高溫放線菌屬研究進展

馮慧軍，翟磊，程坤,于學健，姚粟

(中國食品發酵工業研究院，中國工業微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)

高溫放線菌屬研究進展

馮慧軍，翟磊，程坤,于學健，姚粟*

(中國食品發酵工業研究院，中國工業微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)

回顧了高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)的分類學地位變遷，闡述了不同分類特征對高溫放線菌屬分類變遷的影響，并簡要概述了高溫放線菌屬的分類現狀和功能性研究情況。

高溫放線菌屬；分類變遷；功能性研究

高溫放線菌屬由TSIKLINSKY于1899年首次發現[1]。該屬菌株最適生長溫度45～55 ℃，最適生長pH 7.0左右，好氧，化能異養型，革蘭氏染色陽性，可產生大量的氣生菌絲和基內菌絲，在氣生菌絲和基內菌絲上著生有單個孢子，在自然界分布廣泛，常見于霉變飼料、稻草、堆肥和白酒高溫大曲等環境[2-4]。高溫放線菌屬菌株具有一定致病性，如普通高溫放線菌(Thermoactinomycesvulgaris)可引起過敏性肺炎(Hypersensitivity pneumonities)[5]，但作為一類分布廣泛的嗜熱微生物，高溫放線菌屬可代謝產生多種耐高溫酶系，如α-淀粉酶(α-amylase)、絲氨酸蛋白酶(serine proteases)、脂肪酶(lipase)等[6]，具有重要的工業應用價值。

高溫放線菌屬的分類學地位一直受到人們關注。根據可產生菌絲體結構的形態學特征，高溫放線菌屬應歸在放線菌類群，但基于16S rDNA序列分析表明，高溫放線菌屬的系統進化更接近芽胞桿菌。被很多學者認為是介于細菌和放線菌之間的特殊類群，分類學地位一度處于混亂狀態。2002年，李文均等人對當時高溫放線菌屬的分類地位研究做了有價值的探討，指出高溫放線菌屬的分類地位應該綜合其表型、基因型及多相分類結果來確定[7]。之后，人們綜合高溫放線菌屬表型特征和基因型特征，重新確立了高溫放線菌屬的分類學地位，將其從放線菌類群劃分到芽胞桿菌類群。本文主要綜述了高溫放線菌屬的不同分類學特征對高溫放線菌屬及其所包含有效菌種分類地位變遷的影響，并簡要概述了高溫放線菌屬的最新分類情況和功能性研究情況，以期為進一步研究高溫放線菌屬菌株提供參考。

1 不同分類特征對高溫放線菌屬分類地位的影響

1.1表型分類特征對高溫放線菌屬分類地位的影響

形態學特征是早期微生物分類的主要依據。高溫放線菌屬菌株因具有與一般放線菌類似的氣生菌絲和基內菌絲結構的形態學特征，建屬之初被歸入放線菌類群。在隨后的幾十年間，依據這一形態學特征不斷發現了其他新種，分別為嗜胨高溫放線菌(Thermoactinomycespeptonophilus)(1971)、糖高溫放線菌(Thermoactinomycessacchari)(1971)、雙歧高溫放線菌(Thermoactinomycesdichotomicus)(1973)、純白高溫放線菌(Thermoactinomycescandius)(1975)、中間型高溫放線菌(Thermoactinomycesintermedius)(1980)、嗜溫高溫放線菌(Thermoactinomycesthalpophilus)(1980)、惡臭高溫放線菌(Thermoactinomycesputidus)(1989)[8]。雙歧高溫放線菌(T.dichotomicus)是1964年作為Actinobifidadichotomica首次提出，在CROSS和 GOODFELLOW 1973年出版的《放線菌分類學》書中因其產生菌絲和孢子的形態學特征，將其劃分到高溫放線菌屬[9]。

20世紀50年代末，以化學分類特征為基礎的一些新的分類學方法開始在微生物分類中應用，如細胞壁氨基酸和糖組分測定、脂質成分測定和異戊烯甲基萘醌測定等[10-11]。1982年，COLLINS等人對當時高溫放線菌屬已發表的純白高溫放線菌(T.cescandius)、雙歧高溫放線菌(T.dichotomicus)、惡臭高溫放線菌(T.putidus)、糖高溫放線菌(T.sacchari)和嗜溫高溫放線菌(T.thalpophilus)的異戊烯甲基萘醌進行分析，發現純白高溫放線菌(T.cescandius)、雙歧高溫放線菌(T.dichotomicus)和糖高溫放線菌(T.sacchari)的主要甲基萘醌為氫不飽和MK-7；惡臭高溫放線菌(T.putidus)和嗜溫高溫放線菌(T.thalpophilus)的主要甲基萘醌為氫不飽和MK-9[12]，而多數放線菌則以氫部分飽和的混合甲基萘醌為主，如馬杜拉放線菌(Actinomadura)和鏈霉菌(Streptomyces)的甲基萘醌主要以氫部分飽和MK-9(H8)和MK-9(H6)為主，放線菌(Actinomyces)的甲基萘醌主要以氫部分飽和MK-10(H4)為主[13]。

除化學分類特征與一般放線菌有差異之外，其他一些證據也表明高溫放線菌屬菌株有別于一般的放線菌。1967年，MANACHINI等人對高溫放線菌屬菌株GC組成進行研究，發現高溫放線菌屬菌株的DNA G+C含量僅為50 mol%左右，遠小于其他放線菌的60mol%～70 mol%[14]。1968年，CROSS T等人對普通高溫放線菌的胞子結構和組成進行研究，發現高溫放線菌屬菌株的胞子含有吡啶二羧酸，且具有輪廓分明的芽胞衣、芽胞殼、外膜和內膜結構，與芽胞桿菌和梭菌的芽胞組成及結構類似[15]。上述結果使人們對僅根據形態特征確定的高溫放線菌屬的分類地位提出質疑。

1.2分子分類特征對高溫放線菌屬分類地位的影響

20世紀80年代，分子生物學得到快速發展，諸如DNA-DNA雜交和rDNA序列分析等技術被應用于微生物分類研究中[16]。1981年，STACKEBRANDT等人采用寡核苷酸編目(oligonucleotide sequencing)的方法首次對普通高溫放線菌P12的16S rDNA部分序列進行分析，發現高溫放線菌屬的系統發育水平更接近芽胞桿菌屬而不是鏈霉菌或其他放線菌屬[17]。1993年，PARK等人通過對普通高溫放線菌進行5S rRNA序列分析，同樣發現高溫放線菌屬的系統進化地位更接近芽胞桿菌屬[18]。

2000年，YOON等人利用16S rDNA序列分析和DNA-DNA雜交等方法對當時高溫放線菌屬已發表的8個有效種和部分無效種進行系統發育分析(圖1)，發現高溫放線菌屬與芽胞桿菌屬的親緣關系最近，并結合高溫放線菌屬的甲基萘醌類型、DNA G+C含量和胞子結構成分等特征提議將高溫放線菌屬放入芽胞桿菌科中[19]。同時發現，純白高溫放線菌(T.cescandius)與普通高溫放線菌(T.vulgaris)具有相同的16S rDNA序列，且DNA-DNA雜交率高達92.8%，嗜溫高溫放線菌(T.thalpophilus)與糖高溫放線菌(T.sacchari)具有相同的16S rDNA序列，DNA-DNA雜交率高達85.6%，因此認為純白高溫放線菌(T.cescandius)是普通高溫放線菌(T.vulgaris)的同物異名，嗜溫高溫放線(T.thalpophilus)菌是糖高溫放線菌(T.sacchari)的同物異名，遂將該屬內的8個有效種修正到6個[20]。

圖1 基于16S rDNA序列構建的高溫放線菌屬各典型種及相關分類單元之間的系統發育樹[19]Fig.1 Phylogenetic tree of the genus Thermoactinomyces and related taxon based on 16S rDNA gene sequences

2005年，YOON等人依據16S rDNA系統發育分析結果，并結合形態分類特征和包括甲基萘醌組成和脂肪酸組成的化學分類特征，對高溫放線菌屬的6個有效種進行重新劃分[21]。其中，雙歧高溫放線菌(T. dichotomicus)的16S rDNA序列與高溫放線菌屬其他種的相似性相對較低，僅為90.1%～94.2%，在16S rDNA系統發育樹上聚在獨立于其他5個種的分支上，氣生菌絲顏色顯著不同于其他5個種，細胞的兩個脂肪酸(iso-C16:0和iso-C17:0)在含量上也不同于其他5個種，因此被劃分到黃色高溫菌屬(Thermoflavimicrobium)，改名為雙歧黃色高溫菌(Thermoflavimicrobiumdichotomicus)。嗜胨高溫放線菌(T.peptonophilus)的16S rDNA序列與其他種的序列相似性也相對較低，分別為90.1%～91.6%，在16S rDNA系統發育樹上位于1個獨立的分支上，其最適生長溫度為35℃，與其他5個種嗜高溫的特征明顯不同，甲基萘醌種類也與其余5個種存在差異，因此被劃分到清野氏菌屬(Seinonella)，改名為嗜胨清野氏菌(Seinonellapeptonophilus)。糖高溫放線菌(T.sacchari)和惡臭高溫放線菌(T.putidus)在16S rDNA系統發育樹上聚在同1個分支上，細胞中主要甲基萘醌為MK-9，與其余4個種存在顯著差別，因此被劃分到萊斯氏屬(Laceyella)，分別改名為糖萊斯氏菌(Laceyellasacchari)和惡臭萊斯氏菌(Laceyellaputidus)。至此，高溫放線菌屬被分成4個屬，即高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)、萊斯氏屬(Laceyella)、清野氏菌屬(Seinonella)、黃色高溫菌屬(Thermoflavimicrobium)。而高溫放線菌屬所包含的有效種僅剩下普通高溫放線菌(T.vulgaris)和中間型高溫放線菌(T.intermedius)2個種。

2006年，MATSUO等人對高溫放線菌屬及其近緣菌屬-萊斯氏屬(Laceyella)、黃色高溫菌屬(Thermoflavimicrobium)、清野氏菌屬(Seinonella)、直絲菌屬(Planifilum)、海湖放線菌屬(Mechercharimyces)的16S rDNA序列進行系統發育分析，發現這6個屬在系統發育樹上聚在獨立于芽胞桿菌科的同一個分支上，并且這6個屬菌株在形態學、生理生化特征上具有一定的相似性，從而提出高溫放線菌科(Thermoactinomycetaceae)的概念，并將這6個屬歸入到高溫放線菌科中，這一觀點目前得到大多數研究者認同[22-23]。

2 高溫放線菌屬分類現狀

近幾年，一些新的高溫放線屬新種相繼被發現，2014年，YAO S等人[24]在芝麻香型白酒高溫大曲中發現一株新種，命名為大曲高溫放線菌(Thermoactinomycesdaqus)；2015年，WU H等人[25]在蘑菇堆肥中發現一株新種，命名為廣西高溫放線菌(Thermoactinomycesguangxiensis)。這2株高溫放線菌新種均由我國科研人員發現，說明我國遼闊的地域是高溫放線菌屬新種資源挖掘的巨大寶庫。

目前，高溫放線菌屬的分類地位被歸在厚壁菌門(Firmicutes)，芽胞桿菌綱(Bacilli)，芽胞桿菌目(Bacillales)，高溫放線菌科(Thermoactinomycetaceae)下[26]。包括的有效菌種為普通高溫放線菌(T.vulgaris)、中間型高溫放線菌(T.intermedius)、大曲高溫放線菌(T.daqus)和廣西高溫放線菌(T.guangxiensis)。

3 高溫放線菌屬菌種功能性研究

由于高溫放線菌屬菌株分布廣、耐高溫，具有潛在的、重要應用價值，其功能性研究一直受到人們的重視。關于高溫放線菌屬菌種的功能性研究主要集中在產酶和產其他活性物質這兩方面。

3.1產酶研究

Akemi等人報道了普通高溫放線菌R-47可產生2種類型的具有耐高溫性質的α-淀粉酶，TVAI和TVAII[27]。TVAI是一種胞外淀粉酶，作用底物主要是大分子的淀粉和普魯蘭糖，同時可以水解γ-環糊精，但不能水解α和β環糊精。TVAII是一種胞內淀粉酶，可以有效水解低聚麥芽糊精，如α和β環糊精。由于一般的α淀粉酶不能水解普魯蘭糖和環糊精，因此普通高溫放線菌產生的這兩種α-淀粉酶在淀粉深加工行業上有重要的應用前景。Kleine等人研究發現普通高溫放線菌可產生絲氨酸蛋白酶，除具有耐高溫性質外，其利用的底物也較廣，不僅能夠降解可溶性蛋白，還能夠降解一些不溶性蛋白，如彈性蛋白和膠原蛋白等[28]。WANG L等人在高溫放線菌CDF中分離到一種具有較強的角蛋白水解活性的胞外絲氨酸蛋白酶，該酶對高溫、堿、變性劑均具有較強耐受能力，且與商品化的洗滌劑兼容性好，在制革、羽毛廢棄物處理、食品加工及洗滌添加劑等方面具有重要的應用前景[29]。KE等人研究了具有分解脂肪作用的普通高溫放線菌菌株A31在高溫堆肥中的應用，發現普通高溫放線菌可產生較高的脫氫酶、多酚氧化酶和脲酶，會明顯降低食物殘渣中粗脂肪的含量，縮短堆肥的生產時間[30]。中間型高溫放線菌生產的苯丙氨酸脫氫酶具有良好耐熱性，在70 ℃處理1 h后仍然具有100%的活力，所生產的亮氨酸脫氫酶不僅具有很好的耐熱性，還具有良好的光穩定特性，這使該菌產生的此酶更加適合于工業生產[31-32]。

3.2產其他活性物質

高溫放線菌屬菌株除了產酶豐富外，還發現具有產生物活性物質的功能，如普通高溫放線菌可以產生高生物活性的吲哚乙酸(IAA)，IAA可以促進植物根際生長，目前已有將IAA產生菌應用于農作物小麥和珍珠栗種植中，發現其可促進農作物的生長[33]，這充分說明高溫放線菌屬菌株在促進農作物生長上也具有應用潛能。

3.3研究潛力評估

受分類學地位變遷的影響，高溫放線菌屬所包含有效菌種發生了很大的變化，關于高溫放線菌屬菌株的功能性研究主要集中在普通高溫放線菌和中間型高溫放線菌，且主要以產酶研究為主。而對于其他菌種，由于發現時間較短，對其功能性評價還處于起步階段。值得注意的是，眾多研究報道了高溫放線菌屬是高溫大曲中的一類優勢菌屬[34-35]，但關于其功能性鮮有報道，鑒于高溫放線菌屬菌種可以產生多種酶類，推測其在白酒釀造方面也具有潛在應用價值。

4 結語

高溫放線菌屬分類地位的確定歷經了一個漫長的過程，由早期的依據形態學和生理學特征分類為主，到后來的依據細胞化學成分分類，再到20世紀80年代興起的基于DNA擴增技術的分子分類和遺傳學分析，直到現在的多相分類技術，分類方法日趨完善和精確。另外，在基因組學信息快速發展的今天，有效結合基因組信息來完善已有分類學方法也是分類學發展的一個趨勢。目前，高溫放線菌屬中的大曲高溫放線菌H-18(GeneBank 登錄號JPST00000000)和普通高溫放線菌 NRRL F5595(GeneBank 登錄號LGKI00000000)已有基因組測序數據[36-37]，對這些數據進行深入研究將有助于挖掘高溫放線菌屬的潛在應用價值及揭示其進化規律。

高溫放線菌屬從其建立至今已有100多年的歷史，但到目前為止，相對于其他微生物而言，該類群發現的菌株還非常有限，新菌種資源挖掘潛力巨大。因此，開發有效的分離方法以及在已有菌種的基礎上對所分離菌種進行快速鑒定都是挖掘新種資源的有效途徑。同時，由于高溫放線菌屬菌株分布廣，嗜高溫，可產生多種耐熱酶系，在工業及食品行業領域都具有重要的應用價值，對其功能性的進一步解析和開發也是其研究的一個重點。

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TheresearchadvanceofgenusThermoactinomyces

FENG Hui-jun, ZHAI Lei, CHENG Kun, YU xue-jian, YAO Su*

(China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, China Center of Industrial Culture Collection, Beijing 100015,China)

The change of taxonomic status ofThermoactinomyceswas reviewed herein. The effects of different taxonomic characteristics on the classification ofThermoactinomyceswere summarized. Classification status and functional research ofThermoactinomyceswere also briefly summarized.

Thermoactinomyces; change of taxonomic status; functional research

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015314

碩士研究生(姚粟教授級高級工程師為通訊作者，E-mail：milly@china-cicc.org)。

國家重點研發計劃資助 (2016YFD0400502)

2017-07-26，改回日期：2017-08-20