鹽生草HgNHX1基因啟動子的克隆及功能驗證

鄒蘭，楊軻，徐先良，汪軍成，任盼榮，姚立蓉，孟亞雄，李葆春，馬小樂，王化俊*

(1.甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室，甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農業大學農學院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州730070)

鹽生草HgNHX1基因啟動子的克隆及功能驗證

鄒蘭1,2**，楊軻1,2**，徐先良1,2，汪軍成1,2，任盼榮1,2，姚立蓉1,2，孟亞雄1,2，李葆春1,3，馬小樂1,2，王化俊1,2*

(1.甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室，甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農業大學農學院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州730070)

為了進一步探明鹽生草HgNHX1基因啟動子的功能，從鹽生草基因組中克隆了HgNHX1基因上游 5′側翼調控區1523 bp的序列，即HgNHX1基因啟動子(pHgNHX1)序列，并利用PlantCARE、PLACE等在線軟件對HgNHX1基因5′ 端上游序列進行預測和分析，發現該啟動子中除具有TATA-box、CAAT-box等核心啟動子元件外，還含有多個與鹽、干旱、缺水、冷、傷害等逆境脅迫誘導有關的作用元件；同時具有生長素、脫落酸、赤霉素及乙烯等植物激素誘導響應的功能元件，表明分離得到的DNA片段具有典型啟動子的一般特征。構建pBI-HgNHX1啟動子植物表達載體并轉化擬南芥和煙草，利用組織染色法鑒定轉基因煙草和擬南芥的 β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)表達模式，發現在轉基因擬南芥的各個器官均有GUS 酶的活性，說明pHgNHX1具有一定的組成型啟動子活性。

鹽生草；HgNHX1基因；啟動子；GUS

土壤鹽漬化是一個世界性的資源和生態問題，是嚴重影響農作物產量和質量的主要非生物脅迫之一。據聯合國教科文組織和糧農組織的不完全統計，全世界約有9.54億hm2的土地存在不同程度的鹽堿化，占世界總耕地面積的20%，超過世界土地面積的6%[1-2]。因此，合理開發利用鹽堿地、改善土地鹽堿化程度以及提高作物耐鹽性是未來農業可持續發展急需解決的重大課題。

土壤鹽害可抑制種子萌發、生長發育以及光合作用等，劉愛榮等[3]研究表明，鹽脅迫會引起彩葉草(Coleusscutellarioides)離子穩態被破壞并發生滲透脅迫，對生長產生抑制作用。而Na+/H+逆向轉運蛋白對于植物體的離子平衡、耐鹽性以及植株的整個發育過程，都起到非常重要的作用。高等植物Na+/H+逆向轉運蛋白位于液泡膜和質膜上，分別以V型H+-ATPase和H+-PPiase、P型H+-ATPase，通過水解ATP和PPi，形成跨膜質子梯度，來驅動Na+進入液泡或排出細胞，以維持體內離子平衡[4-5]。植物抵御鹽脅迫的有效策略之一是通過液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白(vacuolar Na+/H+exchanger or antiporter，簡稱NHX)將細胞質中過多的Na+區域化在液泡，一方面降低Na+對細胞質的毒害，另一方面又可將Na+作為一種滲透調節劑來降低細胞的滲透勢[6-7]，從而使植物能更好地適應鹽漬生境。植物液泡膜NHX1類蛋白大多由500多個氨基酸組成，具有12個推測的高度保守的跨膜區[8]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)基因組數據庫中有16個基因被標注為編碼推測的Na+/H+逆向轉運蛋白，Yokoi等[9]通過分析這16個產物與AtNHX1的氨基酸序列和拓撲相似性發現，AtNHX基因家族包括6個成員AtNHX1～AtNHX6。在NaCl脅迫下擬南芥葉中，AtNHX1基因的轉錄表達水平比對照高出4倍，而根中則與對照無明顯差異，表明液泡Na+/H+逆向轉運蛋白基因的表達具有組織特異性[10]。He等[11]發現200 mmol/L NaCl處理條件下，棉花(Gossypiumspp.)過量表達AtNHX1，其植株產量會增加，且能產生更多的棉纖維。可見，Na+/H+逆向轉運蛋白基因的遺傳研究對植物的耐鹽脅迫意義重大。

啟動子是調控基因表達的重要元件，通常僅位于基因上游，可以指導全酶與模板的正確結合，能夠與RNA聚合酶相互識別、結合，從而開啟基因的轉錄過程，是植物基因轉錄調控的中心[12]。啟動子核心區域中含有RNA聚合酶識別位點CAAT-box和RNA聚合酶結合位點TATA-box[13]，具有一些能與轉錄因子相結合的順式作用元件，從而調節基因的轉錄。啟動子按其調控基因的表達方式可分為組成型啟動子、誘導型啟動子和組織器官特異性啟動子3種。目前，大多數轉基因植物所用的啟動子是組成型啟動子(如35S啟動子)，它能夠在組織中非特異性和高效表達，可以滿足人類的需求，但是外源基因的這種表達方式打破了植物原有的代謝平衡，影響了植物的正常生長。為了減少這種不利影響，克隆新的啟動子對其進行功能驗證以尋求具有組織特異性的啟動子就顯得尤為重要[14]。

鹽生草(Halogetonglomeratus)為藜科(Chenopodiaceae)鹽生草屬一年生雙子葉植物，廣泛分布于我國西北旱區及半干旱區，其莖、葉高度肉質化，可以在高度鹽堿化的環境中正常生長。Wang 等[15-16]研究表明，鹽生草具有很強的耐鹽性，其最主要的耐鹽機制是將毒性離子(主要為Na+、Cl-)區隔化在葉片細胞液泡中。是植物耐鹽基因挖掘及研究耐鹽調控機理的良好材料，對改良作物抗逆性及培育耐鹽堿作物具有重要的應用價值。而當前關于鹽生草耐鹽相關啟動子的研究還屬空白，基于此，本實驗以鹽生草為材料，克隆了HgNHX1基因啟動子，通過農桿菌介導法轉化煙草(Nicotianatabacum)和擬南芥，并利用GUS表達進行功能驗證，闡明了pHgNHX1具有一定的啟動子活性，為其通過基因工程手段培育耐鹽植物育種中的運用提供了理論支撐。

1 材料與方法

1.1植物材料

實驗所用鹽生草種子采自甘肅省會寧縣河灘鹽堿地。于2015年播種于裝有蛭石與細沙(體積比1∶1混合)的花盆中，在甘肅農業大學麥類實驗室人工氣候室培養，每天澆灌適量1/2 Hoagland’s 營養液，待幼苗長至2個月后，利用200 mmol/L NaCl進行鹽脅迫處理48 h，挑取長勢較好的鹽生草葉片提取DNA。

1.2主要試劑

PCR擴增所用的Ex Taq酶、DNA Marker、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、限制性內切酶、T4DNA Ligase均購自大連寶生物工程有限公司，PCR引物合成和樣品測序均由上海生工生物科技有限公司完成，Kan、Amp、IPTG、X-gal、Rif等均為進口分析純級試劑。

1.3菌株和載體

大腸桿菌DH5α感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司；農桿菌菌株LBA4404、植物表達載體pBI121均由麥類實驗室保存(甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室)。PMD19-T Vector購自大連寶生物工程有限公司。

1.4鹽生草基因組DNA的提取

基因組總DNA的提取采用CTAB法，參照文獻[17]，略有改動。

1.5鹽生草HgNHX1基因啟動子的克隆

本實驗利用TAIL-PCR方法[18-19]從鹽生草基因組DNA中分離HgNHX1基因起始密碼子(ATG)的上游片段。特異引物均由Oligo 7軟件設計，并添加酶切位點BamHI和保護堿基；隨機簡并引物參考Li等[20]，并添加酶切位點ScaI及保護堿基。擴增5′端上游序列所用隨機簡并引物及特異性引物如表1所示，其中N=A/G/C/T，W=A/T，S=G/C。序列送上海生工生物科技有限公司合成，PCR產物經回收后克隆到PMD19-T載體中，序列測定由上海生工生物科技有限公司進行。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in experiment

1.6表達載體的構建

用ScaI和BamHI雙酶切表達載體pBI121質粒，同時雙酶切已經轉入了目的基因的大腸桿菌菌液所提的質粒，利用 T4連接酶連接到pBI121載體，替換pBI121 載體上的 CaMV35S 啟動子。連接體系為 PCR 片段 6 μL，載體 DNA 1 μL，10×T4DNA Ligase Buffer 1 μL，T4DNA Ligase 1 μL，ddH2O 1 μL，除過T4DNA Ligase，上述其他反應物加入后，在65 ℃條件下保溫3 min，然后迅速轉入冰中冷卻數秒，加入T4DNA Ligase， 16 ℃過夜連接，連接體系轉化大腸桿菌 DH5α 感受態，測序確定pBI-HgNHX1啟動子表達載體構建成功。將構建好的表達載體轉化農桿菌LBA4404感受態細胞，挑取單菌落進行PCR驗證，陽性克隆保存菌液待用。

1.7擬南芥遺傳轉化及轉基因植株的篩選

利用浸花法[21]轉化擬南芥，將含重組質粒的農桿菌菌液在28 ℃，200 r/min的YEP液體培養基(Yeast extract Tryptone medium)中振蕩培養至OD600=1.2～1.6，離心棄上清，用5%蔗糖懸浮至OD600=0.8，浸染前加入Silwet-77 至終濃度為0.05%，混合均勻。擬南芥浸染前保證有大量未成熟的花序，將花序浸入菌液中5～10 s，用黑色塑料袋罩住浸染后植株暗培養16～24 h，之后正常培養，待種子成熟將其收集。

1.8煙草遺傳轉化和檢測

煙草種子經75%乙醇和5%次氯酸鈉消毒，無菌水洗凈后播于MS培養基上生長4～5周，利用葉盤法[22]轉化煙草。取煙草葉片，剪成小塊(0.5 cm×0.5 cm)在MS分化培養基中25 ℃預培養兩天，將保存的攜帶有pBI-HgNHX1啟動子表達載體的農桿菌菌液于28 ℃，200 r/min振蕩培養至OD600=0.6～0.8，5000 r/min離心5 min，棄上清，用MS液體培養基懸浮菌體。將預培養兩天的煙草葉片浸在菌液中5～10 min，取出后吸干多余菌液接于MS分化培養基上28 ℃共培養2～3 d，用含Cef的無菌水洗葉片2次，再用含MS的液體培養基洗1次，吸干多余液體，轉入含Kan和Cef的分化培養基進行抗性篩選，待抗性芽1 cm左右時，將叢生芽切下放入生根培養基進行生根培養，將生根后的幼苗移入盛有無菌土的花盆，溫室常規管理。

利用CTAB法[17]提取轉基因煙草葉片的 DNA，利用上下游引物進行 PCR 檢測，陽性煙草和原始煙草留苗繼續生長以待用。

1.9GUS組織化學染色

將抗性篩選的擬南芥植株和陽性煙草葉片加入 GUS 染液，并設置野生型擬南芥和煙草為對照，37 ℃保溫數小時，然后用70%乙醇沖洗浸泡，觀察GUS染色結果并照相。

2 結果與分析

圖1 TAIL-PCR擴增產物Fig.1 Products of TAIL-PCR M: DL4000 marker; SP1:第1輪擴增PCR產物Primary PCR product; SP2:第2輪擴增PCR產物Secondary PCR product; SP3: 第3輪擴增PCR產物Tertiary PCR product; AD1:隨機兼并引物Arbitrary degenerate primer.

2.1HgNHX1啟動子的克隆

以鹽生草基因組DNA為模板，利用TAIL-PCR方法經過三輪巢式反應后將三輪擴增產物一起進行電泳檢測，選取PCR產物大小差別與特異性引物位置差異相符的DNA片段回收。電泳結果如圖1。

將目的片段連接克隆載體后測序，得到HgNHX1基因上游全長為1523 bp的序列。通過將該序列ATG上游區域的Blast比對發現，它與無翅豬毛菜(Salsolakomarovii)NHX1基因(SkNHX1)5′ UTR區同源性較高。并將該序列與引物設計序列比對，發現其3′ 端111個堿基與HgNHX1基因5′ 端序列基本相符。通過以上分析初步證明擴增得到的DNA片段是HgNHX1基因5′ 端上游序列。

2.2HgNHX1基因啟動子區域及其順式作用元件分析

利用PlantCARE、PLACE等在線軟件對HgNHX1基因5′ 端上游序列進行預測和分析，結果表明該啟動子中除具有TATA-box、CAAT-box等核心啟動子元件外，還含有多個與鹽、干旱、缺水、冷、傷害等逆境脅迫誘導有關的順式作用元件及轉錄因子結合位點；同時具有多個植物激素誘導響應的功能元件，預測的功能元件在序列中的具體位置及元件功能分析見圖2和表2。

2.3pBI-HgNHX1啟動子表達載體的構建

如圖3，為了檢測HgNHX1基因啟動子的活性，將HgNHX1啟動子構建到pBI121載體，替換掉CaMV35s 啟動子，與報告基因 GUS 融合。對構建的pBI-HgNHX1 啟動子載體轉化大腸桿菌DH5α，在大腸桿菌內大量擴增，進行菌液PCR鑒定陽性轉化(圖4)，可知pHgNHX1已成功轉入大腸桿菌中，可進行下一步實驗。

2.4pBI-HgNHX1啟動子的農桿菌轉化及鑒定

將攜帶有pHgNHX1的大腸桿菌菌液提質粒轉化農桿菌LBA4404，在附加Rif與Kana的YEP固體培養基上進行篩選，挑取單菌落，菌液PCR 篩選陽性克隆并送出測序。測序結果與原序列一致，如圖5，表明表達載體pBI-HgNHX1啟動子已成功導入農桿菌中，可進行后續的農桿菌介導轉化煙草和擬南芥實驗。

圖2 HgNHX1啟動子上的順式作用元件分布Fig.2 Distribution of cis-elements in HgNHX1 promoter

續圖2 HgNHX1啟動子上的順式作用元件分布Continued Fig.2 Distribution of cis-elements in HgNHX1 promoter

2.5轉基因煙草的獲得

為了探索HgNHX1啟動子在煙草中的表達，利用農桿菌介導煙草葉片以獲得轉基因苗。如圖6A，將預培養兩天的煙草葉片用活化好的農桿菌菌液浸染，共培養后轉至含有Kan和Cef的分化培養基(圖6B)，進行抑菌培養及抗性篩選，由圖6C可看出，在抗性篩選過程中大多數愈傷組織逐漸發生褐化而死亡，未轉化細胞生成的芽則會發生芽白化或花葉現象，轉化后切口處能分化出綠色抗性小芽的只有少數。待抗性芽長出，將這些小芽切下移至生根培養基(圖6D)，待其進一步分化、生根，直至長成轉基因苗(圖6E)。

表2 HgNHX1基因啟動子所含元件的具體功能Table 2 Function of cis-elements including in HgNHX1 promoter

續表2 Continued Table 2

圖3 HgNHX1基因啟動子與 GUS 基因融合示意圖 Fig.3 Schematic structure of GUS gene under the control of the HgNHX1 promoter

圖4 pBI-HgNHX1啟動子載體的PCR分析Fig.4 PCR analysis of pBI-HgNHX1 vector

圖5 農桿菌菌液的PCR鑒定Fig.5 PCR detection of agrobacterium tumefaciens

1～3：載體轉化大腸桿菌菌液PCR產物PCR-amplified product；-：陰性對照Negative control；M：DL2000 marker. 1～3：農桿菌菌液PCR產物PCR-amplified product; -：陰性對照Negative control；M：DL2000 marker.

2.6HgNHX1啟動子在煙草葉片中的表達

轉基因煙草葉片及莖經X-Gluc染色和脫色后，觀察GUS組織化學染色情況。結果顯示，與對照煙草相比，轉基因煙草的葉片和莖在X-Gluc染液中均變藍(圖7)，說明該啟動子片段具有啟動子活性并可指導GUS報告基因在煙草葉片及莖中表達。

圖6 轉基因煙草植株的獲得Fig.6 Obtain the transgenic tobacco A：轉化后葉盤; B：愈傷篩選; C、D：抗性芽; E：轉基因株系。A：Leaf disc after transformation; B：Callus on selective medium; C,D：Resistance shoots； E：Transgenic plants.

圖7 轉基因煙草的 GUS 染色Fig.7 GUS staining of the transformed tobacco lines A,B:轉基因煙草葉片; C:野生型煙草葉片; D:轉基因煙草莖; E:野生煙草莖。A,B: Leaves of transgenic tobacco; C: Leaves of wild type tobacco; D: Stems of transgenic tobacco; E: Stems of wild type plants.

2.7HgNHX1啟動子在擬南芥中的表達分析

圖8 轉基因擬南芥幼苗的 GUS 染色Fig.8 GUS staining of the transformed A. thaliana seedlings lines A:轉基因擬南芥; B: 轉基因擬南芥葉片(5×)；C: 轉基因擬南芥根莖(5×)；D:野生型擬南芥； E: 野生擬南芥葉片(5×)； F: 野生擬南芥根莖(5×)。A: Transgenic A. thaliana; B: Leaves of transgenic plants (5×); C: The roots and stems of transgenic plants (5×); D: Wild type A. thaliana; E: Leaves of wild type plants (5×); F: The roots and stems of wild type plants (5×).

為了探索HgNHX1啟動子在擬南芥特異部位表達的性質，用含HgNHX1啟動子質粒的農桿菌侵染擬南芥野生型植株，將得到的T0代種子經消毒后播種于含有50 mg/L Kan的MS培養基中進行篩選。對篩選出的抗性植株的花序及不同生長階段的抗性株系進行GUS染色，分析HgNHX1啟動子引導的GUS基因在擬南芥中的表達部位。對轉基因擬南芥GUS染色分析結果可看出，擬南芥花序及不同生長時期的株系在X-Gluc染液中都變為藍色(圖8和圖9)，表明該啟動子片段可指導GUS報告基因在轉基因擬南芥各個器官中都可表達。

圖9 轉基因擬南芥的 GUS 染色Fig. 9 GUS staining of the transformed A. thaliana lines A,B:轉基因擬南芥; C:野生擬南芥; D:轉基因擬南芥花序; E:野生擬南芥花序。A,B: Transgenic A. thaliana; C: Wild type A. thaliana; D: Inflorescence of transgenic plants; E: Inflorescence of wild type plants.

3 討論

啟動子是一段RNA聚合酶特異性識別和結合的位于結構基因5′端上游區的DNA序列，是轉錄水平上基因表達調控的關鍵部位。植物基因啟動子中包含多種重要的順式作用元件，在轉錄水平上參與調控下游相應基因表達，從而使植物能夠抵御外界環境脅迫[23]。啟動子上的順式作用元件通常含有TATA-box、CAAT-box 和 GC-box 元件，其中 TATA-box 是啟動子上最具特征的序列[24]。本研究利用 Plant CARE、PLACE 等在線軟件對HgNHX1基因5′ 端上游序列進行預測和分析，發現該啟動子中具有TATA-box、CAAT-box 等核心啟動子元件，表明其具有典型啟動子的特征。

不同的啟動子都具有自己特異的調節序列，楊國棟[25]利用TAIL-PCR方法克隆得到棉花GhNHX1基因的啟動子片段。序列分析表明，該啟動子中存在與冷、干旱脅迫、鹽脅迫誘導有關的順式作用元件，包括MYB識別位點、MYC識別位點以及GT1GMSCAM4。楊云堯等[26]得到的新牧1號苜蓿(Medicagosativa)MvNHX1基因啟動子包含MYC、G-box以及TC重復區等多個水分脅迫相關作用元件，表明其可能是一個與干旱、脫水誘導有關的啟動子。大多數綠色植物都包含若干個光應答元件, 如 G-box[27]、I-box[28]、GT1 元件(或 GATA元件)[29]、Z-box[27]等，這些作用元件對光調控的轉錄激活是必需的[30]。在pHgNHX1中也含有一些光應答元件，如AE-BOX、Box I等，預示著pHgNHX1的表達調控可能會受到光信號的影響。

本研究對獲得的啟動子進行生物信息學分析發現,該啟動子具有多個與非生物逆境脅迫及植物激素誘導有關的調控元件。包括鹽誘導元件GAAAAA，傷害誘導元件TGACY，抗寒、抗凍、缺水和脫落酸誘導元件CANNTG，脫落酸誘導元件ACACNNG，脫水反應相關元件ACGTG、CNGTTR、ACGT等與逆境脅迫相關的調控元件；還包括乙烯響應元件AWTTCAAA，生長素響應順式作用元件TGTCTC，以及赤霉素響應順式元件CCTTTT、TAACAAR等與激素誘導有關的調控元件。這與文獻[25-26]中報道的NHX1基因啟動子中的功能元件具有一定的一致性，預示著HgNHX1基因啟動子可能是一個受逆境脅迫和激素誘導的啟動子。

本實驗利用農桿菌介導法轉化煙草后，對轉基因植株的葉片和莖進行GUS組織化學染色，酒精脫色后發現與對照相比，煙草葉片和莖均被染成藍色，結果表明克隆的HgNHX1啟動子序列具有啟動子活性。然后用同樣的方法侵染擬南芥，并對轉基因擬南芥花序和不同生長時期的株系進行GUS染色分析，結果發現該序列不僅能正確啟動GUS基因表達，而且在轉基因擬南芥生長的各個時期、各個器官中都可表達，說明pHgNHX1具有一定的組成型啟動子活性。下一步工作是對該啟動子序列進行系列缺失，并構建包含不同長度啟動子缺失片段的植物表達載體，導入煙草葉片和擬南芥植株進行功能驗證，并確定核心啟動子區域，通過研究該啟動子在植物耐鹽方面的功能，進一步研究HgNHX1在鹽脅迫中的作用，提高作物的耐鹽性，并對培育耐鹽作物具有重要意義。

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CloningandfunctionalanalysisofhalophyteHalogetonglomeratusHgNHX1promoter

ZOU Lan1,2**, YANG Ke1,2**, XU Xian-Liang1,2, WANG Jun-Cheng1,2, REN Pan-Rong1,2, YAO Li-Rong1,2, MENG Ya-Xiong1,2, LI Bao-Chun1,3, MA Xiao-Le1,2, WANG Hua-Jun1,2*

1.Gansu Provincial Key Lab of Aridland Crop Science, Gansu Key Lab of Crop Improvement amp; Germplasm Enhancement, Lanzhou 730070, China; 2.College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 3.College of Life Sciences and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China

In order to test the function ofpHgNHX1, the promoter sequence of theHgNHX1 gene fromHalogetonglomeratuswas cloned and a 1523 bp fragment flanking 5′-upstream ofHgNHX1 was isolated and namedpHgNHX1. The software PlantCARE and PLACE were used to predict and analyze the elements ofpHgNHX1. The results showed that besides the TATA-box and CAAT-box, a number of potential cis-elements and transcription binding motifs related to stress responses were found, including salt, dehydration, cold and wound responsive elements. Other potential cis-elements responsive to phytohormones, including auxin, abscisic acid, gibberellin and ethylene were also found in the sequence. Sequence analysis indicated that it had the general characteristics of typical promoter. In order to evaluate the activity ofpHgNHX1, we constructed pBI-pHgNHX1 expression vector and introduced it into tobacco and Arabidopsis using agrobacterium mediated transformation. The expression pattern was monitored using GUS histochemical staining. Results showed that GUS activity driven by thepHgNHX1 was detected in almost all vegetative and reproductive tissues, indicating thatpHgNHX1 has a constitutive promoter activity.

Halogetonglomeratus;HgNHX1 gene; promoter; GUS

10.11686/cyxb2017018http//cyxb.lzu.edu.cn

鄒蘭, 楊軻, 徐先良, 汪軍成, 任盼榮, 姚立蓉, 孟亞雄, 李葆春, 馬小樂, 王化俊. 鹽生草HgNHX1基因啟動子的克隆及功能驗證. 草業學報, 2017, 26(11): 57-68.

ZOU Lan, YANG Ke, XU Xian-Liang, WANG Jun-Cheng, REN Pan-Rong, YAO Li-Rong, MENG Ya-Xiong, LI Bao-Chun, MA Xiao-Le, WANG Hua-Jun. Cloning and functional analysis of halophyteHalogetonglomeratusHgNHX1 promoter. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(11): 57-68.

2017-01-18；改回日期：2017-03-14

973計劃前期研究專項(2014CB160313)，國家大麥青稞產業技術體系(CARS-05)和國家自然科學基金地區項目(31460347)資助。

鄒蘭(1992-)，女，甘肅會寧人，在讀碩士。E-mail:956805769@qq.com。楊軻(1983-)，男，甘肅蘭州人，在讀博士。Email：yk_831116@163.com。**共同第一作者These authors contributed equally to this work.

*通信作者Corresponding author. E-mail:whuajun@yahoo.com