的綠色木霉VKF3所產生的木聚糖酶的最大活性為3.045 IU/mL。在純化期間，用40%的硫酸鹽能獲得84%的得率。通過酶譜分析，在14 kDa觀察到光譜帶，證實了酶的活性。酶劑量30%時的木聚糖酶在培育4 h后最大程度地促進了己烯醛酸釋放。另外，隨著酶劑量和培育時間的增加，卡伯值呈下降趨勢。在酶處理4 h之后，白度增加了11%。通過木聚糖酶的輔助脫墨，紙頁的抗張強度、耐破指數以及耐折度等強度性能均有所提升。

制漿造紙行業的化學脫墨會對環境造成一定的污染，而利用生物酶的生物脫墨技術對環境無污染，因此具有更好的發展潛力，但是與化學脫墨法相比，生物脫墨法更具有挑戰性。將化學脫墨與生物脫墨相結合，可以降低化學品的使用量。但是要想徹底解決化學品使用過程中的毒性問題，只能通過生物脫墨法來實現。

目前的脫墨過程中，仍依賴于許多對環境有害的化學品，主要是氫氧化鈉、硅酸鈉、碳酸鈉、過氧化氫、螯合劑和表面活性劑等。基于化學品的化學脫墨技術會產生較多的有毒廢水，增加COD含量，從而增加廢水處理過程的成本。因此，將生物酶作為一種化學品的替代品，如生物漂白過程中使用生物酶作為氯及氯化物的替代品，能夠很大程度上減少制漿造紙過程中的許多污染問題。

漂白過程中的最大問題是木質素的去除以及其衍生物與木聚糖和纖維素的結合。有報道稱，可以利用通過白腐菌培育的諸多生物酶來降解紙漿中的殘留木質素，例如：用于降解木質素的錳過氧化物酶、漆酶以及降解半纖維素的木聚糖酶。在制漿造紙行業中，比起以漆酶為主的木質素降解體系，其實木聚糖酶更適合于漂白。研究人員將內切葡聚糖酶和內切木聚糖酶應用于混合辦公廢紙的脫墨過程中。在脫墨過程中添加未加工的綠色木霉，結果顯示脫墨效果提高了24%，同時紙頁的強度也有所提高。另外，實驗也發現綠色木霉對于混合辦公廢紙的脫墨效率更高。

在酶輔助生物漂白過程中，會產生大量諸如八氯二苯并對二噁英的有毒化合物。這種二噁英可能是與木質素相關的有機分子釋放出來的，從而通過有機分子前體加速形成八氯二苯并對二噁英。先前的研究認為將生物酶輔助Cl2進行漂白是很高效的，然而最近的研究發現二噁英化合物的產生會限制生物酶的漂白效果；并發現單獨使用木聚糖酶而不與氯化物一起共同漂白，能有效地減少二噁英的產生。

目前已經有很多報道關于由不同的微生物來源產生木聚糖酶的菌株，但是這些酶在脫墨過程中效率很低并且穩定性較差。出現這一現象的原因可能是一種反饋機制來抑制了生物酶的活性。因為紙漿中富含碳水化合物，尤其是纖維素，因此需要找到一種更好的生物酶應用于制漿造紙行業。

本實驗主要研究從綠色木霉VKF3中提取的木聚糖酶在廢舊新聞紙的脫墨效果，并且記錄了酶處理過程中的乙烯醛酸的釋放量和卡伯值的變化。綠色木霉是一種能夠促進植物生長的真菌，因此除去生產木聚糖酶的部分，剩余部分可以用于農業生產。此外，對于在先前的報告中針對所測試植物的真菌中沒有檢測到植物致病性。

1 實驗

1.1 材料

從印度喀拉拉邦的Valanthakad紅樹林的沉積物樣品中分離出綠色木霉VKF3，然后將其接種到馬鈴薯葡萄糖肉湯中并在（27±2）℃的溫度下培育3天。使用100 μm的無菌網過濾真菌，然后濾液在轉速5 000 r/min下離心5 min，得到的上清液即為粗酶液。

1.2 木聚糖酶的活性檢驗

用如下方法來對木聚糖酶的活性進行檢測：將0.5 mL的上清液與10%的樺木木聚糖（BWX）1.5 mL混合，然后在量濃度0.1 mmol/L、pH為8.0的磷酸鹽緩沖液中培育15 min，培育溫度設定為50℃。通過加入2.0 mL二硝基水楊酸試劑（DNSA）終止反應，并進一步在沸水中培育10 min。在540 nm處測定顏色，并通過比較D-木糖標準曲線進行定量。在標準測定條件下與1 μmol木糖每分鐘釋放的D-木糖相當的還原糖的酶量，被定義為一個單位的木聚糖酶活性。

1.3 優化發酵條件

優化碳源、氮源、pH和培育溫度等發酵條件。

使用的真菌基礎培養基主要有：K2HPO4（0.20 g/L），KH2PO4（0.18 g/L），NaHPO4（2.0 g/L），NaNO3（3.80 g/L），H3BO3（0.057 mg/L），MnSO4.H2O（5.5 μg/L），CuSO4·7H2O（2.5 μg/L），ZuSO4·7H2O（0.5 mg/L），Fe2（SO4）3·6H2O（5 μg/L），MgSO4·7H2O（5.5 μg/L），NH4NO3（0.60 g/L），（NH4）6MoO24（0.025 mg/L）。 將3%的真菌接種物加入無菌培養基中，并在旋轉振蕩器上以每分鐘150轉的速度培育3天。

在第3～11天對酶活進行檢測來了解生產性酶動力學。確定最佳碳源之后進一步用于氮源優化；然后在不同的 pH（3、5、7 和 9）和不同溫度（25、35、45和55℃）下評估最佳的木聚糖酶生產條件（最佳pH和最佳溫度）。

1.4 用于木聚糖酶生產的固體發酵

在多種固體底物上評估生物酶的產生能夠降低生產成本。用真菌基礎培養基潤濕底物，其中并不包括碳源和氮源；然后利用基礎培養基將底物的水分保持在20%、30%和50%，并接種3%的真菌接種物；最后將固態培養物在（28±2）℃的溫度下培育7天。

通過向固體培養基中加入pH為6.8的磷酸鹽緩沖液進行酶液提取，然后使用100 μm的無菌網過濾培養3 h。回收的酶液通過硫酸銨沉淀進行部分純化。另外還測試了金屬離子、還原劑和氧化劑對酶活性的影響，并以百分比來表示殘留活性。

1.5 實驗方法

1.5.1 木聚糖酶的分子和物理化學表征

采用凝膠電泳表征十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺。用12%的丙烯酰胺凝膠裝載粗酶液和蛋白質中間標記物。電泳后，使用考馬斯亮藍染色溶液對凝膠進行染色，然后脫色以顯現蛋白條帶并確定酶級分的相對分子質量。對于酶譜分析，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳用補充有1%（W/V）樺木木聚糖的12%丙烯酰胺凝膠進行。電泳之后的凝膠在室溫下用0.1%（W/V）的剛果紅染液染色30 min。在具有木聚糖酶活性的級分上將清除帶進行可視化處理。為了研究金屬離子對木聚糖酶活性的影響，在已知量濃度（5、10 和 15 mmol/L）和各種金屬離子（K+，Mn2+，Co2+，Fe3+，Cu2+，Zn2+，Mg2+，Hg2+）的條件下，測定所獲得的木聚糖酶活性。用阿利紐斯作圖法計算酶的活化能。

1.5.2 脫墨實驗

使用烘干的廢舊新聞紙漿進行脫墨實驗，將蒸餾水平均分為幾份以獲得實驗結果的一致性。然后添加不同劑量的粗酶液[20%、30%和50%（W/V）]培育1 h或4 h。將酶處理之后的紙漿在121℃下高溫滅活15 min，并在自來水中徹底洗凈。在Uni-Vat機器（TARA機械）中使用脫墨紙漿制成再生紙并且在陰涼處干燥。干燥后的紙頁進行壓光，并進一步分析其改進的亮度、抗張強度、5%溶液的pH、堿度和不透明度。用掃描電鏡（SEM）觀察酶處理前、后紙漿的纖維的變化。

1.5.3 己烯醛酸量含量和卡伯值的測定

己烯醛酸（HexA）含量和卡伯值是決定紙漿生物漂白效率的關鍵因素。己烯醛酸是在硫酸鹽紙漿蒸煮過程中形成的不飽和化合物，也就是將木聚糖中的4-O-甲基葡萄糖醛酸轉化成其相應的不飽和己烯醛酸。由于漂白后對紙漿性能的不利影響，己烯醛酸近年來受到了越來越多的關注。己烯醛酸含量會影響卡伯值、亮度回歸、草酸形成、漂白劑的消耗和金屬離子的保留，因此在生物漂白過程中測定己烯醛酸的釋放量至關重要。

烘干紙漿的己烯醛酸含量的測定如下所示。將0.05 g烘干紙漿用10 mL水解溶液水解，其中含有0.6%的 HgCl2和0.7%的乙酸鈉。將反應混合物放入60℃水浴鍋中培育30 min。分別在波長260 nm和290 nm處讀取溶液的吸光度。根據公式1計算出紙漿的己烯醛酸含量。

式中：V表示水解溶液的體積，mL；W表示烘干紙漿的質量，g。

卡伯值指的是在標準條件下，1 g絕干漿所消耗的量濃度0.1 mol/L高錳酸鉀溶液的體積。卡伯值與己烯醛酸含量有一定的聯系，因此傾向于卡伯值基于己烯醛酸濃度而增加。用卡伯值的變化來表示紙漿的脫木質素能力和漂白能力。實驗中使用的檢測標準是 TAPPI T236 om-99（2004）。

2 結果與討論

2.1 使用綠色木霉VKF3生產木聚糖酶的條件優化

綠色木霉VKF3不僅能夠培育纖維素酶，而且也能夠用于木聚糖酶的生產。培育3天后，使用培養濾液進行酶測定，發現蔗糖是最優的碳源。另外在室溫下培育到第7天時，葡萄糖作為碳源時也能夠達到相當的活性。而將木糖作為碳源時，會產生較低的酶活性。值得注意的是將木聚糖作為碳源或誘導劑，由綠色木霉、曲霉菌、哈孜木霉和鏈霉菌培育的木聚糖酶活性顯著增加。將葡萄糖和木糖作為碳源時，對酶的合成會產生不利影響，這種抑制作用可能是在其他酶中發生的分解代謝物抑制機制。但是，將葡萄糖和麥芽糖作為碳源時，木霉表現出了很高的木聚糖酶活性。表1顯示了浸沒發酵下優化綠色木霉VKF3生產木聚糖酶的因素（表中數據為3次實驗的平均值）。

表1 浸沒發酵下優化綠色木霉VKF3生產的木聚糖酶酶活 IU/mL

表1表明：當培育到第7天時，蔗糖作為碳源時表現出了最高的酶活，而此時測試的其他碳源的酶活有所下降；當補充尿素作為氮源時，在培育到第5天時木聚糖酶的活性達到最高，但是在第7天時酶活會大幅度的下降。在培育到第5天時，其他的氮源也使酶活達到了最大值，但與含尿素的培養基相比數值還是較低；在對pH進行優化時，發現培育到第7天時酶活達到了最大值；從培育的第3天開始酶活呈指數增長，從第7天起酶活有了小幅度的下降。因此，木聚糖酶的最佳培育時間是7天。使用哈孜木霉培育的木聚糖酶在第7天達到了最大的酶活。在酶活性中觀察到的下降趨勢可能是由于在發酵培養基中的大量和微量營養素的消耗，其誘導真菌的應激，從而使酶分泌途徑失活。

由表1還表明溫度也是一個很重要的影響生物酶生產的因素：50℃的溫度下培育到第5天時，木聚糖酶達到了最大的酶活。相比于先前的研究，這表明酶具有嗜熱性質。

有研究者用木霉來生產木聚糖酶并在第6天時達到了最大的酶活，發現在溫度25℃時最大酶活達到了93.5 IU/mL。也有研究人員發現用哈孜木霉生產木聚糖酶時在第8天達到了最大酶活。

2.2 用于木聚糖酶生產的固體發酵（SSF）

與浸沒式發酵相比，固體發酵的優點主要是操作簡單，生產量高，低污染和產品具有高濃縮性。固體發酵在固體廢物管理中起著重要作用，其使用的固體基質通常是農業廢物，因此固體發酵過程中固體物質的利用或降解是至關重要的。在固體發酵過程中，真菌利用固體廢棄物生長，并進一步給生物酶的生產提供生物能。

目前的研究發現椰子油蛋糕是最優的發酵底物，能使木聚糖酶的活性達到最高，見表2（表中數據為3次實驗的平均值）。

表2 綠色木霉VKF3在不同種固體發酵底物下生產木聚糖酶的對比

由表2可見，木聚糖酶的生產與水分含量呈正相關。由于較低的分解代謝阻力，所以與浸沒式發酵相比固體發酵能得到更高的酶活，這可能是由于低水分活動而引起的一種緩慢擴散過程。

2.3 木聚糖酶的表征

將底物用磷酸鹽緩沖液浸沒，然后通過無菌篩網過濾，得到粗酶液。使用硫酸銨進行酶的部分純化，40%硫酸銨產生最大酶活性，得率為84%，見表3。

表3 木聚糖酶的純化得率

從綠色木霉VKF3中獲得的木聚糖酶在大約66、52、35、22 和 14 kDa處顯示出各種頻帶，見圖 1（樺木木聚糖酶作底物）。使用凝膠進行酶譜分析時，將樺木木聚糖做為底物用剛果紅染色。這種方法通常用來檢測木聚糖分解活性，來識別具有活性的部分。

從分析中觀察到在43 kDa至66.0 kDa和14 kDa之間的有2個不同的清除區。在之前的研究中，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）和凝膠過濾后估計的純化木聚糖酶的相對分子質量分別為Xyl I的19 kDa和14 kDa，Xyl II的21 kDa和14.6 kDa。使用阿利紐斯方程計算木聚糖酶的活化能，結果為60.877 kJ/mol。

圖1 來自綠色木霉VKF3的木聚糖酶的SDS-PAGE（a）和酶譜分析（b）

2.4 金屬離子對木聚糖酶活性的影響

來自綠色木霉VKF3的木聚糖酶活性隨金屬離子的添加而下降，但是低濃度的K+、Cu2+、Zn2+和Mg2+對酶活幾乎沒有影響，見表4（表中數據為3次實驗的平均值）。

表4 在不同種金屬離子下殘留木聚糖酶的活性比較

然而目前的研究發現，諸如 Zn2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+和Ca2+等金屬離子對木聚糖酶的活性會有有利影響；而Cu2+則會使酶活降低。但是，有些木聚糖酶的活性會被Cu2+完全抑制。基本上，金屬離子對酶活的抑制或者促進作用，取決于金屬離子與蛋白質之間的相互作用。有些金屬離子會影響蛋白質的結構從而改變酶促作用。之前的研究發現，金屬離子不僅會影響木聚糖酶結合的活性位點，而且也會影響非催化性木聚糖的結合區域，金屬離子促進底物的有效水解，從而使酶活性降低。

2.5 木聚糖酶用于廢舊新聞紙漿的生物漂白

在脫墨過程中，木聚糖酶被認為是一種優良的生物漂白劑。生物酶的脫墨效率通常由乙烯醛酸的釋放以及紙漿中卡伯值的變化所決定。來自綠色木霉VKF3的木聚糖酶被用于了解生物漂白的潛力。將漿樣進行不同時間的酶處理，漿料的纖維形態會發生變化。然后用掃描電鏡觀察酶處理前后纖維形態的變化，見圖 2[圖中：（a）酶處理后的纖維；（b）對照 -未處理的纖維；（c）酶處理之后纖維表面的裂痕]。

由圖2發現，纖維表面明顯地出現了與油墨的分離和裂紋，這也與前人的研究發現一致。在1 h和4 h的培育時間里，酶劑量為30%時乙烯醛酸的釋放量達到了最大值。然而，培育4 h又能使木聚糖酶達到最高的酶效，見圖3。

紙漿的卡伯值也是檢驗酶效的一個重要因素。在實驗中，隨著酶劑量和培育時間的增加，卡伯值逐漸下降。通常，卡伯值與乙烯醛酸的釋放量呈負相關的關系。在經過二氧化氯處理后，乙烯醛酸的去除率增加了10%。加入木聚糖酶之后，脫木質素提高了9%，ISO白度增加了3%。

在木聚糖酶輔助生物漂白過程中，乙烯醛酸對于化學漿白度的提升有著重要的作用。消除乙烯醛酸對于硫酸鹽漿和全無氯（TCF）漿的漂白過程有著積極的意義，從而能夠達到更高的白度。而卡伯值則是木漿的殘留木質素含量或漂白性的指示性參數。卡伯值因漿料的不同而不同，通常漂白漿的范圍是 25～30，袋紙漿的范圍是45～55，瓦楞紙板的范圍是60～90。此外，由于氧不與乙烯醛酸反應，所以對于六氯丙烷濃度較高的低卡伯紙漿，氧脫木素效率相當低。這也說明乙烯醛酸含量與卡伯值呈負相關，假設紙漿每釋放10 mmol/kg的乙烯醛酸，相當于1個卡伯單位。

圖2 來自綠色木霉VKF3的木聚糖酶處理前后纖維的SEM照片

圖3 來自綠色木霉VKF3的木聚糖酶處理后紙漿乙烯醛酸含量和卡伯值的對比

經過酶處理之后，發現由脫墨紙制成的再生紙的白度有了一定的提高，見表5。

表5 來自綠色木霉VKF3的木聚糖酶生物漂白效果

由表5可見，在經過酶處理1 h和4 h后，白度分別提高了9百分點和11百分點。經過1 h的酶處理之后抗張強度有所提高，但是酶處理4 h后抗張強度呈下降的趨勢。與空白樣品相比，不透明度也有一定的提高。另外，經過酶處理之后pH和堿度并沒有很明顯的變化。

3 結論

（1）綠色木霉 VKF3是用于生產生物脫墨工藝的木聚糖酶的很有潛力的一種分離菌。

（2）固態發酵提供了具有成本效益且易于生產的酶。

（3）廢舊新聞紙漿經酶處理4 h后能達到最佳的白度。

（4）回收紙漿的相關物理性能即使在酶處理之后也不會下降。

（5）卡伯值和乙烯醛酸的釋放量呈負相關，有助于在酶脫墨過程中達到38%的最大白度。

（管 敏 編譯）

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