阿魏酸酯酶對麥汁過濾性能的影響

李曉敏，蔡國林，李兵，尹花，陸健*

1(啤酒生物發酵工程國家重點實驗室，山東 青島，266100) 2(江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)

阿魏酸酯酶對麥汁過濾性能的影響

李曉敏1,2，蔡國林2，李兵2，尹花1，陸健2*

1(啤酒生物發酵工程國家重點實驗室，山東 青島，266100) 2(江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)

研究比較了過濾性能良好的Scope大麥麥芽與存在過濾問題的單二麥芽的水溶性蛋白質組差異，發現參與阿拉伯木聚糖降解的阿拉伯木聚糖呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶存在較大差異，對水溶性阿拉伯木聚糖成分分析發現，單二麥芽中具有較高含量的阿魏酸，推測阿魏酸酯酶缺失是單二麥芽過濾性能缺陷的原因之一，通過添加純化的阿魏酸酯酶，可有效提高麥汁的過濾速度，降低麥汁濁度和黏度。進一步研究發現，阿魏酸酯酶可有效去除阿拉伯木聚糖側鏈上的阿魏酸，從而使得其氧化交聯減弱，多聚阿拉伯木聚糖含量降低。

麥芽；麥汁；過濾性能；水溶性阿拉伯木聚糖；阿魏酸酯酶

江蘇是我國啤酒大麥的重要產區之一，但是由于品種及生產技術等原因，與進口啤酒大麥相比，部分江蘇啤酒大麥制成的麥芽，品質不穩定，且存在過濾困難的質量缺陷，嚴重影響了其在啤酒釀造中的大規模應用。過濾性能是麥芽品質的重要指標，對啤酒生產效率、酵母發酵性能、成品啤酒非生物穩定性等都有重要影響[1]。在糖化過程中，由于大分子物質如淀粉、蛋白質、纖維素、半纖維素等相關水解酶類的缺乏，或其抑制因子的存在，使其不完全降解并相互作用、結合，充斥在麥糟中阻礙過濾，造成麥汁過濾速度慢、過濾性能差[2]。

以前的研究認為β-葡聚糖是影響麥芽過濾性能的主要因素[3-4]，而李胤通過系列研究發現，阿拉伯木聚糖(arabinoxylan, AX)也是影響大麥麥芽過濾性能的重要的非淀粉多糖，并提出了多聚阿拉伯木聚糖(poly-arabinoxylan, PAX)的概念[5]。周婷等進一步研究發現，水溶性阿拉伯木聚糖(water extractable arabinoxylan, WEAX)側鏈上的阿魏酸(ferulic acid，FA)性質比較活躍，由其介導的氧化交聯與大麥麥芽過濾性能緊密相關，是AX導致麥芽過濾性能差的重要原因之一[6]。

本項目以過濾性能差異的進口啤酒大麥麥芽Scope和江蘇啤酒大麥麥芽單二為研究對象，采用比較蛋白質組學和多糖成分分析等技術，初步確定導致過濾性能差異的降解酶系，通過添加實驗驗證并研究其初步作用機制，以期為單二大麥乃至其他品種的改良指明方向，為提高江蘇啤酒麥芽質量提供依據。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

實驗用進口啤酒大麥麥芽Scope由青島啤酒股份有限公司饋贈，江蘇啤酒大麥麥芽單二由江蘇農墾麥芽有限公司饋贈。RC-DC蛋白定量試劑盒購自Bio-rad公司；Whatman 4號濾紙購自Whatman PLC公司；辣根過氧化物酶POD購自國藥集團化學試劑有限公司；愈創木酚購自Sigma公司；牛血清白蛋白、牛血紅蛋白、酪氨酸、三氯乙酸等分析純試劑，均購自上海國藥集團化學試劑有限公司；純化的阿魏酸酯酶，由本實驗室前期研究制備[7]。

1.2儀器與設備

雙向凝膠電泳系統，GE公司； UV-2100型紫外可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司；麥芽標準粉碎機，北京德之杰啤酒技術有限責任公司；自動糖化器，西安輕機所光電公司；WGZ-2-PJ濁度計，上海昕瑞儀器儀表有限公司；Haake落球式黏度計，Thermo公司。

1.3麥芽比較蛋白質組分析

參照金昭的方法[1]。分別提取Scope及單二麥芽的水溶性蛋白，并通過雙向電泳分離，PDQuest圖像分析，最后利用質譜鑒定差異蛋白點。

1.4WEAX提取及主要成分分析

參照周婷的方法。分別提取Scope和單二麥芽中的WEAX[6]，采用凱氏定氮法測定蛋白質含量[8]，采用苯酚-硫酸法測定總糖含量[9]，采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(HPAEC-PAD)分析單糖組成[10]，采用HPLC方法測定其FA[11]。

1.5協定糖化及指標測定

協定糖化工藝和過濾性能的測定主要參照輕工行業標準《啤酒麥芽》[12]。在單二麥芽糖化起始階段添加不同濃度的BPZ7(0、200、400 U/g麥芽)、POD(0、200、400、600 mg/g麥芽)及二者混合物，糖化結束后，測定麥芽過濾性能及相關指標。

協定糖化麥汁測定的指標主要包括：過濾速度、濁度和黏度，參考輕工行業標準《啤酒麥芽》[12]，過濾速度以起始100 mL回流之后30 min內過濾出的麥汁體積計算；濁度采用EBC濁度儀測定；黏度采用Haake落球式黏度儀測定。

1.6阿魏酸酯酶的酶活測定

參照李兵的方法。以阿魏酸甲酯為底物，配置標準酶反應體系，50 ℃反應10 min后加入冰乙酸終止，并利用高效液相色譜法測定重組阿魏酸酯酶所產生的FA的含量，該反應條件下，每分鐘降解阿魏酸甲酯生成1 μmol FA所需的阿魏酸酯酶的酶量定義為1個酶活力單位(U)[7]。

2 結果與討論

2.1基于蛋白質組學分析的水解酶差異

對過濾速度差異明顯的Scope和單二麥芽分別提取水溶蛋白，并進行雙向電泳，得到雙向電泳圖譜。經PDQuest 8.0 軟件分析，對僅存在于Scope麥芽圖譜中的蛋白點，以及其含量高于單二麥芽圖譜中的蛋白點進行了膠內酶解、質譜鑒定及數據庫檢索，發現有14個差異的水解酶類(表1)。其中，阿拉伯呋喃糖苷酶(點1, 2, 3)和阿魏酸酯酶(點17)這兩種阿拉伯木聚糖降解酶是兩種過濾性能差異明顯麥芽的主要差異蛋白。高飛在比較過濾性能差異的Metcalfe和單二麥芽時也發現，阿拉伯呋喃糖苷酶是其中定量差異較顯著的水解酶[13]。這些研究表明，單二麥芽過濾速度較慢可能和阿拉伯木聚糖的降解有關。

表1 Scope麥芽中含量高于單二麥芽中的水解酶類

2.2麥芽中WEAX的主要成分分析

將過濾性能差異明顯的進口優質啤酒大麥麥芽Scope和單二分別提取 WEAX，對提取的WEAX進行化學成分分析，結果如表2所示。

表2 大麥麥芽中WEAX的主要成分分析

從表2可知，Scope和單二麥芽提取的WEAX中，總糖含量達到91%以上，其中阿拉伯糖和木糖的比例達到了88.0%，僅含有少量的葡萄糖，可能來源于未分離的水溶性β-葡聚糖和糊精。A/X(阿拉伯糖和木糖的比值)是評價AX結構特點的一個重要指標[14]，也是影響WEAX功能的重要因素。由表2可以看出Scope和單二的A/X分別為0.62和0.69，說明單二麥芽的WEAX具有更多的側鏈分支。FA是WEAX分子間交聯的橋梁，對交聯反應起到重要的作用[11]，單二麥芽的WEAX的FA含量也明顯高于Scope麥芽的WEAX。結合單二麥芽和Scope麥芽水解酶差異最顯著的是阿魏酸酯酶，推測單二麥芽阿魏酸酯酶缺陷導致過濾速度較慢。

2.3麥芽中WEAX對過濾性能的影響

將提取的大麥麥芽WEAX分為兩部分進行協定糖化麥汁添加實驗，一部分通過添加H2O2/POD體系處理使WEAX氧化交聯，另一部分通過阿魏酸酯酶處理后超濾透析去除游離阿魏酸(WEAX-FA)，將兩種水溶性阿拉伯木聚糖在麥芽糖化結束后分別添加到麥汁中，分別添加3組(每組添加量為50 mg、100 mg和150 mg)，在麥汁過濾結束后測定麥汁的過濾速度，結果如圖1所示。

圖1 添加WEAX對過濾速度的影響Fig.1 Effect of added WEAX on filtration rate of wort

由圖1可知，隨著WEAX添加量的增大，麥汁的過濾速度逐漸減慢，當添加量為150 mg時麥汁的過濾速度降低了30.7%，而添加去除阿魏酸的WEAX，隨著添加量的增大，麥汁過濾速度也呈減慢趨勢，但過濾速度減慢趨勢明顯低于WEAX組，在WEAX-FA添加量為150 mg時麥汁過濾速度僅降低約5.7%。前期的研究發現，AX可以通過氧化交聯，影響過濾速度，通過對WEAX進行阿魏酸酯酶預處理，可以有效降低其氧化交聯產物對過濾速度的影響，表明阿魏酸酯酶可以有效降解WEAX側鏈上的FA，從而抑制WEAX的氧化交聯。

2.4糖化初始階段阿魏酸酯酶的添加對大麥麥芽過濾性能的影響

為驗證阿魏酸酯酶對麥芽過濾性能、濁度、黏度的影響，將純化的阿魏酸酯酶按一定量(每50 g麥芽添加阿魏酸酯酶0 U、0.104 U、0.416 U和1.040 U)加入到麥芽糖化的初始階段，結果如圖2所示。由圖2可知，當FAE添加量為1.040 U時，麥汁的過濾速度提高了14.5%，黏度降低了6.9%，而麥汁濁度增加了28%。周婷研究認為阿拉伯木聚糖側鏈上的阿魏酸氧化交聯使得麥芽過濾速度降低[6]，圖2的結果表明在糖化過程中添加FAE可能抑制水溶性阿拉伯木聚糖的氧化交聯，改善麥芽的過濾性能。

圖2 FAE對麥汁中麥芽過濾性能的影響Fig.2 Effect of FAE on the filterability of malt

2.5阿魏酸酯酶對過濾速度影響的機制研究

為驗證阿魏酸酯酶是否通過水解阿拉伯木聚糖側鏈上的阿魏酸，阻礙阿拉伯木聚糖的氧化交聯，從而提高過濾速度，比較了不同阿魏酸酯酶添加量對麥汁中阿魏酸含量的影響，結果如圖3所示。

圖3 FAE添加量對麥汁中阿魏酸的影響Fig.3 Effect of FAE addition on the content of FA in wort

從圖3可知，隨著阿魏酸酯酶添加量的增加，麥汁中阿魏酸含量逐漸增高，當添加量增加到1.04 U時，麥汁中阿魏酸含量基本不再變化，說明阿魏酸酯酶可有效水解大麥麥芽中阿拉伯木聚糖側鏈上的結合態阿魏酸，使麥汁中的游離阿魏酸含量比對照提高了近8倍。

阿魏酸酯酶的添加對阿拉伯木聚糖降解的影響結果如表3所示。在協定糖化初期，隨著阿魏酸酯酶添加量的增大，麥汁中游離FA的含量逐漸增大，協定麥汁中AX含量逐漸增高而PAX含量逐漸減小，說明阿魏酸酯酶可有效去除AX側鏈上的阿魏酸，從而使得AX的氧化交聯減弱，AX在阿拉伯木聚糖內切酶的作用下，形成中小分子的AX，從而使得PAX含量降低。周婷的研究發現，麥汁過濾性能和PAX之間呈高度正相關，PAX含量降低，過濾速度提高[6]。

3 結論

本研究以Scope和單二麥芽為研究對象，利用比較蛋白質組學技術發現在Scope麥芽中與含量更高的阿拉伯木聚糖相關的水解酶類，如阿拉伯呋喃糖苷水解酶和阿魏酸酯酶，而單二麥芽水溶性木聚糖中含有較高含量的阿魏酸，說明缺少阿魏酸酯酶可能是單二麥芽過濾性能缺陷的主要原因之一，在單二麥芽糖化階段添加純化的重組阿魏酸酯酶，可有效減少去除阿拉伯木聚糖側鏈上的阿魏酸，減少其氧化交聯，從而降低多聚阿拉伯木聚糖的含量，使得麥汁過濾速度大幅提高，麥汁濁度和黏度相應降低。

表3 FAE添加對麥汁中阿拉伯木聚糖降解的影響

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Theinfluenceofferuloylesteraseonfilterabilityofwort

LI Xiao-min1,2, CAI Guo-lin2, LI Bing2, YIN Hua2, LU Jian2*

1(State Key Laboratory of Biological Fermentation Engineering of Beer, Qingdao 266100, China) 2(National Engineering Laboratory of Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Filterability is one of the most important quality traits of malt. It is of great practical significance to resolve the problem of filterability defects of Chinese malt. The present study compared that proteomes of Scope and Dan’er malts that with distinct filterability. It was found that arabinoxylan arabinofuranohydrolase and feruloyl esterase involved in the degradation of arabinoxylan were the most different enzymes. In addition, the components analysis of WEAX from Scope and Dan’er malt revealed that WEAX from Dan’er malt contained more ferulic acid. Therefore, we proposed that lack or short of feruloyl esterase in Dan’er malt contributed majorly to its filterability defect. By adding purified recombinant feruloyl esterase in the mashing process using Dan’er malt, the filtration rate of wort was significantly raised, accompanied by the decreased turbidity and viscosity of wort. The feruloyl esterase could remove the ferulic acid in the chain of arabinoxylan effectively and therefore inhibit the formation of ferulic acid dipolymer, which led to decreased content of poly-arabinoxylan.

malt; wort; filterability; WEAX; feruloyl esterase

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014971

副教授(陸健教授為通訊作者)。

國家863計劃(2013AA102109)；啤酒生物發酵工程國家重點實驗室開放基金資助課題(K2014001)；青島創業創新領軍人才計劃項目(13-cx-15)

2017-06-24，改回日期：2017-07-37