發表文獻中小鼠安死術方法的分析研究(2015—2016)

岳東旭，池宏偉，鹿雙雙，王昕肪，孫德明，劉曉宇*，盧選成*

(1.中國疾病預防控制中心，北京 102206； 2.國家衛生計生委科學技術研究所，北京 100081)

發表文獻中小鼠安死術方法的分析研究(2015—2016)

岳東旭1，池宏偉1，鹿雙雙1，王昕肪1，孫德明2，劉曉宇1*，盧選成1*

(1.中國疾病預防控制中心，北京 102206； 2.國家衛生計生委科學技術研究所，北京 100081)

目的了解國內小鼠處死方法使用的情況，為實驗動物管理部門掌握“安死術”在國內執行情況、制定政策提供參考和依據。方法萬方數據庫中檢索2015年至2016年間正文中含有檢索詞“小鼠”和“處死”的文獻，對符合納入條件的文章進行統計分析。結果890篇文獻符合納入標準，其中明確提出小鼠處死方法的有351篇，僅占39.44%。處死方法涉及頸椎脫臼、斷頭、麻醉后放血取材、過量麻醉劑、腹主動脈放血和二氧化碳窒息六種，其中頸椎脫臼法使用率最高，占75.78%。結論目前小鼠“安死術”實施狀況不容樂觀，且小鼠處死方法在論文撰寫中被忽視，且其描述存在不規范現象。促進“安死術”相關法規標準的切實執行，還需加強相關技術的研究和人員的培訓。

小鼠；安死術；麻醉

隨著社會文明的進步和實驗動物科學的發展，實驗動物安樂死問題受到越來越廣泛的關注。安樂死(euthanasia)詞源于古希臘語，eu意思是好的，thanatos意思是死亡，是指公眾認可的、以人道主義的方法處死實驗動物的過程，即采用一種降低或消除痛苦和焦慮的方法來結束單個動物的生命，好的死亡相當于仁慈地結束動物生命。

我國現有法規標準將“安樂死”稱為“安死術”，2006年，科技部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》中就提出處死動物需使用安死術[1]。《實驗動物機構質量和能力的通用要求》(GB/T 27416-2014)對安死術提出具體要求[2]。我國孫嘉康等2007年做過調查，90.0%受調查人認為有必要對實驗動物實施安樂死，但僅有不到8%的人熟知安死術技術，一些國際上禁止的方法也被誤認為是安死術[3]。鑒于法規標準要求與實際工作，實驗人員主觀上的意愿與客觀上的技能之間的差距，本研究期望通過對2015—2016年萬方數據庫收錄的文獻做一研究，了解目前我國動物實驗實際開展過程中小鼠處死常用方法，掌握“安死術”執行狀況。

1 方法

在萬方數據庫中，以“小鼠”和“處死”為檢索詞，檢索2015年至2016年間正文中含有檢索詞的文獻。按照納入條件，篩選符合要求的文獻。納入條件為：論文涉及的研究開展了小鼠實驗，并對小鼠進行了處死操作。本研究針對小鼠處死方法、處死時是否麻醉等內容對納入文獻進行了整理，并對處死方法和麻醉情況做了進一步統計分析，統計分析采用Excel 2013軟件。

2 結果

2.1檢索結果

按照方法中描述的檢索策略，檢索到1044篇文獻，其中154篇未獲得全文，符合納入標準的文獻為890篇。

2.2處死方法

890篇文獻中有353篇提到小鼠處死方法，其中2篇文獻對處死方法描述不準確無法辨別處死的方法，分別為“氣管窒息法處死”和“窒息法處死”。

明確寫出處死方法的文獻有351篇，占所有文獻的39.44%(351/890)，涉及頸椎脫臼、斷頭、麻醉下放血取材、過量麻醉劑、腹主動脈放血和二氧化碳窒息共六種方法(見表1)。其中使用比例最高的是頸椎脫臼處死，占75.78%。文中描述頸椎脫臼處死方法的術語有背椎脫臼、背椎斷裂法、斷脊髓處死、斷椎法處死、引頸處死和脫頸活殺。

采用過量麻醉劑方法的占4.27%，提到所用麻醉劑的僅有8篇，占53.33%(8/15)，使用的麻醉劑有戊巴比妥鈉(3篇)、乙醚(2篇)、苯巴比妥鈉(1篇)、三溴乙醇(1篇)和水合氯醛(1篇)。

2.3處死時麻醉方法的使用

斷頭處死使用麻醉的有6篇，占斷頭處死的15%(6/40)，用的麻醉劑有乙醚、水合氯醛和戊巴比妥鈉。腹主動脈放血處死使用麻醉的有1篇，占33.33%(1/3)，使用的麻醉劑為氯胺酮和賽拉嗪混合劑。頸椎脫臼法使用麻醉的有14篇，占5.26%(14/266)，使用的麻醉劑有乙醚、鹽酸氯胺酮、戊巴比妥鈉和水合氯醛。

3 討論

實驗動物福利是實驗動物科學的重要組成部分，實施安樂死是實驗動物福利的重要內容之一。如前所述，我國也已對實驗動物安樂死提出明確要求。本研究結果顯示，實驗動物安樂死在實施層面還存在欠缺，現就調查中發現的問題進行討論并提出相應建議。

表1 小鼠處死方法統計

3.1安死術在論文撰寫和發表層面被忽視

本研究納入的890篇文獻中僅有2篇文章提到“安死術”和“安樂死”，占0.22%(2/890)；僅有39.44%的文章明確提到小鼠處死方法。提到處死方法的文獻對小鼠處死方法的描述也不夠嚴謹，如窒息法處死、引頸處死、脫頸活殺等。麻醉劑種類對過量麻醉處死小鼠技術是核心內容，但提到麻醉劑種類的只占53.33%。作者認為各學術雜志應通過加強論文發表環節福利倫理要求，以規范動物實驗論文撰寫，進而促進我國科學安樂死在實際工作的實施。

3.2頸椎脫臼和斷頭是使用率較高的兩種方法

這兩種方法都屬于物理方法，當有動物體重限制并且由有經驗和操作熟練的人實施時使用物理方法是人道的[4]。歐盟指令2010/63/EU提出，在無其他方法的前提下可接受斷頭處死嚙齒類動物[5]。美國獸醫協會(American Veterinary Medical Association,AVMA)指南指出“頸椎脫臼和斷頭”一定條件下對大鼠(體重< 200 g)和小鼠是可以接受的。所指條件集中在操作層面，包括(1)人員需經過培訓；(2)由技術熟練和過關的人員實施；(3)相關設備(主要針對斷頭法)必須合適[6]。英國《動物法案》要求頸椎脫臼處死前，需進行鎮靜或麻醉[7]。頸椎脫臼法的缺點為不是每次操作都會使動物迅速死亡，有時動物會恢復呼吸/意識，還存在意識和感覺，而這正是動物痛苦的根源。Carbone等的研究，使用三種造成頸椎脫臼的方法即(1)操作者一手固定尾部，另一手按住動物頸部做扭轉動作；(2)用止血鉗輔助；(3)胸椎部脫臼(實施頸椎脫臼時可能發生這種意外情況)，結果顯示成功率最高的第一種方法，尚有10%(2/22)的動物在實施頸椎脫臼后持續呼吸180 s以上[8]。綜上所述，頸椎脫臼方法處死小鼠是可以的，但操作者技能必須合格，實施后必須確認動物的死亡。

3.3使用過量麻醉劑進行安樂死

調查中使用較多的戊巴比妥鈉和苯巴比妥鈉屬于巴比妥類藥物。該類藥物抑制呼吸中樞，過量深度麻醉可導致窒息并伴有心臟驟停，能使動物安靜死去，產生的不適感輕。腹腔注射戊巴比妥鈉會因腹膜刺激反應而引起疼痛，故由技術熟練的人員靜脈注射效果該類藥物效果最好。三溴乙醇屬于醇類物質，通過抑制神經系統和呼吸系統引起麻醉和缺氧，最終導致死亡。三溴乙醇可用于小鼠安樂死，但如用于更大動物安樂死，所需用量過大、不易實現。水合氯醛通過抑制呼吸中樞進而血氧不足而引起死亡，動物會伴有喘息、肌肉痙攣并發出聲音。因其不良反應嚴重，美國AVMA不推薦用于安樂死藥物。乙醚具有刺激性、易燃易爆的特性，也不推薦用于安樂死。使用該方法安樂死時需強調的是：針對不同物種，選用合適的麻醉劑、劑量濃度和給藥途徑。

3.4動物實驗中存在動物麻醉后進行解剖取材的情況，動物由于失去組織、臟器或大量失血而死亡

實驗期間需密切觀察動物反應，確保動物在手術中瀕死期免遭痛苦：(1)確保動物進入深度麻醉后再進行操作；(2)操作者技術標準熟練；(3)手術前制定麻醉方案，避免術中動物遭受更多的痛苦；(4)觀察動物的狀態，避免動物有知覺時進行手術。

3.5二氧化碳窒息法

盡管此次調查僅有2篇文章使用該方法處死小鼠，但鑒于二氧化碳窒息法處死動物的效率高，操作者的心理負擔較小，近年來有大量介紹和推薦使用二氧化碳窒息法的文章，現實中二氧化碳窒息法的使用也有擴大的趨勢。但新研究表明，嚙齒類動物對二氧化碳有明顯的厭惡感，高于一定濃度的二氧化碳會造成動物的疼痛[6]。國際實驗動物福利權威組織也認同這一看法，故要求執行二氧化碳窒息法，須嚴格控制氣體濃度升高的速率。AVMA要求二氧化碳置換率為每分鐘10%～30%容器體積[6]，以保證在引起疼痛之前，動物已失去意識。而目前市面部分二氧化碳窒息機不能精確控制進氣量，一些自制儀器也存在這一問題。故作者建議，應嚴格選用可控制氣體流速的二氧化碳窒息設備實施安樂死，條件不滿足時不應使用。

3.6實驗動物安死術對實驗人員心理健康的影響

對實驗動物實施科學而嚴謹的安樂死，也是對實驗人員的一種保護，特別是心理上的。當某些工作人員要較高頻率地處死動物或作為旁觀人員面臨處死動物的場景時，經常會產生消極、厭惡情緒，影響心理健康。而當采用認可的安樂死方法處死動物時，能顯著降低這種消極、負面的心理影響。

3.7小結

綜上所述，簡單評價某種處死方法是否為安死術是困難的，也是不科學的。選擇適合的安死術需從動物種類、動物遭受的疼痛和痛苦、人員安全性、成功率、藥物獲得方式、對操作者情緒影響等多方面考慮。實際工作中，選擇適合的安死術還需由獸醫結合現實情況從專業角度做出判斷[9]。選定方法后，由掌握技術要點、操作熟練的人員實施安死術也至關重要[10]，包括動物的抓取與保定、靜脈穿刺、麻醉劑劑量以及二氧化碳流速、安樂死箱的用法等。故全面提高我國實驗動物福利，真正仁慈地結束實驗動物的生命，制定政策法規僅為第一步，還需要加強相關技術的研究和培訓，讓實驗人員切實掌握安死術。

[1] 國科發財字 [2006] 398號, 關于善待實驗動物的指導性意見.

[2] 中華人民共和國國家標準.實驗動物機構 質量和能力的通用要求[S].GB/T 27416.2-2014.

[3] 孫嘉康, 錢鑫, 慎慧, 等. 淺談我國實驗動物安樂死的實施 [G]. 第六屆生命科學研究與實驗動物替代法國際大會(北京衛星會議)暨第三屆北京實驗動物科學國際論壇論文匯編. 北京: 中國實驗動物學會, 2008: 12-15.

[4] Hawkins P, Prescott MJ, Carbone L, et al. A good death? Report of the Second Newcastle Meeting on Laboratory Animal Euthanasia[J]. Animals (Basel), 2016, 6(9): 50-78.

[5] European Commission. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the Protection of Animals Used for Scientific Purposes. Available online: http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:en:PDF (accessed on December 2015).

[6] AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. American Veterinary Medical Association: 26.

[7] Animals (Scientific Procedures) Act 1986 Amendment Regulations. 2012.

[8] Carbone L, Carbone ET, Yi EM, et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice [J]. J Am Assoc Lab Anim Sci, 2012, 51(3): 352-356.

[9] 劉云波. 實驗動物安樂死若干問題 [J]. 中國比較醫學雜志, 2008, 18(2): 76-78.

[10] 朱玉峰, 王元占, 楊培梁, 等. 淺談實驗動物安樂死 [J]. 中國醫學倫理學, 2011, 24(2): 260-261, 264.

AnalysisofcurrentstatusofmouseeuthanasiamethodsbasedonthepublicationsinChina(2015-2016)

YUE Dong-xu1， CHI Hong-wei1， LU Shuang-shuang1， WANG Xin-fang1， SUN De-ming2， LIU Xiao-yu1 *， LU Xuan-cheng1 *

(1.Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China；2.Institute of Science and Technology, National Health and Family Planning Commission of P. R. C, Beijing 100081)

ObjectiveTo investigate the current status of mouse euthanasia methods in China, and to provide the reference and basis for the administrative authorities of laboratory animal management to master the implementation of “euthanasia” and formulate related policies.MethodsResearch papers containing the terms of “mouse” and “execution” in Chinese characters during the period from 2015 to 2016 were searched in Wanfang database, and statistical analysis was performed with the articles meeting the searching criteria.ResultsA total of 890 research articles met the searching criteria, of which 351 articles clearly described the killing method, accounting for only 39.44%. The mouse-killing methods included cervical dislocation, decapitation, exsanguination and sampling after anesthesia, excessive anesthesia, abdominal aorta bleeding and carbon dioxide asphyxiation, among them cervical dislocation accounted for the highest rate, 75.78%.ConclusionsThe current implementation of mouse euthanasia methods in our country has been far from optimistic. The mouse euthanasis methods have often been ignored in scientific articles and the description of the methods is not standardized. In order to promote the effective implementation of the regulations related to mouse euthanasia, it is needed to promote the study of related techniques and to strengthen personnel training.

Mice; Euthanasia; Anesthesia

中國疾病預防控制中心青年科研基金(編號：2016A106)。

岳東旭(1988 -)，女，研究方向：實驗動物科學。E-mail: yuedx@chinacdc.cn

劉曉宇(1979 -)，女，副研究員，研究方向：實驗動物科學，E-mail: liuxyl@chinacdc.cn；盧選成(1977 -)，男，副研究員，研究方向：生物安全，實驗動物科學，E-mail: luxch@chinacdc.cn * 共同通訊

R-33

A

1671-7856(2017) 11-0091-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.11.019

2017-04-26